自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化時序動態(tài)變化

趙健清,丁露,曾俊義,應國秋,文淵,聶俊剛,易達松

(1.南昌大學第一附屬醫(yī)院心血管內科,南昌 330006;2.南昌大學第一附屬醫(yī)院高血壓病研究所,南昌 330006)

高血壓是當前臨床患病率最高的心血管疾病之一,我國成人高血壓患者已達2.45億,且隨著年齡的增加患病率逐漸升高[1]。高血壓患者可出現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化、心肌細胞凋亡等病理性改變,繼而導致心室重構、心律失常和心力衰竭,其中心肌纖維化是高血壓導致心肌損傷和結構重塑的重要病理特征[2]。心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是指心肌成纖維細胞在高血壓等因素影響下出現(xiàn)過度增殖,引起Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主的細胞外基質比例失調、過度沉積和排列紊亂,從而導致心肌纖維化、心臟順應性降低、心臟功能障礙,最終引發(fā)惡性心律失常及心力衰竭的一系列病理性改變過程[3]。因此,積極探索高血壓心肌纖維化發(fā)生機制,尋找延緩甚或逆轉纖維化進展的治療方法對于高血壓防治具有重要意義。SHR是最接近人類原發(fā)性高血壓病理生理的遺傳性動物模型,是高血壓心肌纖維化研究較為理想的實驗動物。本研究以SHR為對象,通過多時點觀測4～42周SHR血壓水平、心臟結構與功能、心肌纖維化組織病理及纖維化相關基因表達的動態(tài)變化,多時點多維度呈現(xiàn)SHR心肌纖維化伴隨鼠齡及血壓改變的特征性時序動態(tài)變化,可為高血壓心肌纖維化相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4周齡SPF級雄性SHR大鼠45只,體重(62.8±5.7)g、WKY大鼠35只,體重(68.5±6.2)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2016-0006】,飼養(yǎng)于南昌大學第一附屬醫(yī)院動物實驗室【SYXK(贛)2021-0003】,隨機分籠飼養(yǎng),24 h自由飲水和進食,飼養(yǎng)至42周,分別于預設時點檢測大鼠各項指標。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～25℃。所有操作均符合南昌大學第一附屬醫(yī)院科學實驗倫理學要求(審批號:(2021)醫(yī)研倫審第(5-075))。

1.1.2 主要試劑與儀器

大小鼠智能無創(chuàng)血壓計BP-2010A(北京軟隆生物技術有限公司);Vevo 2100超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司);熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);正置熒光顯微鏡BX51(日本Olympus公司)。Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);TRNzol Universal Reagent(天根生化科技(北京)有限公司);FastQuant RT Kit(with gDNase)(天根生化科技(北京)有限公司);SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司);大鼠TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、GAPDH引物(深圳華大基因股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 鼠尾無創(chuàng)血壓監(jiān)測大鼠血壓

分別于6、8、12、18、24、32、42周測量SHR及WKY收縮壓,血壓測量釆用大小鼠智能無創(chuàng)血壓計以間接測量法(尾套法)進行,每次血壓測量時段相對固定(14:00～18:00)。間隔1 min,重復測量5次,舍去最高和最低值,取其他3個數值均數作為血壓測量值。每次血壓測量保持可重復的實驗環(huán)境,確保血壓測量數據的可對照性。

1.2.2 超聲心動圖監(jiān)測大鼠心臟結構及功能

采用超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng),分別于6、8、12、18、24、32、42周進行大鼠心臟超聲心動圖檢測。測量如下參數:舒張期室間隔厚度(interventricular septal thickness at diastole,IVST)、左心室舒張期末后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWT),左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)由超聲系統(tǒng)軟件自動測算。各參數檢測值取5個心動周期平均值。

1.2.3 大鼠左室心肌組織病理形態(tài)檢測

分別于6、8、12、18、24、32、42周進行腹腔注射麻醉,迅速剖胸取出心臟,沿房室環(huán)剪去心房及右心室游離壁,保留室間隔和左心室游離壁,測量左室質量,計算左室質量指數(left ventricular mass index,LVMI);大鼠左心室組織進行Masson染色,計算膠原容積分數(Collagen Volume Fraction,CVF)。正置顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)并拍照,采用Image J軟件進行圖片分析,高倍視野下計算出心肌組織膠原纖維面積占整個組織面積的百分比,即膠原容積分數=膠原面積/總面積,每個標本均隨機取3個視野測量,計算其均值。

1.2.4 qRT-PCR檢測大鼠心肌纖維化基因TGFβ1、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原

分別于6、8、12、18、24、32、42周獲取大鼠左心室組織,依次進行總RNA提取、cDNA合成及qPCR反應,分別按試劑說明書進行。TGF-β1:上游引物5’-GGCTACCATGCCAACTTCTG-3’,下游引物5’-CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3’;CollagenⅠ:上游引物5’-CCCTGCTGGAGAAGAAGGAA-3’,下游引物5’-AGGAGAACCTTTGGGACCAG-3’;CollagenⅢ:上游引物5’-ACTGGTGAACGTGGCTCTAA-3’,下 游 引 物5’-GGACCTGGATGTCCACTTGA-3’;GAPDH:上 游 引 物5’-CAAGTTCAACGGCACA GTCAAG-3’,下 游 引 物5’-ACATACTCAGCAC CAGCATCAC-3’。以GAPDH為內參,2-△△CT計算TGF-β1、CollagenⅠ及CollagenⅢ基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 鼠尾無創(chuàng)血壓監(jiān)測大鼠血壓

兩組間相比,6周時WKY與SHR血壓處于同一水平,8周時SHR血壓較WKY顯著升高,8周至18周SHR與WKY血壓差距持續(xù)擴大,此后隨周齡增長,SHR與WKY血壓差距持續(xù)存在(見表1)。

2.2 超聲心動圖監(jiān)測大鼠心臟結構及功能

6周時兩組大鼠IVST、LVPWT均相近;12周時SHR組IVST較WKY顯著增加,此后IVST差異在同周齡兩組大鼠間持續(xù)擴大,并于32周時達到最大,32周后兩組間IVST差異有所回落;8周時SHR組LVPWT即較WKY顯著增加,此后LVPWT差異同樣在同周齡兩組大鼠間持續(xù)擴大,于32周時達到最大,32周后兩組間LVPWT差異有所減小。LVEF在不同周齡SHR或WKY間無顯著變化,同周齡兩組大鼠間亦無明顯差異(見表2)。

2.3 大鼠心肌組織病理形態(tài)改變

除8周時兩組大鼠LVMI相接近,余同周齡SHR組LVMI均顯著高于WKY(見表3)。Masson染色顯示,相較于WKY,SHR心肌肌束間隙隨鼠齡增加不同程度增大,心肌細胞間質和血管周圍可見明顯的纖維化改變,并伴有膠原沉積(見圖1);6周時兩組大鼠CVF相近,12周SHR組CVF較WKY顯著增加,此后CVF差異在同周齡兩組大鼠間持續(xù)擴大(見表3)。

圖1 不同周齡大鼠左室心肌masson染色Figure 1 Masson staining of left ventricular myocardium in rats at different ages

周齡Age WKY血壓(mmHg)SBP of WKY(mmHg) SHR血壓(mmHg)SBP of SHR(mmHg)6周6 weeks 84.83±3.82△▽ 85.39±4.47△▽8周8 weeks 108.49±6.12#▽ 126.97±13.35*#▽12周12 weeks 133.63±10.33#△ 174.15±4.09*#△18周18 weeks 134.52±5.31#△ 184.90±5.23*#△24周24 weeks 128.40±16.43#△ 179.13±5.45*#△32周32 weeks 129.04±7.99#△ 187.32±13.46*#△42周42 weeks 115.05±8.95#▽ 184.61±5.29*#△

周齡Age 分組Groups IVST(mm) LVPWT(mm) LVEF(%)6周6 weeks WKY 1.29±0.13 1.35±0.10 81.86±2.10 SHR 1.31±0.09 1.38±0.12 80.07±2.73 8周8 weeks WKY 1.45±0.12 1.54±0.18 83.47±5.27 SHR 1.62±0.33 1.84±0.25*# 83.58±4.30 12周12 weeks WKY 1.78±0.32#△ 2.18±0.28#△ 77.58±5.62 SHR 2.14±0.15*#△ 2.35±0.24#△ 80.73±5.05 18周18 weeks WKY 2.17±0.35#△▽ 2.34±0.34#△ 79.63±4.39 SHR 2.88±0.25*#△▽ 2.95±0.14*#△▽ 78.34±3.80 24周24 weeks WKY 2.37±0.28#△▽ 2.59±0.20#△▽ 77.53±8.92 SHR 2.97±0.22*#△▽ 3.05±0.10*#△▽ 77.36±8.03 32周32 weeks WKY 2.26±0.27#△▽ 2.56±0.19#△ 81.23±3.75 SHR 3.05±0.29*#△▽ 3.19±0.52*#△▽ 82.95±4.01 42周42 weeks WKY 2.36±0.13#△▽ 2.55±0.41#△ 78.54±2.80 SHR 2.87±0.19*#△▽ 3.04±0.14*#△▽ 77.17±7.04

周齡Age 分組Groups CVF(%) LVMI(mg/g)6周6 weeks WKY 0.40±0.03 2.71±0.11 SHR 0.47±0.04 3.38±0.30*8周8 weeks WKY 0.55±0.09 2.46±0.16 SHR 0.87±0.12# 2.58±0.17#12周12 weeks WKY 0.52±0.21 2.41±0.11 SHR 1.16±0.13*#△ 2.86±0.16*#△18周18 weeks WKY 0.51±0.16 2.36±0.08 SHR 1.28±0.10*#△▽ 2.75±0.07*#△▽24周24 weeks WKY 0.61±0.14 2.48±0.07 SHR 1.71±0.17*#△▽※ 2.96±0.07*#△▽※32周32 weeks WKY 0.68±0.15 2.57±0.19 SHR 1.92±0.26*#△▽※ 3.16±0.02*△▽※42周42 weeks WKY 0.75±0.22 2.56±0.32 SHR 2.43±0.24*#△▽※ 3.25±0.13*△▽※

2.4 大鼠心肌纖維化基因TGF-β1、I型膠原、Ⅲ型膠原表達變化

6周時SHR較WKY左室心肌TGF-β1表達明顯上調,此后兩組間表達差異逐漸縮小,到32周時表達接近,隨后SHR表達再次上升,42周時SHR較WKY表達顯著上調(見圖2)。

6周至24周兩組大鼠Ⅰ型膠原表達相近,24周后SHR左室心?、裥湍z原表達明顯上升,42周時SHR較WKY表達顯著上調(見圖3)。

6周至24周兩組大鼠Ⅲ型膠原表達相近,32周時SHR較WKY表達明顯上調,至42周時表達差異進一步擴大(見圖4)。

圖4 不同周齡大鼠左室心?、笮湍z原基因動態(tài)表達Figure 4 Dynamic expression of CollagenⅢin left ventricular myocardium of rats at different ages

3 討論

高血壓心肌纖維化是一個眾多體液因子參與調節(jié)的病理過程,可引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴重并發(fā)癥,對公眾健康構成嚴重危害[4-5]。因此,積極探索高血壓心肌纖維化相關發(fā)生機制,對于預防或者逆轉心肌纖維化的發(fā)生具有重要意義。相較于遺傳性高血壓大鼠(GHR)和Dahl鹽敏感性大鼠(DSR),SHR是國際上公認的、應用最廣泛的、最接近人類原發(fā)性高血壓的動物模型。SHR模型在自然培育條件下產生高血壓以及心肌纖維化,避免了人工干預造成的創(chuàng)傷,可以作為高血壓致心肌纖維化的理想動物模型[6]。有別于既往相關研究,本研究選擇4～42周SHR為觀測對象,共設7個觀測時點,從血壓水平、心臟結構功能、心肌組織病理、纖維化相關基因表達等多個維度評估SHR心肌纖維化的動態(tài)演變,評價體系更為連續(xù)多元,可為高血壓心肌纖維化的相關研究提供堅實有益的參考。

本研究結果顯示,6～12周SHR血壓持續(xù)快速升高,之后趨于平穩(wěn)并維持高位波動,呈現(xiàn)了SHR血壓時序變化特征[7-8]。伴隨血壓升高并高位維持,心臟后負荷逐漸增大,SHR心臟出現(xiàn)時序性肥厚改變。Iliev等[9]研究發(fā)現(xiàn),伴隨SHR鼠齡增加,心肌細胞逐漸肥大,心肌纖維化增加。CVF作為一個可量化彌散性心肌纖維化指標,隨SHR鼠齡增長逐漸增加,提示SHR心肌纖維化呈鼠齡依賴性動態(tài)改變。值得關注的是,LVEF在不同周齡SHR或WKY間無顯著變化,同周齡兩組大鼠間亦無明顯差異,與陳建橋等[10]的研究一致,心肌纖維化在HFpEF患者臨床癥狀出現(xiàn)之前即已存在,病程早期LVEF不會隨著心肌纖維化而發(fā)生顯著改變?？v觀SHR血壓與心臟重構相關指標動態(tài)變化,SHR心肌纖維化相較血壓存在一定的遲滯性,符合高血壓心肌纖維化大體宏觀演變過程。

相關研究表明,TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等指標可以從不同層面反映心肌纖維化的演變,可作為心肌纖維化的動態(tài)觀測指標[11-13]。本研究顯示,32周前SHR和WKY左室心肌TGF-β1表達均隨鼠齡增加呈下調趨勢,32周后SHR左室心肌TGF-β1表達逐漸上升,42周時較WKY表達顯著上調,與SHR心肌纖維化前期處于較低水平而后期迅速發(fā)展相符。TGF-β1介導的信號通路是多種疾病導致心肌纖維化的共同途徑,可通過促進心肌成纖維細胞向成肌纖維細胞表型轉化以及上調結締組織生長因子等細胞因子表達,誘導纖維細胞增殖,進而促進心肌纖維化[14]。高血壓相關臨床研究表明,高血壓患者血漿中總TGF-β1及活化TGF-β1水平均較正常血壓者顯著升高,與高血壓引發(fā)的心、腎纖維化等靶器官損害有關[15]。在心肌組織的膠原網絡中,Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達水平及比例變化決定了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[16-17]。本研究中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原表達均呈現(xiàn)先降后升的趨勢,與TGF-β1表達呈現(xiàn)時空一致性,再次印證SHR心肌纖維化的時序動態(tài)變化特征。有報道顯示,TGF-β1作為膠原合成的驅動因子,可通過旁分泌和自分泌方式刺激成纖維細胞增生,促使合成膠原增加,表明TGF-β1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原可指示心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[18]。

通過對SHR中長期的持續(xù)觀測,證實伴隨SHR的鼠齡及血壓改變,其心肌纖維化不斷演變發(fā)展,并從宏觀入微觀呈現(xiàn)出時序改變的特征,充分展現(xiàn)SHR作為高血壓心肌纖維化動物模型的獨特價值,有助于高血壓心肌纖維化的相關研究的開展。