抗生素誘導(dǎo)的微生物組耗損后促進(jìn)空腸彎曲菌在小鼠腸道定植

陳浩浩,張艷芳,潘曉明,高素華,張輝,樓宏強(qiáng)*

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,浙江 金華 321007;2.金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院動(dòng)物中心,浙江 金華 321000)

我國(guó)的李春巖院士團(tuán)隊(duì)在20世紀(jì)90年代時(shí)從吉蘭-巴雷綜合征患者糞便里成功分離出了空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni),并經(jīng)口灌胃構(gòu)建了周圍神經(jīng)損傷的依沙巴布考克雞模型[1]。此外研究人員用空腸彎曲菌菌株灌胃家兔[2]、小型豬[3]以及豚鼠[4]等,也觀察到了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)病理?yè)p傷。然而對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用是比較有限的,不僅成本高、可重復(fù)性差,還缺乏足夠的免疫和遺傳工具來(lái)深入研究這些動(dòng)物[5]。小鼠通常作為首選的感染動(dòng)物模型,卻沒(méi)有在空腸彎曲菌感染相關(guān)模型中得到廣泛應(yīng)用[6-7]。研究顯示,小鼠腸道菌群,尤其是擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌及乳酸桿菌等,競(jìng)爭(zhēng)性阻止了空腸彎曲菌在小鼠腸道內(nèi)的定植,從而使小鼠不易感空腸彎曲菌[8-9]。

抗生素誘導(dǎo)的微生物組耗損(antibiotic-induced microbiome depletion)是近幾年興起的一種可替代無(wú)菌小鼠用于研究腸道微生物群在某些病理?xiàng)l件下作用的新方法[10-12]。通常認(rèn)為,動(dòng)物腸道內(nèi)的共生菌群能阻止外源性病原體的侵入,是宿主防御的重要組成部分[13]。腸道菌群以多種方式抵抗病原體,包括消耗病原體生存必需的營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸、改變腸腔內(nèi)的pH值或者利用腸道內(nèi)有限的氧氣等[14-15],而抗生素打破了腸道菌群的平衡,還導(dǎo)致細(xì)菌裂解、碳源釋放以及膽汁酸水平的升高[16]。本研究利用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉誘導(dǎo)腸道微生物組耗損,建立一種空腸彎曲菌在C57BL/6小鼠腸道定植的方法,為后續(xù)空腸彎曲菌致病性相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只8～10周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠,體重18～20 g,購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院【SCXK(浙)2019-0002】,飼養(yǎng)于金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院動(dòng)物中心【SYXK(浙)2021-0009】,給予滅菌飲用水及食物,晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～25℃。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):JHCDW2021003),在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,如果小鼠表現(xiàn)出極度痛苦或體重下降超過(guò)15%的跡象,就對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死。空腸彎曲菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC22936,ATCC33291),接種于哥倫比亞血瓊脂平板上,微需氧條件下42℃培養(yǎng)48 h。

1.1.2 主要試劑與儀器

注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉購(gòu)自輝瑞制藥,QIAamp? FAST DNA Stool Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司,細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,iTaq Universal Probes supermix及兔抗空腸彎曲菌多克隆抗體購(gòu)自Bio-Rad公司,驢抗兔IgG H&L二抗購(gòu)自Abcam公司,PCR引物及熒光探針由上海生工生物工程有限公司合成,16S rDNA法測(cè)序及分析委托上海天昊生物科技有限公司完成。熒光定量PCR儀(CFX96,Bio-Rad公司,美國(guó)),正置熒光顯微鏡(BX53,奧林巴斯,日本)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組

將小鼠隨機(jī)分為3組,分別為正常組(n=6)、對(duì)照組(n=15)及實(shí)驗(yàn)組(n=15),適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,實(shí)驗(yàn)組灌胃200 μL的注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(50 mg/mL),第2天重復(fù)灌胃1次,對(duì)照組使用200 μL生理鹽水灌胃替代,正常組不做任何處理。第3天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別灌胃200 μL含空腸彎曲菌(4.0麥?zhǔn)蠞岫?約1.2×109CFU/mL)生理鹽水溶液,建模完成[12,17]。

1.2.2 小鼠腸道細(xì)菌多樣性分析

在建模后第1、2、3天,麻醉小鼠(每組3只),脫頸安樂(lè)死,立即解剖小鼠,取末端回腸、近端結(jié)腸及盲腸,收集內(nèi)容物,參照QIAamp? FAST DNA Stool Mini Kit說(shuō)明書步驟分離純化DNA,送生物技術(shù)公司進(jìn)行16S rDNA法鑒定細(xì)菌種屬。

1.2.3 探針?lè)╭PCR檢測(cè)糞便空腸彎曲菌

建模后第1～7天,每日收集小鼠新鮮糞便,提取糞便細(xì)菌DNA。另于第7、14天取末端回腸、近端結(jié)腸及盲腸,收集內(nèi)容物,微需氧條件下42℃液體培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)24 h,收集菌液,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。取5 μL作為模板,分別10 μmol/LHipO上下游引物及探針各0.5 μL(序列見表1),2×iTaq Universal Probes supermix 10 μL,ddH2O 3.5 μL。94℃3min;93℃30 s,55℃45 s,40個(gè)循環(huán);Bio-Rad CFX96 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)擴(kuò)增已知梯度濃度的空腸彎曲菌DNA,構(gòu)建Cq值和拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)擬合曲線方程,之后根據(jù)各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物Cq值進(jìn)行拷貝數(shù)的絕對(duì)定量。

表1 空腸彎曲菌HipO基因特異性引物及探針序列Table 1 HipO gene-specific primers and probe sequences of C.jejuni

1.2.4 組織學(xué)檢測(cè)

分別在建模后第1、2、3、7天,取動(dòng)物的回腸、結(jié)腸及盲腸組織,4%多聚甲醛溶液固定,梯度乙醇脫水,石蠟包埋、切片,經(jīng)脫蠟,水化,檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù),TritonX-100透膜,加封閉液后濕盒中37℃孵育30 min。棄封閉液,加一抗(兔抗空腸彎曲菌,1∶100)4℃孵育過(guò)夜,加二抗(Donkey Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor? 647,1∶200)37℃孵育1 h,DAPI染色,抗淬滅熒光封片劑封片,熒光顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。對(duì)建模后第3、7天的回腸、盲腸及結(jié)腸石蠟切片進(jìn)行蘇木精、伊紅染色后拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA法鑒定回腸、結(jié)腸及盲腸細(xì)菌種屬

委托生物公司進(jìn)行了腸道內(nèi)容物16S rDNA測(cè)序法分析了細(xì)菌群落組成(見圖1),結(jié)果顯示,對(duì)照組回腸內(nèi)容物中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度較高,盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物中擬桿菌屬(Bacteroides)相對(duì)豐度較高,實(shí)驗(yàn)組腸道內(nèi)容物中皆是腸球菌屬(Enterococus)相對(duì)豐度較高。另外,在建模后第1天實(shí)驗(yàn)組腸道中檢測(cè)到較高豐度的彎曲菌屬(Campylobacter)。

圖1 16S rDNA測(cè)序分析3組腸道內(nèi)容物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果Figure 1 Bacterial community structure of the intestinal contents in 3 groups analyzed by 16S rDNA sequencing method

2.2 小鼠糞便檢出空腸彎曲菌

建模后收集小鼠糞便,持續(xù)7 d,利用探針?lè)╭PCR檢測(cè)空腸彎曲菌HipO基因,得出Cq值(見圖2)和拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)擬合曲線方程y=-0.303x+13.379(R2=0.9995),將各樣本的Cq值代入公式后計(jì)算拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,在建模后第1～3天的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物糞便中能檢測(cè)到較高拷貝數(shù)的空腸彎曲菌(P＜0.01,見表2),而對(duì)照組動(dòng)物糞便僅在第1天檢出較高拷貝數(shù)的空腸彎曲菌。對(duì)實(shí)驗(yàn)組第7、14天腸道內(nèi)容物增菌培養(yǎng)后,在第7天的盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中檢測(cè)到了較高拷貝數(shù)的空腸彎曲菌,分別為(1850±116)及(1238±182),在第14天的結(jié)腸內(nèi)容物空腸彎曲菌拷貝數(shù)(2990±195)。

表2 絕對(duì)定量2組空腸彎曲菌HipO基因拷貝數(shù)Table 2 Absolute quantification of C.jejuni HipO gene copy number in 2 groups

圖2 探針?lè)╭PCR檢測(cè)3組空腸彎曲菌HipO基因的Cq值Figure 2 Cq value of C.jejuni HipO gene in 3 groups detected by TaqMan qPCR

2.3 空腸彎曲菌在小鼠腸道定植

我們對(duì)建模后第1、2、3及7天時(shí)小鼠的回腸、結(jié)腸及盲腸組織進(jìn)行了空腸彎曲菌(紅色)的免疫熒光染色。結(jié)果顯示,第1、2及3天實(shí)驗(yàn)組的回腸、結(jié)腸、盲腸管腔內(nèi)可見明顯的紅色熒光標(biāo)記的空腸彎曲菌,第7天時(shí)腸道內(nèi)未見明顯的紅色標(biāo)記(見圖3);對(duì)照組在第1天結(jié)腸可見少量的紅色標(biāo)記,其他時(shí)間段未見紅色明顯紅色熒光標(biāo)記。

2.4 空腸彎曲菌短期定植未引起小鼠腸道炎癥反應(yīng)

建模后第3、7天的回腸、盲腸及結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道黏膜基本完整,未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖4)。

圖4 建模后第3、7天小鼠腸道組織HE染色Figure 4 HE staining of mouse intestinal tissue at 3,7 d post modeling

3 討論

空腸彎曲菌的宿主較廣泛,包括禽類和哺乳類動(dòng)物,也是彎曲桿菌屬中最主要的引起全球范圍內(nèi)人類胃腸炎的致病菌之一?？漳c彎曲菌不能在小鼠的消化道內(nèi)定植,小鼠腸道菌群被認(rèn)為是阻止了空腸彎曲菌定植的重要因素之一[16,18],動(dòng)物的腸道有大量微生物定居,每克結(jié)腸糞便中的細(xì)菌含量超過(guò)1011個(gè)[13]。在本研究中,利用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉連續(xù)灌胃2 d,誘導(dǎo)小鼠腸道微生物組耗損,引起腸道菌群平衡失調(diào)[19],使空腸彎曲桿菌能夠在小鼠腸道中定植。通過(guò)腸道內(nèi)容物細(xì)菌群落組成分析結(jié)果表明,回腸中的乳酸桿菌,盲腸及結(jié)腸中的擬桿菌屬,可能是對(duì)病原體提供定植抗性的重要菌群[20-21]。

一般認(rèn)為在新鮮糞便中出現(xiàn)或直接從動(dòng)物腸道中培養(yǎng)出空腸彎曲菌,即可認(rèn)為空腸彎曲菌在消化道內(nèi)定植成功。在本研究中,在建模后的前3 d的小鼠糞便中都檢出了較高拷貝數(shù)的空腸彎曲菌,此外在腸道組織切片中,通過(guò)免疫熒光染色也證實(shí)了空腸彎曲菌在小鼠腸道的定植。在對(duì)建模后第7、14天小鼠腸道內(nèi)容物進(jìn)行增菌培養(yǎng)后,仍能在結(jié)腸內(nèi)容物中檢出了少量的空腸彎曲菌,但組織病理學(xué)檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),提示空腸彎曲菌可能沒(méi)有進(jìn)入腸道組織的深部?？漳c彎曲菌依賴鞭毛的定向趨化運(yùn)動(dòng),穿越黏膜表面黏液層到達(dá)空腸及回腸黏膜細(xì)胞表面定植。趨化蛋白(chemotaxis protein,CheY)負(fù)責(zé)將感覺(jué)信號(hào)從空腸彎曲菌的化學(xué)感受器傳送到鞭毛,能調(diào)節(jié)鞭毛的順時(shí)針旋轉(zhuǎn),研究顯示,空腸彎曲菌的CheY失活后,其鞭毛的運(yùn)動(dòng)性和侵襲力沒(méi)有改變,但喪失了化學(xué)趨化性,造成它不能在動(dòng)物的腸道細(xì)胞內(nèi)定植[22-23]。劉碩[24]采用經(jīng)口灌胃攻毒昆明小鼠,收集糞便分離培養(yǎng)空腸彎曲菌,之后用分離菌株繼續(xù)攻毒新一批小鼠,連續(xù)傳代十八代,從而得到了毒力增強(qiáng)且穩(wěn)定遺傳的分離株。本研究采用建模的菌株為空腸彎曲菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33291,如果采用其他侵襲性及致病性更強(qiáng)的菌株,可能就會(huì)有不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

消化道具有復(fù)雜的免疫系統(tǒng),包括免疫細(xì)胞、免疫組織和免疫作用因子等,它們之間通過(guò)持續(xù)有效的相互作用消除侵入的致病菌[25-26]。當(dāng)小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)變化時(shí),空腸彎曲菌就可以在其腸道內(nèi)定植,有研究者在空腸彎曲菌攻擊免疫缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠前給予口服氨芐西林、萬(wàn)古霉素等廣譜抗生素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌在結(jié)腸、腸系膜淋巴結(jié)及脾等部位定植[8,17,27]。此外,空腸彎曲菌能有效地在無(wú)菌小鼠的腸道內(nèi)定植,并向其免疫組織器官傳播[28]?？墒遣还苁敲庖呋蛉毕菪∈筮€是無(wú)菌小鼠,都極大地改變了小鼠的免疫系統(tǒng),不能有效模擬空腸彎曲菌在健康人腸道的感染以及后續(xù)誘發(fā)的相關(guān)疾病。另外,近期高通量腸道宏基因組測(cè)序分析提示性別因素是對(duì)腸道菌群影響最大的[29],在本研究中,為了腸道菌群保持相對(duì)一致,同組小鼠保持同籠飼養(yǎng),另外飼養(yǎng)周期大于2周,所以選取了雌性的小鼠。那么性別或者激素是否會(huì)影響空腸彎曲菌的定植,這是一個(gè)指得繼續(xù)深入研究的問(wèn)題。

綜上所述,本研究證實(shí)了經(jīng)頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉誘導(dǎo)的微生物組耗損后能促進(jìn)空腸彎曲菌在小鼠腸道內(nèi)的短期定植,但如果要維持持續(xù)定植并產(chǎn)生致病性仍需要更深入的研究,尋找更合適的方案。