微囊藻毒素-LR對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞線粒體功能的影響

賀云,陳藝生,任嵐,尹一杰,胡桂玲,吳云麗*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省腫瘤微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350122;2.福建省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心,福州 350001)

隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化的加劇,藍(lán)藻水華給生態(tài)環(huán)境造成極大壓力。微囊藻毒素(microcystins,MCs)是藍(lán)藻細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,為單環(huán)七肽活性化合物,具有多臟器毒性,如肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性以及腸道菌群改變等,可通過(guò)飲水、食物鏈傳遞及水上活動(dòng)等方式進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi),對(duì)人體及動(dòng)物健康造成嚴(yán)重威脅[1-3]。MCs具百余種異構(gòu)體,其中分布最廣,毒性最強(qiáng)的是微囊藻毒素LR(Microcystin-LR,MC-LR)[4],被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research in Cancer,IARC)定義為可致人類癌癥的風(fēng)險(xiǎn)因素(IIB類)。肝作為MC-LR累積與作用的靶器官,極易受到損害,研究表明MC-LR可引起肝細(xì)胞病理學(xué)改變:腫脹、炎癥,產(chǎn)生活性氧自由基并引起不可逆轉(zhuǎn)的DNA損傷,與肝細(xì)胞壞死、肝癌發(fā)生具有密切聯(lián)系[5-7]。然而,MC-LR的肝毒性機(jī)制及致癌機(jī)制尚不明確,此前很大一部分研究將細(xì)胞死亡歸因于MC-LR引起的氧化應(yīng)激[5,8-10],線粒體功能改變?cè)贛C-LR誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用,甚至在誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡以及癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[10]。至于MCLR如何誘發(fā)線粒體功能障礙方面的研究比較欠缺,具體機(jī)制尚不明朗。基于以上分析,該課題以小鼠原代肝細(xì)胞為模型,從分子水平上評(píng)估MC-LR造成線粒體功能異常的機(jī)制,旨在為MC-LR相關(guān)肝疾病的診斷和治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9只28日齡SPF雄性C57BL/6小鼠,體重約為10 g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2017-0005】。飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(閩)2016-007】,晝夜各半循環(huán)照明,相對(duì)濕度40%～70%,溫度在20～25℃之間。采用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)顆粒料飼料,飲用水為高壓的純凈水,自由采食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(FJMU IACUC 2020-0115)。

1.1.2 主要試劑與儀器

MC-LR(ENZO,ALX-350-012),IV型膠原酶(sigma,C5138),胎牛血清(PAN,P30-3302),青霉素和鏈霉素雙抗生素溶液(Gibico,15140-122),ATP檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,S0026),MitoProbeTMJC-1 Assay Kit(Invitrogen,34152),Reagent Kit for Single Cell Gel Electrophoresis Assay(Trevigen,4250-050-K),Mouse 8-Hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)ELISA Kit(華美生物,CBS-E10527),GAPDH(Cell Signal,2118),p53(Cell Signal,2524)。

冷光儀(Berthold,德國(guó)),激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國(guó)),熒光顯微鏡(Leica,德國(guó)),分子成像儀(ImageQuant LAS 4000 mini,美國(guó)),多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝細(xì)胞提取

采用改良二步灌注法分離提取原代肝細(xì)胞。28日齡雄性小鼠深度麻醉后,開(kāi)腹,從下腔靜脈進(jìn)針,剪斷肝沿靜脈,勻速灌注20 mL不含鈣離子的KRB緩沖液,待血液沖洗干凈后,換成20 mL含有0.5%(w/v)IV型膠原酶的灌注液同法操作。灌注完成后,摘下肝,釋放細(xì)胞,通過(guò)3次低溫低速離心去除雜質(zhì)和死細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和毒素處理

純化的原代細(xì)胞以合適的密度種植于鼠尾膠原包被的孔板中,使用含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗生素溶液的DMEM培養(yǎng)基,放入含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁后,加入0～10 nmol/L不同濃度MC-LR毒素進(jìn)行細(xì)胞染毒,以未加MC-LR的細(xì)胞為對(duì)照,培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)。p53抑制劑pft-α(5 μmol/L)使用時(shí)間為處理毒素前1 h。

1.2.3 線粒體功能檢測(cè)

該實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)的ATP水平是由基于生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行的,首先,冰上裂解細(xì)胞,4°C 12 000 rpm離心10 min,取上清備用。使用ATP檢測(cè)試劑盒中ATP檢測(cè)工作液將檢測(cè)板中作用5 min,以降低本底。加入樣品,迅速混勻,立即用冷光儀測(cè)定CPM值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品ATP濃度。

該研究使用MitoProbeTMJC-1 Assay Kit,進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè),具體步驟如下:用PBS緩沖液清洗細(xì)胞,加入終濃度為10 μg/mL JC-1染料,置于37°C培養(yǎng)箱中,避光孵育20 min,PBS洗滌2次,使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察,拍照,并用LAS AF LITE軟件計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 DNA損傷檢測(cè)

彗星試驗(yàn)(comet試驗(yàn)):使用Reagent Kit for Single Cell Gel Electrophoresis Assay檢測(cè)細(xì)胞DNA雙鏈完整性。細(xì)胞用胰酶消化后,離心收集細(xì)胞,混合于低熔點(diǎn)瓊脂糖中,轉(zhuǎn)移至載玻片,低溫冷卻凝固,于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中裂解過(guò)夜。次日取出,用pH＞13的堿性電泳液中避光電泳30 min。電泳結(jié)束后,清洗,染色,熒光顯微鏡觀察,拍照。

使用Mouse 8-Hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)ELISA Kit檢測(cè)8-OHdG生成水平:裂解細(xì)胞,取細(xì)胞上清,用樣品稀釋液稀釋20倍。使用HRP標(biāo)記待測(cè)樣品,培養(yǎng)箱中孵育30 min后,洗板3次,顯色后,用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)8-OHdG濃度。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)

提取細(xì)胞蛋白后,采用BCA蛋白定量法進(jìn)行定量檢測(cè)。取30 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,蛋白低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜,GAPDH,p53抗體孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記的二抗處理后,洗膜3次,使用分子成像儀進(jìn)行曝光顯影,拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MC-LR造成線粒體功能障礙

為了檢測(cè)線粒體功能,從線粒體膜電位(MMP,Δψm)的變化和細(xì)胞能量代謝(ATP)變化兩個(gè)方面進(jìn)行研究。首先,檢測(cè)了ATP生成水平,結(jié)果如圖1 A所示,與對(duì)照組相比,低劑量2.5 nmol/L MC-LR處理組就可以使ATP水平降低至0.78±0.05倍(P＜0.05),隨著毒素濃度的增加,ATP生成量不斷減少(5 nmol/L組為0.69±0.10倍,10 nmol/L組為0.38±0.05倍,P＜0.05),這一作用迅速而又明顯。接著,檢測(cè)了線粒體膜電位。敏感的JC-1染料以電勢(shì)依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi),正常情況下為聚合物狀態(tài),產(chǎn)生紅色熒光,線粒體處于異常狀態(tài),JC-1則分解為單體,發(fā)綠色熒光,線粒體膜電位的去極化程度可以通過(guò)紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來(lái)衡量。如圖1B所示,MC-LR作用48 h后,細(xì)胞內(nèi)紅色熒光逐漸減弱,綠色熒光逐漸增強(qiáng),聚合物逐漸解離成單體。通過(guò)計(jì)算,空白對(duì)照組的膜電位比較高,紅/綠色平均熒光強(qiáng)度比值為2.93±0.53,而毒素處理組比值逐漸降低,分別為:2.48±0.29,1.67±0.43,1.53±0.36(P＜0.05),影像學(xué)圖片和計(jì)算的數(shù)據(jù)共同表明線粒體膜電位去極化。綜合以上結(jié)果,說(shuō)明MC-LR導(dǎo)致線粒體功能受到損害。

注:不同劑量(2.5～10 nmol/L)MC-LR處理小鼠原代肝細(xì)胞48 h;A:ATP水平與對(duì)照組比較,*P＜0.05;B:JC-1染色激光共聚焦拍照;與對(duì)照組相比,*P＜0.05。圖1 MC-LR引起肝細(xì)胞線粒體損傷Note.Hepatocytes were treated with 2.5～10 nmol/L MC-LR for 48 h.A.Comparison of ATP level in cells subjected to the indicated treatments,*P＜0.05.B.Representative confocal imaging of cells treated with the indicated treatments.Compared with normal control group,*P＜0.05.Figure 1 Effect on mitochondrial function of hepatocytes induced by MC-LR

2.2 MC-LR造成肝細(xì)胞DNA損傷

采用彗星實(shí)驗(yàn)和8-OHdG水平檢測(cè)評(píng)價(jià)MC-LR對(duì)肝細(xì)胞DNA的損傷作用。通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)影像通過(guò)觀察DNA彗尾形狀和遷移模式,可判斷DNA雙鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生斷裂,從單個(gè)細(xì)胞水平評(píng)估細(xì)胞的DNA損傷。研究中,如圖2A所示,對(duì)照組細(xì)胞核為圓形,未出現(xiàn)拖尾,其頭部的熒光強(qiáng)度高,MC-LR處理后,單個(gè)細(xì)胞核拖尾增大,頭部與尾部所占比例發(fā)生變化,且隨著處理毒素濃度增加,拖尾明顯變長(zhǎng),體積變大。分析DNA百分比含量(圖2B),MC-LR處理后,細(xì)胞核尾部DNA百分比的顯著增加,相反的,頭部DNA百分比逐步降低。進(jìn)而該研究檢測(cè)了另一個(gè)重要指標(biāo)的尾力矩(olive tail moment,OTM),如圖2C,從單個(gè)細(xì)胞水平上進(jìn)行測(cè)量,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的OTM為5.72±3.56,隨著毒素濃度增加,OTM最高增加到47.96±2.92(10 nmol/L,P＜0.05)。8-OHdG作為DNA損傷的生物學(xué)標(biāo)記[11],當(dāng)細(xì)胞發(fā)生損傷其濃度急劇升高,為了檢測(cè)DNA損傷的發(fā)生情況,該研究檢測(cè)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中8-OHdG的含量。圖2D實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)梯度濃度的MC-LR處理48 h后,培養(yǎng)基中8-OHdG水平變化范圍從1.02±0.03倍(2.5 nmol/L組,P＜0.05)增加到1.51±0.07(10 nmol/L組,P＜0.05),均高于對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MC-LR促使細(xì)胞DNA雙鏈斷裂,并使8-OHdG高表達(dá),導(dǎo)致DNA損傷。

2.3 MC-LR通過(guò)p53調(diào)控線粒體功能損傷作用

DNA損傷往往造成p53表達(dá)增加,為探索p53表達(dá)情況,通過(guò)Western Blot對(duì)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,5 nmol/L MC-LR處理組的肝細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)量相較于對(duì)照組水平上調(diào)(圖3A),而經(jīng)過(guò)p53特異性抑制劑pft-α預(yù)處理組的p53表達(dá)量有所恢復(fù)。以上結(jié)果說(shuō)明MC-LR可促進(jìn)p53表達(dá)增加,這一作用可以被pft-α抑制。

注:不同劑量(2.5～10 nmol/L)MC-LR處理小鼠原代肝細(xì)胞48 h;A:彗星實(shí)驗(yàn)圖;B:頭/尾部DNA含量百分比;C:尾力矩;D:8-OHdG濃度;與對(duì)照組相比較,*P＜0.05。圖2 MC-LR造成的DNA損傷情況Note.Hepatocytes were treated with 2.5～10 nmol/L MC-LR for 48 h.A.Effect of MC-LR on single cell subjected to the indicated treatments.B.Percentage of tail DNA/head DNA.C.Olive tail moment.D.MC-LR treatment resulted in a increase in the 8-OHdG levels.Compared with normal control group,*P＜0.05.Figure 2 Effect of MC-LR on DNA damage

為了進(jìn)一步驗(yàn)證p53對(duì)線粒體功能的影響,該課題選取p53抑制劑pft-α對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,然后使用5 nmol/L MC-LR進(jìn)行染毒處理,48 h后檢測(cè)胞內(nèi)ATP水平和Δψm。研究結(jié)果顯示(圖3B),MC-LR處理組胞內(nèi)ATP水平為對(duì)照組細(xì)胞的0.62±0.16倍(P＜0.05),顯著性降低,而pft-α預(yù)處理組ATP水平為對(duì)照組的0.95±0.09倍(P＞0.05)相較于對(duì)照組未發(fā)生明顯波動(dòng)。另外,通過(guò)觀察激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,如圖3D所示,相較于MC-LR處理組,pft-α預(yù)處理組的紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng),綠色熒光減弱。對(duì)聚合物呈現(xiàn)的紅色熒光和單體呈現(xiàn)的綠色熒光變化情況進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)pft-α預(yù)處理組紅色/綠色平均熒光強(qiáng)度比值明顯高于MC-LR處理組,但略低于對(duì)照組,說(shuō)明pft-α預(yù)處理組Δψm去極化程度低(圖3C)。以上結(jié)果表明,DNA損傷導(dǎo)致p53水平上調(diào),從而誘發(fā)線粒體功能障礙。

注:pft-α預(yù)處理小鼠原代肝細(xì)胞,加毒素48 h后;A:p53蛋白表達(dá);B:pft-α處理前后的ATP水平;C:JC-1染色,細(xì)胞內(nèi)紅/綠平均熒光強(qiáng)度的比值;D:JC-1染色激光共聚焦拍照;與MC-LR處理組相比,*P＜0.05。圖3 p53表達(dá)及pft-α在線粒體功能損傷中的作用Note.Primary mice hepatocytes were pre-treated with pft-α,and then treated with tox for 48 h.A.Comparison of p53 expression of cells with the indicated treatments.B.ATP levels of either pft-α-preconditioning or without pft-α on mitochondrial function.C.JC-1 stain,the intracellular red/green fluorescence intensity.D.Representative confocal imaging of cells treated with the indicated treatment.Compared with MC-LR group,*P＜0.05.Figure 3 p53 protein level and the role of pft-α in mitochondrial dysfunction

3 討論

小鼠原代肝細(xì)胞暴露于不同濃度的MC-LR毒素中發(fā)生了線粒體功能障礙,可能與其誘導(dǎo)的DNA損傷,募集p53表達(dá)增加有關(guān)。

藍(lán)藻水華向水體釋放過(guò)量的次生代謝產(chǎn)物——生物毒素,強(qiáng)烈肝毒性的MC-LR毒素通過(guò)有機(jī)陰離子和膽汁酸的多特異性運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)入肝細(xì)胞[12],攝入過(guò)量的MC-LR造成肝損傷,肝衰竭,嚴(yán)重可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[13-15],受到廣泛的毒理學(xué)研究。肝實(shí)質(zhì)性細(xì)胞是肝的功能型細(xì)胞,也是各種因素所致肝損傷的主要靶細(xì)胞。該研究在小鼠原代肝細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的,因?yàn)樵渭?xì)胞具有體內(nèi)的肝細(xì)胞相似活性,存在完整的轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)[16],并且前期研究中發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞比細(xì)胞株對(duì)毒素更加敏感[5],可以更好地還原MC-LR的作用過(guò)程,是研究MC-LR對(duì)肝影響的理想模型。根據(jù)前期的研究,MC-LR(0～100 nmol/L)處理小鼠肝原代肝細(xì)胞48 h后,肝細(xì)胞存活率百分比曲線呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)依賴型,由曲線計(jì)算出MC-LR對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的IC50值為26 nmol/L。這些數(shù)據(jù)表明,小鼠原代肝細(xì)胞對(duì)MC-LR的處理高度敏感,當(dāng)MC-LR的濃度達(dá)到一定水平時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。該研究實(shí)驗(yàn)采用低劑量2.5～10 nmol/L作為MC-LR的研究濃度。

線粒體作為產(chǎn)生ATP的主要基地,滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的能量需求,同時(shí)參與細(xì)胞凋亡、自噬過(guò)程,穩(wěn)定的線粒體膜電位有利于維持細(xì)胞正常生理功能[17-18]。一些蛋白組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)在MC-LR誘導(dǎo)下,線粒體中NADH脫氫酶相關(guān)蛋白豐度發(fā)生變化,進(jìn)而影響氧化磷酸化進(jìn)程[19-20]。另外的報(bào)道證明MC-LR能夠抑制ATP合酶的功能,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量異常進(jìn)而促使細(xì)胞死亡[21-22]。Majsterek等[23]報(bào)道,線粒體的形態(tài)學(xué)改變是MC-LR導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。肝是人體主要代謝器官,線粒體是物質(zhì)與能量代謝中心,線粒體功能障礙參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[24-26],因此研究線粒體功能正常與否具有重要意義。MC-LR進(jìn)入肝細(xì)胞后,線粒體作為易損靶點(diǎn),迅速受到影響。通過(guò)圖1結(jié)果,發(fā)現(xiàn)MC-LR處理的肝細(xì)胞內(nèi),ATP水平呈濃度依賴性快速下降,膜電位檢測(cè)探針JC-1染色結(jié)果為紅色/綠色平均熒光強(qiáng)度比值下降,與激光共聚焦顯微鏡圖像結(jié)果一致,說(shuō)明線粒體膜電位去極化,以此判斷MC-LR導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙。研究報(bào)道包括動(dòng)物體內(nèi)和體外多種細(xì)胞株的試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)MC-LR有確切的基因毒性,比如小鼠體內(nèi)、人外周血淋巴細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞株在內(nèi)的DNA雙鏈發(fā)生斷裂造成DNA損傷[27-28]。圖2結(jié)果顯示,肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)MC-LR處理48 h后,損傷標(biāo)記物8-OHdG增多,影像學(xué)圖片顯示細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的拖尾,作為評(píng)估DNA損傷程度的尾力矩也呈毒素濃度依賴性增加,由此可見(jiàn)DNA損傷程度隨MC-LR濃度增加而增加。這一結(jié)果與過(guò)去在動(dòng)物體內(nèi)以及不同細(xì)胞株中的研究結(jié)果一致[29-30]。在機(jī)制方面的相關(guān)研究中,線粒體功能異常往往被認(rèn)定為氧化應(yīng)激損傷造成[31],而越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體功能障礙和DNA損傷后p53積聚亦有相關(guān)性[32-33]。生理情況下,p53維持低濃度穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)DNA受損時(shí),p53基因迅速被激活,清除減少,高濃度聚集在胞內(nèi),一部分p53進(jìn)入線粒體引發(fā)線粒體障礙,觸發(fā)凋亡[32,34]。為了揭示MC-LR造成線粒體功能障礙的機(jī)制,該研究還檢測(cè)了p53表達(dá)情況,Western Blot結(jié)果表明MC-LR促使肝細(xì)胞DNA損傷后,募集p53,而特異性轉(zhuǎn)錄抑制劑pft-α可減弱其敏感性,仍舊維持在低表達(dá)狀態(tài)。p53是機(jī)體應(yīng)對(duì)DNA損傷的天然防護(hù)屏障,具有雙向調(diào)節(jié)作用,通過(guò)修復(fù)損傷的DNA使細(xì)胞存活,或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡消除損傷的細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),這一選擇主要是基于其翻譯后修飾調(diào)控[35]。該研究為了探究p53在線粒體功能方面的作用,使用pft-α預(yù)先處理肝細(xì)胞,然后用5 nmol/L MC-LR染毒,48 h后檢測(cè)線粒體功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體中ATP水平回升,Δψm得以恢復(fù)到本底70%水平,證明p53可調(diào)控線粒體功能。

MC-LR對(duì)肝毒性的研究頗多,但是具體的機(jī)制仍處于探索階段。雖然目前發(fā)現(xiàn)MC-LR可造成DNA損傷,促進(jìn)p53基因表達(dá),但鮮有將p53與線粒體功能聯(lián)系起來(lái)。該研究著眼于肝細(xì)胞線粒體損傷方面,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53對(duì)線粒體功能的影響,試圖從線粒體方面揭示MC-LR的毒性作用機(jī)制。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)提示積聚的p53參與線粒體功能調(diào)控,但也存在一定的不足之處,比如p53如何影響線粒體功能,是否與線粒體信號(hào)通路產(chǎn)生交集,這些值得進(jìn)一步深入探討,也是該課題后續(xù)研究方向。