常用小鼠、大鼠腸道菌群比較研究

黃樹武,閔凡貴,王靜,羅銀珠,何麗芳,陳梅玲,潘金春

(廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所,廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510663)

近年來,隨著新一代基因測序技術(shù)、生物信息學(xué)分析工具和腸道微生物多組學(xué)的迅速發(fā)展,腸道菌群成為當(dāng)今科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1-4]。目前研究已證實(shí),腸道菌群與人體的肥胖和糖尿病代謝性疾病[5-6],炎癥性腸病[7],胃腸道癌癥[8],心腦血管疾病[9-10]以及自身免疫性疾病[11]等具有密切相關(guān)性。而實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠作為研究腸道菌群的重要工具動物,因動物來源、品種品系、性別年齡以及不同腸道腸段等多種因素的差異,導(dǎo)致其自身宿主背景的腸道菌群有所區(qū)別,況且目前對腸道菌群的影響因素分析不夠全面,缺乏相關(guān)背景數(shù)據(jù),導(dǎo)致對相關(guān)腸道菌群研究的動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或?qū)嶒?yàn)結(jié)果分析產(chǎn)生一定影響。本研究通過對常用品系的150只大、小鼠腸道菌群的高通量測序分析,剖析其腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)與豐度,揭示腸道菌群的多樣性與差異性,分析宿主腸道菌群的相關(guān)影響因素,為腸道菌群研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(粵)2018-0002】,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】和南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(粵)2016-0041】三家實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)單位(分別用代號SY、BWL、NFY表示)購買150只SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠,包括小鼠品系KM、C57BL/6J、BALB/c、NIH和大鼠品系SD、Wistar,具體信息見表1。所有實(shí)驗(yàn)操作都在實(shí)驗(yàn)動物使用設(shè)施【SYXK(粵)2016-0122】中進(jìn)行,設(shè)施環(huán)境指標(biāo)滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010要求,實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所動物管理和使用委員會審查(編號:IIACUC2020105),遵循動物福利和相關(guān)倫理要求。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠的信息Table 1 Information of experimental mice and rats

1.1.2 主要試劑與儀器

QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司,貨號51504),Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mix(NEB公司,貨號M0536L),DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司,貨號3427)等,各種試劑均在有限期內(nèi)使用。生物安全柜(德國,Biometra型),PCR超凈工作臺(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司,SW-CJ-1F型),L96G梯度型PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,L96G型),電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

在潔凈生物安全柜里,對110只6～8周齡的小鼠和大鼠無菌操作采集糞便樣本于無菌無DNA酶/RNA酶的1.5 mL EP管中,小鼠糞便重量為50～100 mg,大鼠糞便重量為100～200 mg,并對其中10只NIH品系小鼠安樂死后解剖取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸六段不同的腸段內(nèi)容物50～100 mg于EP管中。另外,對40只1周齡、2周齡、3周齡、5周齡的NIH品系小鼠,同樣采集糞便樣本于EP管中,采集完后立即將所有樣本凍存于-80℃冰箱里。動物糞便樣本編號以動物編號記錄,而動物十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸的腸道內(nèi)容物樣本分組編號以雌性I1_a、I1_b、I1_c、I1_d、I1_e、I1_f,雄性I2_a、I2_b、I2_c、I2_d、I2_e、I2_f來記錄。

1.2.2 樣本擴(kuò)增

根據(jù)試劑盒說明書,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit對樣本進(jìn)行基因提取,提取的核酸作為DNA模板。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物序列341F:5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’,805R:5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’,擴(kuò)增的產(chǎn)物長度為465 bp。PCR反應(yīng)體系為樣本DNA 50 ng,Phusion? Hot Start Flex 2X Master Mixart Version 12.5 μL,前后引物(1 μmol/L)各2.5 μL,后補(bǔ)加無菌水到25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性30 s,98℃變性10 s,54℃退火30 s,72℃延伸45 s,反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán),后72℃延伸10 min,最后吸取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢查產(chǎn)物質(zhì)量。

1.2.3 高通量測序及生物信息學(xué)分析

通過構(gòu)建16S rRNA全長文庫,使用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺進(jìn)行測序,獲得測序數(shù)據(jù)后利用overlap將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過濾,得到高質(zhì)量的cleandata,接著調(diào)用DADA2(divisive amplicon denoising algorithm)對序列進(jìn)行去噪,相當(dāng)于以100%相似度聚類,然后去冗余,得到Feature(特征),再與16S數(shù)據(jù)庫SILVA(Release132)和NT-16S進(jìn)行序列比對,得到樣本中物種注釋信息,進(jìn)而對樣本腸道菌群的分類構(gòu)成與多樣性及差異性分析,并生成相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 樣本內(nèi)物種Alpha多樣性分析

本研究獲得6～8周齡的KM、C57BL/6J、BALB/c、NIH四種品系小鼠70份糞便樣本,SD、Wistar兩種品系大鼠40份糞便樣本,1周齡、2周齡、3周齡、5周齡NIH品系小鼠40份糞便樣本,以及6～8周齡NIH小鼠十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸共6個(gè)腸段的60份腸道內(nèi)容物樣本。

通過對所有樣本的16S rDNA高通量測序后,相同組別內(nèi)的5份動物樣本的腸道菌群差異性很小,按照分組原則進(jìn)行聚類分析,且對樣本內(nèi)物種的豐富度與均勻度進(jìn)行Alpha多樣性分析,繪制Simpson圖與Good’s Coverage圖(見圖1),觀察到Simpson圖中所有樣本曲線均趨于平緩,說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種,樣本的測序深度充分,測序數(shù)據(jù)合理;而Good’s Coverage圖中曲線都趨近于1,說明樣本內(nèi)物種的豐富度和均勻度足夠,樣本內(nèi)物種具有多樣性。

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與影響因素分析

2.2.1 不同來源單位、品種品系和性別的大小鼠腸道菌群分析

注:A:Simpson圖;B:Good’s Coverage圖。圖1 樣本內(nèi)物種Alpha多樣性分析Note.A.Simpson diagram.B.Good’s Coverage diagram.Figure 1 Alpha diversity analysis of sample species

在門分類上,四種品系小鼠與兩種品系大鼠的糞便樣本腸道菌群主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、Epsilonbacteraeota門和疣微菌門(Verrucomicrobia),前三者占據(jù)90%以上(圖2A)。在屬分類上,腸道菌群物種多樣性程度高,主要為未分類的Muribaculaceae屬、毛螺菌屬NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、另 枝 菌 屬(Alistipes)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、Muribaculum屬、乳 桿 菌屬(Lactobacillus)7種菌屬(圖2B)。

圖2 不同來源單位、品種品系和性別的大、小鼠腸道菌群在門與屬分類水平上的豐度柱狀圖Figure 2 Histogram of the abundance of intestinal flora of rats and mice from different source units,breeds,strains and genders at the level of phylum and genus classification

采用Circos圈圖分析樣本與物種共線性關(guān)系以及優(yōu)勢物種的分布情況,并對各樣本間的物種豐度進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(圖3),可見不同樣本間有所交叉并形成四個(gè)大類群,動物來源不同可造成腸道菌群物種組成存在差異,如:BWL單位的F1和F2,G1和G2組樣本代表的SD、Wistar大鼠腸道菌群相似性較高,而與SY單位的E2和E1,NFY單位的H2和H1組樣本代表的SD、Wistar大鼠腸道菌群存在一定差異性,后者未分類的Muribaculaceae屬所占相對豐度比例比前者的高;對于同一SY單位中A1和A2、K1和K2、I1和I2、C1和C2組所代表的KM、BALB/c、NIH和C57BL/6品系小鼠腸道菌群相似度較高,但與BWL單位的同種品系小鼠存在差異性;BWL單位中B1和B2、J2和J1、D1和D2組所代表的KM、BALB/c和C57BL/6品系小鼠腸道菌群亦無明顯差異性;另外,通過對比小鼠與大鼠品種腸道菌群中優(yōu)勢菌屬,發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群中存在較高豐度的Alloprevotella屬,而BWL單位F1和F2,G1和G2的大鼠腸道菌群中未分類的Muribaculaceae屬相對豐度較低,但G1和F1有更高豐度的Bacteroides屬;NFY單位的H2和H1有更高豐度的未分類Bacteroidetes屬。最后,通過對所有同一來源單位、同一品種品系、不同性別大小鼠樣本間腸道菌群兩兩比較,其布雷柯蒂斯相異度(bray-curtis diatance)比較接近,未發(fā)現(xiàn)存在明顯差異性。

注:Circos圈圖左側(cè)代表物種,右側(cè)代表樣本組,不同顏色代表不同的分類學(xué)門類和樣本分組。圖3 樣本與物種關(guān)系Circos圈圖與樣本間PCoA分析Note.The left side of the Circos circle represents species,and the right side represents sample groups.Different colors represent different taxonomic categories and sample groups.Figure 3 Sample-species relationship Circos circle diagram and PCoA analysis

2.2.2 不同年齡小鼠腸道菌群分析

通過對1周齡、2周齡、3周齡和5周齡NIH小鼠糞便樣本分組聚類與PCoA分析(圖4),發(fā)現(xiàn)各年齡段的雌、雄性小鼠腸道菌群優(yōu)勢菌屬種類和相對豐度存在差異性。首先,可觀察到I3和I4,I5和I6,I7和I8,I9和I10兩兩樣本組間的布雷柯蒂斯相異度(bray-curtis diatance)最近,其腸道菌群物種構(gòu)成和相對豐度無明顯差異性,說明性別對1～5周齡的雌雄小鼠腸道菌群影響較小。而隨著小鼠年齡的增長,腸道菌群是一個(gè)動態(tài)發(fā)展變化的過程,物種的種類數(shù)量逐漸增多,且相對豐度發(fā)生著不同的變化。小鼠從出生開始,1周齡左右便有腸道菌群的出現(xiàn),種類最少,多樣性較低,以Lactobacillus屬,鏈球菌屬(Streptococcus)占據(jù)主要地位,且此時(shí)雌性小鼠相對雄性小鼠具有較高豐度的假單胞菌屬(Pseudomonas);到2周齡,物種的種類明顯增多,多樣性豐富,Lactobacillus屬仍占絕對優(yōu)勢地位,但其相對豐度減少,出現(xiàn)未分類的Muribaculaceae屬,Alloprevotella屬、Bacteroides屬和Proteus屬等多種優(yōu)勢菌屬;3周齡時(shí),另外觀察到出現(xiàn)明顯增多的Akkermansia屬、Eisenbergiella屬、Bilophila屬和瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium_9)等菌屬;5周齡時(shí),則以未 分 類 的Muribaculaceae屬、Lactobacillus屬、Alloprevotella屬、Bacteroides屬、Muribaculum屬 和Lachnospiraceae_NK4A136_group為主,且發(fā)現(xiàn)此時(shí)雌性小鼠相對雄性小鼠有較高豐度的未分類的Muribaculaceae屬,但只有較低豐度的未分類的Clostridiales屬和Alistipes屬。進(jìn)而把5周齡與6～8周齡的NIH小鼠腸道菌群比較分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)周齡段的小鼠腸道菌群相似度較高,主要優(yōu)勢菌屬一致,說明到5周齡后,腸道菌群已趨于相對穩(wěn)定共生的狀態(tài)。

圖4 不同周齡NIH小鼠腸道菌群豐度柱狀圖與PCoA分析Figure 4 Histogram of intestinal flora abundance in NIH mice of different ages and PCoA analysis

2.2.3 不同腸段和糞便樣本的小鼠腸道菌群分析

通過對NIH小鼠十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸六個(gè)不同腸段內(nèi)容物樣本以及糞便樣本的菌群進(jìn)行比較分析(圖5),發(fā)現(xiàn)小鼠十二指腸、空腸和回腸的腸道菌群物種種類相對較少,主要為Lactobacillus屬、未 分 類 的Muribaculaceae屬、Candidatus_arthromitus屬、Pseudomonas屬,且不同性別的小鼠腸道菌群中Candidatus_arthromitus屬所占豐度存在一定差異性。小鼠盲腸和結(jié)腸中腸道菌群物種種類數(shù)量明顯增多,多樣性豐富且物種豐度比較均衡,主要為未分類的Muribaculaceae屬、Lactobacillus屬、螺 桿 菌 屬(Helicobacter)、Muribaculum屬、Alloprevotella屬、杜 氏 桿 菌 屬(Dubosiella)、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes屬八種菌屬。然而直腸中以螺桿菌屬(Helicobacter)為主,小部分是Lactobacillus屬、未分類的Muribaculaceae屬和Pseudomonas屬。

圖5 不同腸段和糞便樣本的NIH小鼠腸道菌群豐度柱狀圖與PCoA分析Figure 5 Histogram and PCoA analysis of intestinal flora abundance of NIH mice from different intestinal segments and stool samples

根據(jù)糞便樣本與不同腸段腸道菌群比較分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)分組中I1與I1_e,I2與I2_e樣本的布雷柯蒂斯相異度(bray-curtis diatance)最近,說明糞便樣本與結(jié)腸的腸道菌群構(gòu)成相似性最高。

2.2.4 腸道菌群內(nèi)物種相關(guān)性分析

對屬水平分類上的微生物豐度,比較樣本中優(yōu)勢菌群物種之間的相關(guān)性,繪制出熱圖以及網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)。由此可知,優(yōu)勢菌屬M(fèi)uribaculum屬與未分類的Muribaculaceae屬、Alistipes屬、Alloprevotella屬存在一定的正相關(guān)關(guān)系。Lactobacillus屬與Streptococcus屬、Proteus屬和葡萄球菌屬(Staphylococcus)存在一定的正相關(guān)關(guān)系,而與Lachnospiraceae_NK4A136_group、未分類的Muribaculaceae屬存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。這提示隨著腸道內(nèi)環(huán)境的變化,腸道菌群優(yōu)勢菌屬存在互相共生共存與競爭抑制的情況。

注:A:熱圖;B:網(wǎng)絡(luò)圖。圖6 腸道菌群內(nèi)物種相關(guān)性分析Note.A.Heat map.B.Network map.Figure 6 Species correlation analysis in the intestinal flora

3 討論

腸道菌群作為人和動物腸道內(nèi)最復(fù)雜多樣化的微生物群落,在維持宿主腸道結(jié)構(gòu)和功能、促進(jìn)營養(yǎng)代謝、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和預(yù)防病原菌等方面發(fā)揮著重要的作用[12-14]。本研究通過對4種品系小鼠和兩種品系大鼠腸道菌群聚類分析,發(fā)現(xiàn)小鼠與大鼠腸道菌群具有豐富的多樣性,主要有未分類的Muribaculaceae屬、毛螺菌屬NK4A136、另枝菌屬、擬普雷沃菌屬、擬桿菌屬、Muribaculum屬和乳桿菌屬7種菌屬。相同來源的同個(gè)品種動物的腸道菌群相似度較高,小鼠相對大鼠的腸道菌群具有較高豐度的擬普雷沃菌屬,兩者優(yōu)勢菌屬存在一定差異性,而品系、性別對其影響作用較小。究其原因,考慮主要是小鼠或大鼠的基因型決定了其本身品種品系的遺傳基礎(chǔ),在不同飼養(yǎng)生存環(huán)境作用下,影響著宿主不同的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成[15]。隨著小鼠年齡的增長,腸道菌群是一個(gè)競爭選擇動態(tài)發(fā)展變化的過程。小鼠從出生開始,物種的種類和數(shù)量逐漸增多且慢慢趨于穩(wěn)定,相對豐度發(fā)生著相應(yīng)變化。由早期主要的乳桿菌屬和鏈球菌屬慢慢演變?yōu)槲捶诸惖腗uribaculaceae屬、乳桿菌屬、擬普雷沃菌屬、擬桿菌屬和Muribaculum屬多種優(yōu)勢菌屬共生共存的狀態(tài)。腸道菌群的改變,其優(yōu)勢菌屬間互利共存與競爭抑制,又反作用著宿主腸道結(jié)構(gòu)與功能,最終形成一個(gè)腸道菌群穩(wěn)態(tài)[15-16]。

本研究還發(fā)現(xiàn),小鼠十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸不同腸段菌群分布是不均衡的。隨著不同腸段內(nèi)環(huán)境的變化,胃到結(jié)腸各腸段的微生物數(shù)量快速遞增,呈現(xiàn)一定的差異性變化,由十二指腸、空腸和回腸種類較少的乳桿菌屬、未分類的Muribaculaceae屬、Candidatus_arthromitus屬和假單胞菌屬,演變?yōu)槊つc結(jié)腸中菌群種類和數(shù)量明顯增多的螺桿菌屬、Muribaculum屬、擬普雷沃菌屬、杜氏桿菌屬等,而直腸則以螺桿菌屬為主。另外,小鼠糞便樣本與其結(jié)腸的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性最高,而結(jié)腸微生物菌群在動物腸道腸段中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能[17],提示可以通過糞便樣來間接評價(jià)結(jié)腸腸道菌群的變化。此外,本研究對于動物運(yùn)輸過程中應(yīng)激狀態(tài)對腸道菌群的影響也值得我們注意,長期慢性應(yīng)激會導(dǎo)致動物腸道菌群的變化[18]。大量研究也證實(shí),腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能還受到飲食[19-20]、抗生素[21]、益生菌和益生元[22]等多種外源因素的影響。

本研究揭示了動物來源相同的實(shí)驗(yàn)小鼠或大鼠的腸道菌群間相似性最高,而實(shí)驗(yàn)小鼠與大鼠的腸道菌群因品種不同存在一定差異性。在一定的飼養(yǎng)生存環(huán)境下,實(shí)驗(yàn)小鼠的年齡和腸段是決定其腸道菌群多樣性與差異性的主要內(nèi)源性因素,而品系、性別對其腸道菌群的影響作用較小。鑒于多種宿主本身因素影響腸道菌群的變化,實(shí)驗(yàn)者研究腸道菌群時(shí),須盡量選擇同一飼養(yǎng)環(huán)境下,同一品種品系的實(shí)驗(yàn)動物,且考慮不同腸段與糞便樣本腸道菌群的異同,以及樣本采集方法的合理性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),控制多因素變量來觀察單一因素的變化,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。