Nrf2及其信號通路在膿毒癥相關(guān)臟器損傷中的研究進展

張曉慧， 郭 娜， 寧?；?， 邢博民， 馬玉清

膿毒癥是一種由感染反應(yīng)失調(diào)引發(fā)的威脅生命的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，具有高發(fā)病率、高病死率的特點[1]。目前關(guān)于膿毒癥的病理生理和損傷機制尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激一直被認為在其中起著關(guān)鍵作用[2]。核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2(nuclear transcription factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通過調(diào)節(jié)細胞的抗氧化防御系統(tǒng)，在膿毒癥的治療中起著重要作用[3]。本文就Nrf2相關(guān)信號通路及其在膿毒癥器官損傷中的研究進展進行綜述，以期為臨床治療膿毒癥提供新的治療策略。

1 Nrf2結(jié)構(gòu)

Nrf2是CNC(cap′-n′-collar)家族成員最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，含有605個氨基酸殘基，形成了從Neh1到Neh7的7個結(jié)構(gòu)域。Neh1含有一個高度保守的亮氨酸拉鏈式結(jié)構(gòu)(bZIP)，負責與小Maf蛋白(small Maf protein)結(jié)合形成異二聚體，進而識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response elements, ARE)[4]。Neh2是主要的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)區(qū)，含有DLG和ETGE兩個基因序列，對Nrf2和Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1 (kelch-like ECH-associated protein l, Keap1)之間的相互作用、Nrf2的穩(wěn)定性及Nrf2泛素化至關(guān)重要[5]。Neh3位于C末端，通過與Nrf2轉(zhuǎn)錄輔助激活子染色質(zhì)解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6(CHD6)結(jié)合，反式激活ARE依賴基因的表達[6]。Neh4和Neh5是轉(zhuǎn)錄激活(TA)域，當Nrf2進入細胞核與小Maf蛋白形成二聚體，并與ARE結(jié)合，此時轉(zhuǎn)錄不能立即啟動，還需要Neh4、Neh5與環(huán)狀單磷酸腺苷(CAMP)反應(yīng)原件結(jié)合，協(xié)同啟動轉(zhuǎn)錄過程[7]。Neh6是一段富含氨基酸的不依賴Keap1的Nrf2降解區(qū)域，負向調(diào)控Nrf2[8]。Neh7是近幾年新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，可通過與視黃醇X受體(RXRa)相互作用抑制Nrf2的激活[9]。Neh1-Neh7所具有的結(jié)構(gòu)多樣性的特點，是調(diào)控下游靶基因的表達，抵御氧化應(yīng)激，減輕膿毒癥的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Nrf2被認為是CNC家族中最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

2 Nrf2相關(guān)信號通路

2.1Keap1/Nrf2/ARE通路 Keap1是分子質(zhì)量為69ku的多肽，具有五個結(jié)構(gòu)域，分別是N末端的NTR區(qū)、BTB區(qū)、DGR區(qū)、連接片段IVR區(qū)和C末端的CTR區(qū)，其中BTB、DGR、IVR為三個主要功能區(qū)[10]。BTB區(qū)含有半胱氨酸(Cys)151，可與Cul3的泛素E3連接酶復合體相互作用促進Nrf2泛素化[11]。DGR區(qū)含有六個重復的Kelch序列，可以特異性的結(jié)合Nrf2的N末端Neh2結(jié)構(gòu)域，并對其進行負性調(diào)節(jié)。IVR區(qū)中富含大量半胱氨酸，是氧化劑和親電試劑發(fā)生反應(yīng)的區(qū)域，其中Cys288和Cys297對于抑制Nrf2活性至關(guān)重要[12]。生理狀態(tài)下，胞漿中的Nrf2與其抑制因子Keap1結(jié)合，然后用Keap1把它固定在由肌動蛋白組成的細胞骨架上[13]。當發(fā)生膿毒癥時，氧化應(yīng)激隨之發(fā)生，Nrf2與細胞內(nèi)的Keap1解偶聯(lián)并在多種蛋白激酶的磷酸化作用下轉(zhuǎn)移進入細胞核，與小Maf蛋白形成異二聚體，識別并結(jié)合ARE，促進下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達，減少機體的氧化應(yīng)激損傷[14]。

2.2磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)/Nrf2通路 PI3K是最初被發(fā)現(xiàn)與癌基因產(chǎn)物密切相關(guān)的一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，在細胞存活、增殖及凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K的主要下游效應(yīng)分子。PI3K/Akt 信號通路通過抑制細胞凋亡，調(diào)控細胞周期和代謝，對膿毒癥具有一定的保護作用[16]。當機體受到氧化應(yīng)激時，PI3K被激活，可將其底物3,4二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，進而與Akt結(jié)合并轉(zhuǎn)位至胞膜，與定位于胞膜上的三磷酸磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK-1)結(jié)合，最終完全激活Akt[17]。激活的Akt可促進下游信號分子Nrf2的磷酸化[18]。

2.3沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)/Nfr2通路 Sirt1是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的Ⅲ類核組蛋白去乙?；竅19]。Sirt1是乙?；讣易逖芯孔疃唷⒆罹哂写硇缘某蓡T，相對分子質(zhì)量約為120 kDa，主要由N-末端、催化核心、別構(gòu)部位、C-末端四部分組成，其中別構(gòu)部位和催化核心構(gòu)成了Sirt1的活性中心，參與基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡及氧化應(yīng)激等多種生理功能的調(diào)節(jié)[20]。Sirt1可通過改變Keap1的構(gòu)型，引發(fā)Keap1和Nrf2解離，進而促進Nrf2的核轉(zhuǎn)位，激活某些抗氧化基因的表達[21]。

2.4促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)/Nrf2通路 MAPK可分為3個亞群，即胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、p38和c-Jun氨基酸激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)。p38是相對分子質(zhì)量約為38kD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，在機體內(nèi)廣泛表達，磷酸化p-38是其活化狀態(tài)，參與炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡等一系列生理過程[22]。ERK包括8個中亞型，其中ERK1/2是MAPK家族的重要成員[23]。ERK1/2在受到氧化應(yīng)激、缺血、缺氧等刺激時可被激活，活化的ERK可磷酸化多種核內(nèi)信號蛋白。JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase, SAPK)，由JNK1、JNK2和JNK3組成，其中JNK1和JNK2在全身各組織均有表達，JNK3僅在腦中表達[24]。ERK1/2、p38、JNK三者可協(xié)同磷酸化Nrf2，促進其與細胞質(zhì)中的Keap1解離，使Nrf2活化[25]。

2.5Nrf2/核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)通路 被激活的Nrf2可以活化NF-κB，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮保護作用。NF-κB是由p65和p60兩個亞基組成的二聚體，在體內(nèi)分布和作用十分廣泛。靜息狀態(tài)下，NF-κB異二聚體與其抑制性蛋白(inhibitor kapaa B, IκB)結(jié)合并將其固定在胞質(zhì)中。當受到炎癥因子、氧化應(yīng)激刺激時，IκB迅速被IκB激酶磷酸化，導致IκB的降解而釋放NF-κB，NF-κB進入細胞核與相應(yīng)基因結(jié)合，調(diào)控促炎細胞因子、趨化因子和黏附分子等的表達[26]。

3 Nrf2及其信號通路與膿毒癥相關(guān)臟器損傷

3.1膿毒癥急性肺損傷(ALI) 膿毒癥ALI是臨床上急危重癥患者死亡的主要病因，病死率高達35.1%～46.1%，其發(fā)病機制的復雜性決定了臨床治療的局限性。目前發(fā)現(xiàn)，炎癥、氧化應(yīng)激及自噬在膿毒癥ALI的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，Nrf2相關(guān)信號通路與ALI息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2相關(guān)通路可降低ALI造成的相關(guān)炎癥因子水平，減少肺泡和肺間質(zhì)炎癥細胞浸潤并降低髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)含量。Ni等[27]發(fā)現(xiàn)，橙花叔醇(nerolidor, NERO)干預后可明顯增強脂多糖(LPS)誘導的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、Nrf2、血紅素加氧酶1(HO-1)蛋白的表達，提示橙花叔醇通過AMPK/Nrf2/HO-1通路減輕了LPS誘導的肺部炎癥反應(yīng)。此外，活化Nrf2通路可改善與ALI相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD)水平降低，肺內(nèi)皮屏障破壞，改善膿毒癥大鼠肺組織的氧化應(yīng)激損傷。Zhao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素(0sulforaphane,SFN)通過活化Nrf2/HO-1信號通路，SOD水平增加，降低肺組織氧化應(yīng)激水平，改善肺組織損傷。研究表明，在盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘導的膿毒癥小鼠模型中，野生型小鼠(WT)給予H2治療后，相對于模型組，Nrf2的下游信號分子HO-1的表達水平下降，SOD和過氧化氫酶(CAT)表達水平明顯增高，同時MDA表達明顯降低，而敲除Nrf2后，氫氣的保護作用隨之消失，提示氫氣通過Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮膿毒癥小鼠肺損傷的保護作用，減輕膿毒癥ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，提高小鼠生存率。與此同時，Nrf2相關(guān)通路的激活還通過調(diào)控肺組織凋亡和自噬蛋白水平，改善膿毒癥相關(guān)肺損傷。Wang等[29]采用體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)青藤堿(sinomenine, SIN)藥物治療組相對于模型組，Nrf2、Keap1和HO-1表達明顯增高，SOD水平升高，MDA水平下降，同時抑凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)表達增加，自噬相關(guān)蛋白自噬相關(guān)基因-5(Atg5)和自噬效應(yīng)蛋白(Beclin1)表達降低，表明青藤堿可通過Nrf2/Keap1和自噬減輕膿毒癥ALI。

3.2膿毒癥急性腎損傷(AKI) 膿毒癥AKI是急危重癥領(lǐng)域的一種常見綜合征，在重癥醫(yī)學科發(fā)病率甚至超過50%，嚴重威脅患者的生命安全，但其確切發(fā)病機制目前尚不清楚[30]。已證實氧化應(yīng)激和炎癥在膿毒癥AKI的發(fā)病機制中具有重要作用。腎臟是ROS損傷較為敏感的器官，而研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活可增加腎組織SOD含量，降低血清肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)水平。實驗證實[31]，右美托嘧啶(DEX)可通過激活Nrf2及其下游分子HO-1，明顯增加腎臟組織中SOD的表達，改善腎臟功能，減輕膿毒癥AKI。渥曼青霉素(wortmannin)可能通過PI3K/Nrf2信號通路誘導Akt蛋白表達上調(diào)，腎臟組織Nrf2和HO-1升高，SOD含量增長[32]。此外，激活Nrf2通路還可抑制膿毒癥AKI釋放促炎癥因子，增強自噬以改善膿毒癥AKI。Xu等[33]發(fā)現(xiàn)，金槲皮素(gold-quercetin, GQ)可激活Nrf2，抑制NF-κB通路，減少炎癥反應(yīng)，減輕膿毒癥AKI。Feng等[34]建立LPS所致AKI膿毒癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)人臍帶血單核細胞(UCBMC)可能通過激活Nrf2，增加HO-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-II的表達，提高PTEN誘導假定激酶1(PINK1)、線粒體融合蛋白2(mfn2)和E3泛素連接酶(Parkin)水平，說明Nrf2可能通過增強自噬及改善線粒體損傷，保護LPS誘導的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞(HK-2)損傷。

3.3膿毒癥心肌損傷 心臟是膿毒癥常見的靶器官之一，心臟功能障礙是膿毒癥患者常見的死亡原因。近期研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2可能通過Nrf2/HO-1信號通路逆轉(zhuǎn)膿毒癥導致的心肌炎癥細胞浸潤和心肌細胞凋亡，抑制心肌損傷和心功能障礙，發(fā)揮心肌保護作用。羅曉梅等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與造模組相比，心丹參注射液(danshen injection,DSI)治療組Nrf2、HO-1、醌氧化還原酶-1(NQO1)表達增加，心肌細胞凋亡和活化半胱天冬酶(cl-caspase)-3、cl-caspase-9、Bcl-2關(guān)聯(lián)x蛋白(Bax)表達降低，進一步檢測發(fā)現(xiàn)，p-65的表達明顯降低，提示DSI可能通過Nrf2抑制NF-κB，減輕膿毒癥所致心功能障礙。程梅等[36]用SD大鼠構(gòu)建膿毒癥心肌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織Nrf2、HO-1、信使RNA(mRNA)及蛋白的表達明顯升高，這可能與機體自身代償功能相關(guān)，而與模型組相比，利多卡因(lidocaine, Lido)干預組Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達水平升高，肌紅蛋白(Myo)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表達水平明顯降低，心肌病理損傷明顯好轉(zhuǎn)。Maresin1是來源于n-3不飽和脂肪酸促炎消退介質(zhì)。Nrf2/HO-1信號通路還可下調(diào)炎癥因子水平，改善膿毒癥心肌損傷，降低膿毒癥小鼠病死率。有研究[37]表明，Maresin1處理可明顯增加Nrf2的表達，誘導HO-1表達，同時p-65、IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯下降，減輕LPS誘導的心肌損傷。

3.4膿毒癥肝損傷 膿毒癥常累及肝臟，造成急性肝損傷，是膿毒癥患者死亡的危險因素之一。膿毒癥急性肝損傷的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，多認為與氧自由基損傷、過度炎癥反應(yīng)有關(guān)[38]。實驗顯示，Nrf2通路的激活可改善膿毒癥急性肝損傷所造成的肝組織SOD、谷胱甘肽(GSH)含量下降以及肝功能障礙。肖雷等[39]通過LPS制備膿毒癥模型，檢測肝組織Nrf2和HO-1 mRNA蛋白表達升高，給予丹參川芎嗪注射液后，肝組織病理損傷減輕，GSH水平和SOD、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性明顯升高,并且谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平降低，提示丹參川芎嗪注射液可能通過Nrf2/HO-1信號通路，增強肝組織的抗氧化能力，降低LPS誘導的肝損傷。而Nrf2通路還可通過下調(diào)炎癥因子水平改善膿毒癥AKI。蘭戴天等[40]在CLP誘導的膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)，松果菊苷(echinaco-side, ECH)可能通過Nrf2通路降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β、高遷移率族蛋白1(HMGB1)的含量，增加CD4+和CD8+含量和比值，對膿毒癥肝損傷有一定保護作用。研究[41]也證實，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在LPS造模的膿毒癥損傷模型中可以下調(diào)肝組織的TNF-α、IL-6水平，降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，增加組織再生，這可能與其激活Nrf2通路有關(guān)。

3.5膿毒癥腸損傷 腸道是膿毒癥時最容易受到損害的靶器官，在膿毒癥早期即存在腸屏障受損致通透性增加，細菌、毒素入血，造成遠隔臟器損傷衰竭甚至死亡[42]。研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/HO-1信號通路可升高膿毒癥腸組織抗氧化蛋白水平，降低炎癥因子水平，發(fā)揮腸道保護作用。Yu等[43]研究證實，給予2%的H2干預后，野生型膿毒癥小鼠腸組織Nrf2、HO-1表達升高，SOD、CAT含量明顯升高，TNF-α、 IL-6、HMGB1含量下降，敲除Nrf2基因后，膿毒癥小鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)無明顯改善，腸道損傷無明顯減輕，推測H2通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路，降低野生型CLP小鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高膿毒癥小鼠存活率，說明吸入2%H2可能是治療嚴重膿毒癥所致腸道損傷的治療策略。最近的一項研究[44]表明，線粒體輔酶Q(MitoQ)可緩解氧化損傷，改善線粒體功能。Zhang等[45]研究發(fā)現(xiàn)，MitoQ預處理可通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路，降低LPS誘導炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善腸道損傷，說明氧化應(yīng)激引起的線粒體功能障礙，在膿毒癥的病程進展中具有重要作用。

3.6膿毒癥免疫系統(tǒng)損傷

在膿毒癥過程中，炎癥反應(yīng)失調(diào)造成過度抗炎反應(yīng)，免疫系統(tǒng)功能抑制，誘發(fā)機體進一步感染，造成膿毒癥不良預后[46]。在機體中，Nrf2主要集中在脾和肝等免疫器官中，研究顯示，Nrf2水平與氧化應(yīng)激及自然免疫反應(yīng)水平相關(guān)。張雷等[47]通過CLP大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1參與膿毒癥大鼠的免疫抑制，抑制肝、脾中Nrf2表達和單核細胞增殖，促進凋亡。Nrf2可調(diào)節(jié)微生物刺激的先天免疫反應(yīng)，抑制促炎細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，抑制干擾素基因刺激因子(STING)應(yīng)答[48]。Tolani等[49]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2參與抑制巨噬細胞中的信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)通路，導致膿毒癥期間的免疫抑制。Mills等[50]研究發(fā)現(xiàn)，4-辛基衣康酸(4-OI)可通過某些位點Keap1半胱氨酸殘基的烷基化來活化Nrf2，降低LPS處理的巨噬細胞中IL-1β的產(chǎn)生，表明4-OI可能通過Nrf2/Keap1信號通路下調(diào)巨噬細胞的炎癥因子水平。

大量研究證實，Nrf2信號通路對膿毒癥器官損傷具有一定保護作用，現(xiàn)將Nrf2及其相關(guān)信號通路在膿毒癥器官損傷保護作用的調(diào)控介質(zhì)、代表機制及其發(fā)揮作用的物質(zhì)進行總結(jié)。見表1。

表1 Nrf2及其相關(guān)信號通路在保護膿毒癥器官損傷的代表機制及影響

3 Nrf2信號通路在膿毒癥中的前景與展望

目前，針對膿毒癥的治療主要以控制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡，改善臟器損傷為主，而膿毒癥所造成的病死率仍居高不下。Nrf2及其相關(guān)信號通路可能參與了保護膿毒癥相關(guān)器官損傷，因此，Nrf2靶向藥物治療對膿毒癥應(yīng)用前景廣泛。研究[51]顯示，曲美他嗪(TMZ)可能通過靶向Nrf2信號通路直接促進Nrf2和趨化因子受體CXCR2 (CXCR2)啟動子區(qū)域的結(jié)合，上調(diào)CXCR2作用于中性粒細胞，減少CLP及LPS造模導致的心功能障礙。Chen等[52]研究發(fā)現(xiàn)，一種前列腺素代謝物15k-PGE2可靶向前列腺素還原酶2(PTGR2)，修飾Keap1/Nrf2信號通路，減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素激活Nrf2從細胞質(zhì)到細胞核的易位，而小干擾RNA(siRNA)敲除Nrf2可以明顯降低NQO1和HO-1的mRNA表達，表明甘草甜素靶向Nrf2基因，減輕膿毒癥所致HMGB1的分泌和肝臟損傷[53]。

綜上所述，Nrf2可通過抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用來減輕膿毒癥器官損傷。Nrf相關(guān)信號通路主要有Keap1/Nrf2/ARE通路、PI3K/Akt/Nrf2通路、Sirt1/Nfr2通路、MAPK/Nrf2通路、Nrf2/NF-κB通路等，這些通路并非獨立，往往相互交聯(lián)，共同參與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程，激活Nrf相關(guān)信號通路的機制及作用底物有待進一步研究，開發(fā)以Nrf2為作用靶點的藥物對于治療膿毒癥具有重要意義，有望為臨床治療膿毒癥提供新的干預措施。