大鼠混合細(xì)菌感染性肺炎模型的建立與評價

彭冬冬,陳相池,夏偉,劉學(xué)武,王菲

(1.新藥藥效與安全性評價湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410331;2.湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司,長沙 410331;3.上海市第十人民醫(yī)院,上海 200072)

肺炎是臨床上常見的呼吸道疾病,發(fā)病率、死亡率常年居高不下,對人們的健康危害極大,對老人和兒童尤甚,在中國每年約有2100萬兒童罹患肺炎[1]。肺炎按病因可分為細(xì)菌性肺炎、非典型病原體所致肺炎、病毒性肺炎、肺真菌病、其他病原體所致肺炎等,其中細(xì)菌性肺炎最為常見[2]。近年來,國內(nèi)外學(xué)者多采用金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌,大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等細(xì)菌構(gòu)建單一細(xì)菌感染肺炎模型[3-5],但多種細(xì)菌混合后的肺炎感染建模鮮有報(bào)道。最新的文獻(xiàn)均指出越來越多的社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)病例中診斷出多種微生物混合感染,它們包括細(xì)菌、病毒和真菌等多種組合,其中以細(xì)菌合并感染最普遍。常見的混合細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及一些非典型病原體,如肺炎支原體和肺炎衣原體等,它們之間的組合是CAP常見的發(fā)病原因?；旌霞?xì)菌性肺炎存在于所有年齡段,除以肺炎鏈球菌為主要病原體的情況外,約10%～35%的肺炎病例為多種細(xì)菌混合感染。由于細(xì)菌之間的相互作用,會影響混合細(xì)菌感染性肺炎病情的診斷,并且使得病情更加嚴(yán)重,治療手段有限、治療效果差[6-7]。然而目前對于混合細(xì)菌感染性肺炎藥物治療效果評價的研究卻很少,因此有必要對其進(jìn)行研究[8-9]。本研究擬采用金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌以及大腸桿菌等比例混后侵染大鼠,建立細(xì)菌性肺炎模型,旨在建立穩(wěn)定的混合細(xì)菌感染性肺炎模型,為細(xì)菌性肺炎發(fā)病機(jī)制研究及抗細(xì)菌感染性肺炎藥物的評價提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

36只5～6周齡SPF級SD大鼠,雌雄各半,體重(200±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】,飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心病原微生物實(shí)驗(yàn)室(ABSL-Ⅱ)(長衛(wèi)計(jì)實(shí)備字(2019)第B001號)【SYXK(湘)2020-0015】,期間給予鼠全價顆粒飼料,自由飲水,室溫(23±2)℃,濕度40%～60%,光照明暗各12 h,通風(fēng)良好。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南省藥物安全評價研究中心實(shí)驗(yàn)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC2020(3)038)。

1.1.2 病原微生物

金黃色葡萄球菌,肺炎鏈球菌,大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株,由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)檢驗(yàn)科贈送,在本中心病原微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)前1 d將3種菌株接種于羊血瓊脂糖平板上,于CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24 h后,收集細(xì)菌。將上述3株細(xì)菌收集液用無菌0.9%氯化鈉注射液稀釋至1×108CFU/mL,再將3株細(xì)菌收集液按1∶1∶1混合后,備用。

1.1.3 主要試劑與儀器

注射用乳糖酸紅霉素(規(guī)格:以紅霉素計(jì)0.25 g/瓶,批號:190602,由東易和天生物科技有限公司生產(chǎn))、丙泊酚乳狀注射液(規(guī)格:20 mL:0.2 g,批號:21912183,由西安力邦制藥有限公司生產(chǎn))、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號:09/2020)、大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)(批號:09/2020),以上試劑盒均由江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司提供。BCR-RI01-30-C12-PPSU型大鼠獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、BSC1300-II-A2型生物安全柜(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、HRHMNE3026型小動物單濃度口鼻吸入染毒系統(tǒng)(北京慧榮和科技有限公司)、BC-5000Vet型獸用五分類血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞公司)、DFC 420C型病理成像系統(tǒng)(德國Leica公司)、Spectra Max i3x型多功能酶標(biāo)儀(上海美谷光子公司)、小動物肺功能檢測系統(tǒng)(上海塔望智能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥

麻醉大鼠,將其仰臥解剖板上呈30°～45°角傾斜位置,用1 mL的注射器吸取混合細(xì)菌液0.5 mL,連接穿刺長針,耳鏡下暴露大鼠氣管,注入氣管內(nèi),抽出插管后,將實(shí)驗(yàn)動物保持頭高腳低位,并輕輕左右旋轉(zhuǎn)體位,使菌液均勻分布于大鼠的兩肺。造模后2 h進(jìn)行口鼻吸入給藥,紅霉素組大鼠經(jīng)口鼻吸入給予5 mg/mL紅霉素溶液,霧化時設(shè)置氣溶膠質(zhì)量檢測儀濃度范圍為14 000～16 000 mg/cm3,空白對照組與模型對照組按相同方法給予0.9%氯化鈉注射液,每天3次,每次10 min,每次間隔4 h,連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 觀察指標(biāo)

(1)一般觀察:觀察各組大鼠活動狀況、背毛、呼吸、自主活動等情況。

(2)體溫測定:各組于造模第3、7天,采用MC-347型電子體溫計(jì)測量大鼠肛溫。

(3)肺功能檢查:各組于造模第3、7天,按性別隨機(jī)取6只大鼠,雌雄各半,采用尾靜脈注射10 mg/kg丙泊酚乳狀注射液(10 mg/mL)麻醉,麻醉后分離氣管進(jìn)行插管,采用小動物肺功能檢測儀檢測大鼠潮氣量(VT)、呼吸頻率(f)、每分通氣量(MV)、用力肺活量(FVC)、第0.2秒量(FEV200),并計(jì)算FEV200/FVC。

(4)肺泡灌洗液中白細(xì)胞(WBC)與中性粒細(xì)胞(Neu)含量測定:各組于造模第3、7天,首先對大鼠左側(cè)主支氣管結(jié)扎,采用2 mL的0.9%氯化鈉注射液對大鼠右側(cè)肺部進(jìn)行灌洗,抽取3次,收集肺泡灌洗液(BALF),采用獸用五分類血液細(xì)胞分析儀檢測WBC數(shù)目及Neu%。

(5)BALF中IL-6、TNF-α含量測定:將收集到的灌洗液轉(zhuǎn)移至試管內(nèi),采用酶聯(lián)免疫吸附法測定,具體如下:將樣品稀釋液和待測樣品加入各樣本孔,加入酶標(biāo)試劑后37℃溫育60 min。使用配好的洗滌液洗滌5次后加入顯色劑,37℃避光反應(yīng)15 min后加入終止液中止反應(yīng),終止反應(yīng)后15 min內(nèi)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(OD),計(jì)算樣本中濃度。

(6)肺組織病理學(xué)觀察:收集肺泡灌洗液后腹主動脈放血安樂死,解剖取左側(cè)下葉肺組織置于10%中性福爾馬林溶液固定,經(jīng)HE染色后,采用DFC 420C型病理成像系統(tǒng)觀察肺組織病理學(xué)改變。

(7)肺組織細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù):除空白對照組外,其余每組中隨機(jī)抽取6只動物(首次及末次解剖各隨機(jī)挑選6只),雌雄各半,取左側(cè)中葉肺組織,用0.9%氯化鈉注射液清洗表面血跡。稱取肺組織1.0 g于無菌的Ep管中,加入1 mL無菌生理鹽水研磨成勻漿,采用10倍梯度進(jìn)行稀釋(即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5……),選擇適宜的2個梯度于選擇性培養(yǎng)基上,且每個梯度做2個平行,置(36±1)℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各組數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示。兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

整個試驗(yàn)期間,空白對照組大鼠背毛光澤、活動能力強(qiáng)、飲食無異常、呼吸狀態(tài)平穩(wěn),無氣促現(xiàn)象、無其他異常;模型對照組給大鼠,給藥期間背毛無光澤、呼吸急促、活動減少;紅霉素組大鼠給藥前期背毛無光澤,出現(xiàn)呼吸急促、活動減少現(xiàn)象,但隨著給藥時間的延長,上述狀況明顯好轉(zhuǎn),給藥結(jié)束時,該組大鼠呼吸狀態(tài)趨于正常,活動亦明顯增多。

2.2 各組大鼠體溫變化比較

如表1所示,與空白對照組比較,模型對照組造模第3～7天體溫顯著升高(P＜0.01);與模型對照組比較,紅霉素組造模第4～6天體溫明顯降低。

表1 各組大鼠不同時間體溫變化比較(,n=6)Table 1 Comparison of body temperature changes of rats in different groups at different times(,n=6)

表1 各組大鼠不同時間體溫變化比較(,n=6)Table 1 Comparison of body temperature changes of rats in different groups at different times(,n=6)

注:與空白對照組相比,++P＜0.01;與模型對照組相比,*P＜0.05。Note.Compared with blank group,++P＜0.01.Compared with model group,*P＜0.05.

組別Groups體溫(℃)Body temperature(℃)第1天D1第2天D2第3天D3第4天D4第5天D5第6天D6第7天D7空白對照組Blank group 37.0±1.2 36.6±0.9 35.9±3.9 36.2±1.2 36.4±0.8 36.7±0.4 36.8±0.4模型對照組Model group 37.2±0.5 36.6±1.1 37.8±0.7++ 37.5±0.6++ 37.5±1.2++ 37.1±0.5++ 37.6±0.3++紅霉素組Erythromycin group 36.5±0.5 36.6±0.7 37.7±0.5 36.8±0.3* 35.7±0.5* 36.3±0.7* 37.2±0.5

2.3 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

如圖1所示,造模第3、7天,模型對照組大鼠最大呼氣及吸氣流量較空白對照組均有明顯降低,提示混合菌感染大鼠后,肺通氣功能下降;模型大鼠經(jīng)過霧化吸入紅霉素溶液,發(fā)現(xiàn)大鼠最大呼氣及吸氣流量有所增加,提示紅霉素可改善肺通氣功能;造模第3天后,與空白對照組比較,模型對照組用力肺活量(FVC)顯著減小(P＜0.01)。與模型對照組比較,紅霉素組潮氣量(VT)呈增加趨勢,呼吸頻率(f)呈降低趨勢,但無顯著性差異,每分通氣量(MV)無顯著變化;紅霉素組FEV200/FVC顯著增加(P＜0.01)。提示,肺炎早期由于肺的通氣功能受限,機(jī)體會通過增加呼吸頻率,進(jìn)而維持通氣量的恒定。造模第7天后,與空白對照組比較,模型對照組潮氣量、FEV200/FVC均顯著減小(P＜0.05,P＜0.01);與模型對照組比較,紅霉素組呼吸頻率、每分通氣量、FCV、FEV200呈上升趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,潮氣量、FEV200/FVC均顯著增加(P＜0.01)(見表2,表3)。

表3 造模第7天各組大鼠肺功能指標(biāo)比較(,n=6)Table 3 Comparison of lung function indexes of rats in each group 7 days of modeling(,n=6)

表3 造模第7天各組大鼠肺功能指標(biāo)比較(,n=6)Table 3 Comparison of lung function indexes of rats in each group 7 days of modeling(,n=6)

組別Groups VT(mL) f(次/min) MV(L/min) FVC(mL) FEV200(mL) FEV200/FVC(%)空白對照組Blank group 1.78±0.23 116±10 0.21±0.03 4.75±1.89 4.43±1.70 93.58±1.50模型對照組Model group 1.22±0.22++ 125±15 0.15±0.01 3.55±0.45 2.93±0.63 81.63±7.70++紅霉素組Erythromycin group 1.67±0.24** 130±25 0.21±0.01 3.68±0.20 3.40±0.12 92.36±2.94**

注:造模D3、D7空白對照組、模型對照組和紅霉素組肺通氣功能圖譜(圖中藍(lán)線和紅線箭頭分別代表最大呼氣流量和最大吸氣流量)。圖1 不同時期各組大鼠肺通氣功能圖譜及肺功能指標(biāo)Note.Modeling D3,D7 lung ventilation function map of blank control group,model control group and erythromycin group(The blue and red arrows represent the maximum expiratory and inspiratory flows respectively).Figure 1 Lung ventilatory function map and lung function index of rats in different periods

表2 造模第3天各組大鼠肺功能指標(biāo)比較(,n=6)Table 2 Comparison of lung function indexes of rats in each group 3 days of modeling(,n=6)

表2 造模第3天各組大鼠肺功能指標(biāo)比較(,n=6)Table 2 Comparison of lung function indexes of rats in each group 3 days of modeling(,n=6)

注:與空白對照組比較,+P＜0.05,++P＜0.01;與模型對照組比較,**P＜0.01。(下圖/表同)Note.Compared with blank group,+P＜0.05,++P＜0.01.Compared with model control group,**P＜0.01.(The same in the following figures and tables)

組別Groups VT(mL) f(次/min) MV(L/min) FVC(mL) FEV200(mL)FEV200/FVC(%)空白對照組Blank group 1.77±0.35 112±26 0.19±0.02 4.02±0.35 3.74±0.31 93.31±0.77模型對照組Model group 1.41±0.43 153±31 0.21±0.03 2.77±0.26+ 2.21±0.26 79.96±6.16++紅霉素組Erythromycin group 1.59±0.39 132±27 0.20±0.02 3.12±0.52 2.84±0.54 90.65±4.78**

2.4 各組大鼠BALF中WBC與Neu%比較

如表4所示,造模第3天,與空白對照組比較,模型對照組白細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P＜0.05);與模型對照組比較,紅霉素組白細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P＜0.01),中性粒細(xì)胞百分比(Neu%)無顯著性差異。造模第7天,與空白對照組比較,模型對照組白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞百分比顯著增加(P＜0.05,P＜0.01);與模型對照組比較,紅霉素組白細(xì)胞數(shù)目均顯著減小(P＜0.01)。值得關(guān)注的是,模型大鼠在造模后第7天白細(xì)胞數(shù)目較造模后第3天有一定的降低,提示肺炎大鼠在造模后第7天可能有自愈趨勢。

表4 不同時期各組大鼠BALF中WBC、Neu(%)比較(,n=6)Table 4 Comparison of WBC and Neu(%)in BALF of different groups of rats in different periods(,n=6)

表4 不同時期各組大鼠BALF中WBC、Neu(%)比較(,n=6)Table 4 Comparison of WBC and Neu(%)in BALF of different groups of rats in different periods(,n=6)

造模第3天3 days of modeling 造模第7天7 days of modeling組別Groups WBC(109/L) Neu(%) WBC(109/L) Neu(%)空白對照組Blank group 0.34±0.06 44.6±18.0 0.14±0.11 38.4±11.8模型對照組Model group 1.71±1.21++ 55.1±7.1 0.64±0.17++ 55.5±11.0+紅霉素組Erythromycin group 0.89±0.37** 57.4±5.8 0.33±0.18** 45.7±12.2

2.5 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α比較

如表5所示,造模第3天,與空白對照組比較,模型對照組IL-6、TNF-α顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較,紅霉素組IL-6雖一定程度降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,紅霉素組TNF-α較模型對照組顯著減小(P＜0.01)。造模第7天,與空白對照組比較,模型對照組IL-6、TNF-α顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較,紅霉素組IL-6、TNF-α均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01)。

表5 不同時期各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α比較(,n=6)Table 5 Comparison of IL-6 and TNF-α in BALF of different groups of rats in different periods(,n=6)

表5 不同時期各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α比較(,n=6)Table 5 Comparison of IL-6 and TNF-α in BALF of different groups of rats in different periods(,n=6)

造模第3天3 days of modeling 造模第7天7 days of modeling組別Groups IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)空白對照組Blank group 129.8±1.8 270.4±20.2 121.14±4.8 256.7±6.3模型對照組Model group 152.2±6.2++ 326.6±8.1++ 152.6±8.1++ 310.6±24.7++紅霉素組Erythromycin group 146.3±4.4 298.1±4.4** 141.3±3.9** 258.6±11.9**

2.6 肺組織病理形態(tài)改變

如圖2所示,空白對照組大鼠肺泡以及肺間質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)均為正常,首次解剖,模型對照組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,肺泡壁明顯增厚,可見肺泡壁血管充血,炎癥細(xì)胞大量浸潤,紅霉素組均可見肺泡壁增厚,肺泡壁血管有微量充血,炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)異常,但上述病理改變較模型對照組均有明顯改善。末次解剖模型對照組肺泡壁增厚明顯,可見肺泡壁血管少量充血,炎癥細(xì)胞大量浸潤,值得注意的是,末次解剖模型對照組肺組織在炎癥細(xì)胞浸潤方面較首次解剖有所減輕,與肺炎大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞結(jié)果基本一致,提示該肺炎模型在造模后7 d有一定自愈趨勢。

圖2 不同時期各組大鼠肺組織蘇木精和伊紅染色法結(jié)果(n=6)Figure 2 Results of hematoxylin and eosin staining in lung tissues of rats in different periods(n=6)

2.7 肺組織細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)

如表6所示,與模型對照組比較,造模第3天,紅霉素組動物肺組織中大腸埃希菌、金黃葡萄球菌、肺炎鏈球菌數(shù)目大幅度的降低(P＜0.01),造模第7天,紅霉素組動物肺組織中大腸埃希菌、金黃葡萄球菌、肺炎鏈球菌數(shù)目大幅度的降低(P＜0.01)。

表6 不同時期各組大鼠肺組織細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)比較(,n=6)Table 6 Comparison of bacterial culture counts of lung tissue in different groups of rats in different periods(n=6)

表6 不同時期各組大鼠肺組織細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)比較(,n=6)Table 6 Comparison of bacterial culture counts of lung tissue in different groups of rats in different periods(n=6)

第3天(CFU/mL)Number of bacteria D3(CFU/mL)第7天(CFU/mL)Number of bacteria D7(CFU/mL)組別Groups 大腸埃希菌Escherichia coli金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae大腸埃希菌Escherichia coli金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae模型對照組Model group 3100±544 5027±1017 4730±1062 3712±1102 5389±2012 5290±1881紅霉素組Erythromycin group 447±146** 633±146** 1223±287** 243±89** 245±70** 301±103**

3 討論

近些年來,國內(nèi)外先后建立多種細(xì)菌侵染性肺炎動物模型,但多數(shù)研究均是以單一菌株進(jìn)行動物模型的建立,忽視了CAP多為混合感染,且以革蘭陰性菌(如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等)感染多見,出現(xiàn)該現(xiàn)象可能與廣泛應(yīng)用抗菌藥物致細(xì)菌耐藥有關(guān)[10]。混合細(xì)菌感染性肺炎患者除了會出現(xiàn)體溫、肺功能、白細(xì)胞及肺部X光線等指標(biāo)異常外,容易并發(fā)電解質(zhì)紊亂、呼吸衰竭、心率失常等疾病,嚴(yán)重威脅患者的生命安全,并給臨床診治帶來很大的困難,故此類動物模型建立對抗混合細(xì)菌感染性肺炎藥物評價有著重要意義。因此本研究選用臨床上較為普遍的革蘭陰性菌(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌)感染大鼠,按1∶1∶1的劑量混合后進(jìn)行大鼠氣管注射,建立大鼠混合細(xì)菌感染性肺炎模型,通過觀察各組大鼠肛溫、白細(xì)胞、肺功能及肺組織形態(tài)學(xué)變化,并觀察金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌在大鼠肺組織定植情況,同時選用臨床有效的紅霉素霧化后對大鼠混合細(xì)菌感染性肺炎模型的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予每只0.5 mL混合菌液感染(1×108CFU/mL)大鼠,大鼠在注入菌液第2天就出現(xiàn)了活動減少、呼吸急促、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象,且第3天體溫明顯上升,這與已報(bào)道的動物肺炎感染模型的癥狀相符[3]。造模第3天,模型對照組動物肺功能檢測結(jié)果顯示,該組動物肺潮氣量下降,呼吸頻率上升,但每分通氣量與空白對照組無明顯差異,提示肺炎早期由于肺的通氣功能受限,機(jī)體會通過增加呼吸頻率,進(jìn)而維持通氣量的恒定;造模第7天,肺炎模型組動物潮氣量、FEV200/FVC明顯降低,呼吸頻率趨于正常,提示隨著病程的推進(jìn),模型對照組動物肺通氣功能受損。給予紅霉素霧化吸入治療后,潮氣量下降,FEV200/FVC提高。結(jié)果表明紅霉素霧化治療可以緩解細(xì)菌感染性性肺炎造成的肺通氣功能受損。

金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌表面復(fù)合物抗原能引起炎癥反應(yīng)、刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生[11-13]。TNF-α具有廣泛的生物活性的前炎癥細(xì)胞因子,可由多種免疫細(xì)胞釋放[14],在免疫應(yīng)答中,TNF-α可誘導(dǎo)IL-6、IL-10等炎癥因子的產(chǎn)生,肺炎發(fā)病期間呈升高趨勢,并與病情的程度相關(guān)[15]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子,與炎癥密切相關(guān),研究表明肺炎發(fā)病過程中IL-6顯著升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模第3、7天肺炎模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-6含量均明顯上升,提示金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌刺激致大鼠TNF-α、IL-6水平升高,介導(dǎo)炎性反應(yīng)。給予紅霉素霧化治療后,肺炎動物肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6水平顯著降低,這表明紅霉素霧化給藥能明顯下調(diào)肺炎大鼠TNF-α、IL-6的水平,緩解TNF-α、IL-6介導(dǎo)炎性反應(yīng)。對模型對照組與紅霉素組動物肺進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅霉素霧化治療后的動物肺中的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌數(shù)目均有明顯的減少,提示紅霉素霧化治療能顯著抑制金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌在肺中的復(fù)制。

對支氣管肺泡灌洗液中成分的檢測,是一種有效研究肺組織局部免疫病理過程的方法[17],能直接反映出感染肺炎的肺泡結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的類型和數(shù)量[18]。其中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量與肺炎程度緊密相關(guān),可作為判斷患者是否出現(xiàn)肺炎或判斷肺炎嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較于空白對照組,造模第3、7天模型對照組白細(xì)胞數(shù)目,中性粒細(xì)胞百分比均明顯增加,這表明模型對照組動物肺部出現(xiàn)了炎癥反應(yīng),肺組織病理學(xué)觀察顯示肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,肺間質(zhì)明顯增厚,大量炎性細(xì)胞浸潤,亦表明該組動物肺部出現(xiàn)了嚴(yán)重的炎癥。給予紅霉素霧化治療后,模型動物肺泡灌洗中白細(xì)胞數(shù)目,中性粒細(xì)胞降低明顯,表明模型動物肺中的炎癥反應(yīng)得到了明顯緩解,肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果亦顯示該組動物的病變程度明顯好轉(zhuǎn)。令人意外的是,與第3天相比,在第7天模型對照大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降的情況,并且肺組織病理改變也存在一定的改善,說明其具有一定的自愈趨勢,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]。考慮到傳統(tǒng)的肺炎模型通常為重癥模型,大鼠病情較重,死亡率較高,因此本實(shí)驗(yàn)采用混合細(xì)菌經(jīng)氣管單次給藥的造模方式,并且給藥劑量與文獻(xiàn)相比也較低。在第7天,發(fā)現(xiàn)與空白對照大鼠相比,模型大鼠仍有明顯的肺炎指征,因此我們認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍具有一定參考價值。不過在后續(xù)研究中,我們還會對不同病原菌動物模型建立方法進(jìn)行不斷優(yōu)化,并探索不同病原菌動物模型和菌株接種劑量以及菌株濃度的關(guān)系,必要時輔以免疫抑制劑加強(qiáng)造模效果,為抗肺炎藥物有效性評價和作用機(jī)制研究建立穩(wěn)定的肺炎模型。

4 結(jié)論

綜上所述,肺炎模型大鼠體溫、肺功能參數(shù)的變化、肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞與炎癥因子以及肺組織病理學(xué)變化和肺組織細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)等指標(biāo)變化的結(jié)果,認(rèn)為采用金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌混合后經(jīng)氣管滴入大鼠肺部,該方法能成功建立細(xì)菌感染性肺炎大鼠模型,此外,發(fā)現(xiàn)紅霉素溶液霧化給藥對肺炎大鼠治療效果顯著。