腫瘤轉移前微環(huán)境動物模型的構建與評價方法研究進展

申明,陳彥文,李楊,楊玲玲,梁乾坤,明海霞*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學,蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究所,蘭州 730000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)全球最新癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計[1]:2020年全球新發(fā)癌癥病例1929萬例,死亡996萬例。盡管目前隨著靶向治療及免疫治療逐漸完善,但癌癥死亡率仍居高不下,導致腫瘤患者死亡的主要原因就是轉移。自Paget[2]1889年初次提出“種子和土壤”假說用于解釋腫瘤的轉移,在此基礎上,Kaplan等[3]提出了轉移前微環(huán)鏡(pre-metastatic niche,PMN)這一概念,認為原發(fā)腫瘤來源的分泌因子在轉移前特異性的到達待轉移組織器官中,通過相互作用適應性的改變其微環(huán)境,從而構建一個適合原發(fā)腫瘤轉移的生長環(huán)境,誘使循環(huán)中漂浮的原發(fā)腫瘤細胞在此處定植、聚集、增殖,最終形成轉移病灶。目前,轉移前微環(huán)境的研究模型以肺為主[4]。本文將圍繞腫瘤微環(huán)境形成機制及肺轉移前微環(huán)境模型構建與評價進行概述。

1 腫瘤轉移前微環(huán)境的形成

腫瘤轉移前微環(huán)境的形成機制比較復雜,主要與腫瘤細胞分泌因子(tumor-derived secreted factors,TDSFs)、抑制性免疫細胞的動員募集以及該組織部位基質成分炎性極化三個因素的相互作用有關。而TDSFs、髓源性抑制細胞(myeloidderived suppressor cells,MDSCs)是腫瘤轉移的關鍵[3,5-6]。

TDSFs可通過直接動員和招募MDSCs來促進轉移前微環(huán)境形成,其中包括促炎因子,如腫瘤細胞壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A),它們會特異性地誘導肺部鈣結合炎性蛋白S100A8/A9(S100 calcium binging protein A8/A9,S100A8/A9)的高表達,形成肺轉移前微環(huán)境。目前作用明確的細胞主要有VEGFR1+造血祖細胞、CD11b+MDSCs。CD11b+MDSCs可以通過表達整合素、多功能蛋白聚糖(Versican)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及在TDSFs作用下分泌多種趨化、炎癥因子來動態(tài)重塑、建立轉移前微環(huán)境,促進腫瘤干細胞特性和上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),從而促進腫瘤發(fā)展[7]。

原位腫瘤細胞產生趨化因子-2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)可招募腫瘤相關巨噬細胞和Treg,同時,CCL2通過與表面的CCR2相互作用增加MDSCs向轉移前微環(huán)境遷移[8]。腫瘤細胞還通過分泌巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)、白 細 胞 介 素(interleukin,IL)-8以及纖溶酶原激活物抑制因子1,激活星形膠質細胞進而分泌IL-6、TNF-α,參與腫瘤血管的構建。在CCL2作用下,CD11b+Ly6C+單個核細胞被招募到肺轉移前微環(huán)境中對局部組織微環(huán)境進行改造從而增加肺轉移。CD11b+Ly6G+Ly6C+粒細胞還可通過產生鈴蟾多樣性肽8(bombina variegate peptide,Bv8)蛋白促進肺轉移前微環(huán)境形成,這些MDSCs是轉移前微環(huán)境形成過程中的關鍵細胞成分[7-8]。由此可見,腫瘤細胞分泌的多種細胞因子,如TNF-α、TGF-β、VEGF-A等,可通過直接動員和招募骨髓中的MDSCs,促進轉移前微環(huán)境的形成。

2 腫瘤的肺轉移微環(huán)境模型

根據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示,肺是腫瘤轉移常見的器官。大約30%的胃癌患者在中后期階段會出現(xiàn)肺轉移,骨肉瘤患者在遠處轉移器官中發(fā)生在肺部的概率高達90%,乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤等均可表現(xiàn)出肺部高轉移率[9-10],因此建立肺轉移前微環(huán)境模型符合臨床環(huán)境。該模型的建立能夠更好的體現(xiàn)在轉移前微環(huán)境中,多種細胞因子對腫瘤轉移過程中不同的調控作用,有助于新型靶向抗腫瘤藥物的設計、開發(fā)。此外,肺轉移前微環(huán)境模型具有操作簡便、成功率高等優(yōu)點,可便于觀察原發(fā)腫瘤轉移的發(fā)生率及后續(xù)發(fā)展,為臨床抗腫瘤治療提供了現(xiàn)實依據(jù),有助于制定可行化方案。

肺轉移前微環(huán)境模型主要包括自發(fā)性轉移模型和實驗性轉移模型。目前,人類腫瘤異種移植模型在臨床前環(huán)境中幫助預測抗腫瘤功效最為常用,通過利用哺乳動物體內微環(huán)境所培養(yǎng)的人源性腫瘤細胞來模擬人類腫瘤的進展,動物的基質細胞、血管網(wǎng)和生長因子為腫瘤細胞提供了天然的異質微環(huán)境[11]。自發(fā)性與誘發(fā)性動物模型通常是由人工誘導的癌癥動物組成,這些模型易于構建,但會存在較大的不確定性。通過移植人腫瘤組織或注射腫瘤細胞系來產生移植的動物模型能夠顯示出更高的可控性和致瘤效率,但不能反應腫瘤轉移的整個生物學進程。

3 動物的選擇及方法

建立實驗動物模型,以試圖捕捉人類腫瘤發(fā)展中復雜的病理過程為目的,長期以來,在臨床前環(huán)境中提供了評估新型抗腫瘤藥物潛力。動物模型能夠較好的闡明哺乳動物生物過程的基本原理,而實驗室小鼠通常是首選的模式生物,由于具有的高度遺傳同源性和特定的無病原體(specific pathogenfree,SPF)維持條件,科學結果的再現(xiàn)性較高,現(xiàn)已在腫瘤定植和轉移模型中廣泛的使用[12]。

3.1 裸鼠

1969年,Rygaard等[13]首次成功地建立了裸鼠-人腫瘤異種移植模型,此模型很大程度上保留了人類腫瘤細胞在組織病理特征以及對抗腫瘤劑的敏感性,降低了實驗和臨床研究之間的差距。選擇裸鼠建立轉移模型,一方面,該小鼠無毛發(fā)覆蓋,能夠可視化觀察腫瘤的發(fā)展,另一方面,由于存在先天性無胸腺、T淋巴細胞的功能缺乏等特點,裸鼠表現(xiàn)出明顯的免疫功能受損,有利于腫瘤細胞的生長、定植和轉移,建立腫瘤模型具有較高的成功率[14]。但其靈敏度較低,而Naomoto等[15]基于這一局限,將BABL/c裸鼠通過尾靜脈注射人結腸癌細胞系RPM14788建立肺轉移前微環(huán)境模型,在注射后的第2天,可在肺間質中觀察到中性粒細胞浸潤形成的炎性微環(huán)境,21 d的小鼠肺組織形成多發(fā)性轉移灶,提示造模成功。該模型具有高度的肺轉移率和可重復性,有助于研究肺轉移途徑且能夠更加方便的評估藥物療效。裸鼠作為標準受體現(xiàn)已被廣泛用于人源腫瘤異種移植模型(patient-derived xenograft,PDX),尤其體現(xiàn)在胃腸癌的高移植率。Wang等[16]通過BALB/c裸鼠尾靜脈注射含人胃腺癌細胞系MGC80-3成功建立肺轉移模型,指出MMP-2、MMP-9在胃癌細胞轉移過程中過度活化,轉移前的微生境中誘發(fā)EMT,其標記物β-連環(huán)蛋白、E-鈣粘蛋白的基因水平降低,而纖連蛋白、波形蛋白和Snail蛋白的表達水平增加。王潔等[17]將臨床所獲胃癌標本移植到BALB/c裸鼠中建立異種移植模型,之后將熒光染劑MHI-148進行腹腔注射,經檢測,微環(huán)境中轉移瘤趨化因子CXCL12、MMP-2和轉移相關IGF1R信號通路等表達上調,最終在小鼠肺組織中可觀察到轉移灶。Li等[18]選擇BALB/c裸鼠,分別通過尾靜脈注射和腹腔注射COL10A1敲除的MKN45胃癌細胞建立了胃癌肺轉移模型,證明敲除COL10A1可降低EMT,下調MMP-2、MMP-9的表達,從而抑制轉移前微環(huán)境的形成,以上兩種方法均成功地建立了胃癌肺轉移前微環(huán)境模型。

3.2 SCID小鼠

Bosma在1993年首次定義了同時缺乏功能性T、B淋巴細胞的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(Server Combined Immune-deficiency,SCID)小 鼠。Knips等[19],首次采用動物模型來研究Merkel細胞多瘤病毒感染對MCC皮膚癌發(fā)生、轉移作用,選擇SCID小鼠肩胛骨皮下注射WaGa和MKL-1皮膚癌細胞,結果顯示與MKL-1細胞相比,WaGa腫瘤在轉移前微環(huán)境中參與炎癥反應、生長因子活性及上調Wnt信號通路,更具有侵襲性,在肺中表現(xiàn)出了更高數(shù)量的自發(fā)性轉移。Otani等[20],通過選擇SCID小鼠分別原位注射A549人肺腺癌細胞、FT821人大細胞肺癌細胞和PC-9人肺腺癌細胞建立肺癌肺轉移前微環(huán)境模型,給予抗癌藥物CDDP和埃羅替尼進行干預。結果僅檢測到A549模型小鼠存在肺轉移,且經CDDP治療后肺部轉移情況并未改善,可能與觀察到的強烈的氟代脫氧葡萄糖(fludeoxyglucose,FDG)攝取有關,此研究中的異種原位移植模型有潛力成為開發(fā)抗癌新療法的基本工具,可用于許多非小細胞肺癌細胞系和抗癌藥物。大量研究表明與裸鼠相比,選擇SCID小鼠建立的腫瘤轉移模型成功率更高,但存在著T、B淋巴細胞滲露的局限性[21]。

3.3 NOD-SCID小鼠

NOD/SCID小鼠是由NOD和SCID小鼠雜交而成,該小鼠患有由T淋巴細胞浸潤和胰島破壞引起的糖尿病,由于小鼠中成熟T、B淋巴細胞的缺失,NK細胞功能受損等先天和適應性免疫的多種缺陷,使它們成為人類造血干細胞和實體瘤移植更好的受體。然而,在NOD/SCID小鼠中仍存在殘留的NK細胞活性[22]。外周血中的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor-cell,CTC)在適合的局部微環(huán)境下進入次級或遠端器官組織形成轉移灶,微環(huán)境中的免疫細胞可經歷表型變化變成促腫瘤表型,協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸以及向遠處的組織器官遷移。闕祖俊等[23],在前期實驗中成功建立了非小細胞肺癌循環(huán)腫瘤細胞系(CTC-TJH-01),通過尾靜脈注射法,將GFP/Luc雙標的CTC-TJH-01細胞系在NODSCID小鼠中成功地構建了肺癌肺轉移前微環(huán)境模型,盡可能模擬臨床術后腫瘤轉移過程,將轉移前微環(huán)境免疫因素歸入評估系統(tǒng),可用于研究免疫療法對腫瘤轉移的抑制作用。Chiou等[24]將A549肺癌細胞通過尾靜脈注射植入NOD-SCID小鼠建立轉移模型,以評估卵泡刺激素在器官轉移中的作用,所有小鼠肺中均可檢測到轉移瘤的形成,發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素可能通過腫瘤細胞和器官微環(huán)境之間的相互作用抑制轉移前微環(huán)境中的血管生成。NOD/SCID小鼠現(xiàn)常用于結直腸癌肺轉移前微環(huán)境模型構建。Hite等[25]選擇NOD-SCID小鼠,通過將熒光素酶標記的HT-29結腸癌細胞采用直腸注射、盲腸壁注射、酸性灌腸等方法成功建立結腸肺轉移模型,結果相較其余兩組,直腸注射組小鼠肺轉移較高且死亡率低,能較好的模擬患者結腸癌的轉移進程,是目前用于患者結腸癌轉移評估最理想的原位轉移模型。實驗室在NOD-SCID小鼠的基礎上,將其與IL-2受體γ缺陷小鼠或Jak3缺陷小鼠雜交,建立了NK細胞功能性缺失的NOD-SCID-IL2rg-/-(NOG/NSG)小鼠[22]。該小鼠主要體現(xiàn)出對人源化組織的高移植率,有研究顯示,將TMD231人乳腺癌細胞分別植入NOD/SCID和NSG小鼠的乳腺脂肪墊中建立乳腺癌肺轉移模型,結果顯示NSG小鼠的成瘤率更穩(wěn)定,且更早發(fā)現(xiàn)肺轉移[26]。Armacki等[27]將Panc1人胰腺癌細胞皮下注射至NSG小鼠中建立胰腺癌肺轉移模型,得出外泌體可調控S100 A mRNA向肺成纖維細胞中轉移,肺轉移灶纖維化增強,粘連蛋白表達增加,從而促進肺轉移前微環(huán)境的形成。為闡明腫瘤干細胞(CSCs)在轉移中的潛在作用,Matsuda等[28]選擇NOG小鼠,將PDAC人胰腺癌細胞通過尾靜脈注射建立了胰腺癌肺轉移模型,且發(fā)現(xiàn)肺中CSC標記物高表達,證實PDAC轉移潛能與CSC和EMT相關。但由于NOG/NSG小鼠飼養(yǎng)環(huán)境嚴格且價格相對高昂,故目前在腫瘤轉移前微環(huán)境的動物模型中鮮少使用。而其他品系在不同癌癥類型中都存在各自的優(yōu)勢,因此仍是建立腫瘤轉移模型重要的資源。

3.4 BABL/c小鼠

BABL/c小鼠對小鼠乳腺腫瘤病毒誘發(fā)的乳腺癌具有高度敏感性,是建立乳腺癌轉移最常用的動物模型。骨肉瘤的脛內原位注射模型,在過去通常被認為是自發(fā)轉移的模型,Maloney等[29]對此提出質疑,通過將K7M2骨肉瘤細胞系脛骨內注射至BALB/c小鼠中,注射后1周,通過肉眼觀察及HE染色均發(fā)現(xiàn)全部小鼠肺部表面有明顯轉移灶,而在第4周,93%的小鼠在骨髓內形成腫瘤組織。并建立了截肢組模型以確定轉移細胞的來源,所得結果均指向該模型應為實驗型轉移模型。脛內注射模型提供了一種可行的造模方法,但存在注射時腫瘤細胞栓塞這一局限。盡管如此,該模型可用于檢查轉移后期階段,如腫瘤細胞外滲及在肺轉移前微環(huán)境中的過度增殖。Warren等[30]通過細胞轉染技術獲得ZsGreen/Luc雙標的4T1細胞和YAP/TAZ敲除細胞分別經尾靜脈注射至BALB/c小鼠中,以測試轉腫瘤移是否需要Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)和具有PDZ結合序列的轉錄共活化因子TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)。經用熒光顯微鏡觀察到發(fā)光信號,提示造模成功,結果顯示對照細胞的小鼠的轉移負荷增加速度明顯快于YAP/TAZ敲除小鼠。為探討乳腺癌肺轉移前微環(huán)境中免疫因子的動態(tài)變化,朱文文等[31]通過尾靜脈注射和皮下注射兩種方法,分別將4T1乳腺癌細胞接種到BABL/c小鼠中,兩種方法均成功建立了乳腺癌肺轉移前微環(huán)境模型,相較于皮下注射法,尾靜脈注射法的轉移過程較為迅速,并測得肺組織中的Th1型細胞因子在尾靜脈組中表現(xiàn)出先升后降的趨勢,在皮下注射組處于較低水平,而Th2型細胞因子在兩組中均表現(xiàn)出升高的趨勢,提示隨著癌癥發(fā)展,可形成免疫抑制微環(huán)境促進腫瘤細胞的轉移。Rashid等[32]將表達熒光素酶基因的4T1-luc2乳腺癌細胞系對BABL/c小鼠分別進行原位移植法與尾靜脈注射法來比較其中的差異,兩種造模方式均可達到理想的成瘤率,并對轉移瘤進行了基因組微陣列分析以評估不同方法所致轉移瘤的基因組圖譜,結果提示尾靜脈法與術后轉移瘤的基因表達沒有顯著差異。這也是尾靜脈法的一大優(yōu)勢,值得一提的是,尾靜脈注射法由于不能實現(xiàn)從原發(fā)腫瘤到轉移病灶的全過程,故此造模方法僅適用于腫瘤發(fā)展的中后期階段的臨床研究。

3.5 C57BL/6小鼠

C57BL/6小鼠是一種最常用的近交系小鼠,由于其在遺傳方面較為穩(wěn)定,往往是轉基因動物模型構建的首選。Hou等[33]將非靶向基因LLC-sgNTC和Atrx缺陷型Lewis細胞系(LLC-sgAtrx)通過尾靜脈注射到C57BL/6小鼠中,結果顯示小鼠肺中均產生了轉移灶。并證明Atrx缺陷促進了轉移前微環(huán)境中T細胞的浸潤,提高了細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand1,PD-L1)和抗原肽-MHC分子復合物Ⅰ類(peptide-major histocompatibility complex class I,pMHCI)在Lewis細胞表面的表達,并增強了T細胞的體外細胞毒性。Zhang等[34]為探討RGDV-吉西他濱對腫瘤轉移的作用途徑,同樣選擇C57BL/6小鼠,將Lewis肺癌細胞注入右腋下皮膚成功建立肺癌肺轉移前微環(huán)境模型。經檢測治療組小鼠血清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)TNF-α、IL-8、MMP-2和MMP-9的表達水平降低,提示RGDV-吉西他濱對轉移前微環(huán)境有抑制作用。該小鼠也是作為研究黑色素瘤經常選擇的動物模型[35]。Fu等[36]尾靜脈注射B16F10-Fluc黑色素瘤細胞與體外活化的Pmel-1 CD8+Teff細胞至C57BL/6小鼠中,對照組小鼠檢測到肺表面有大量轉移結節(jié),而由于免疫記憶,Teff組中CD69、CD25的高表達說明了CD8+T細胞被充分激活。王佳等[37]采用尾靜脈注射將B16F10黑色素瘤細胞分別注射到C57BL/6和巨噬細胞Act1表達被靶向抑制的小鼠(anti-Act1)中成功建立黑色素瘤肺轉移前微環(huán)境模型。相較C57BL/6模型組,anti-Act1小鼠肺組織中的CD45和CD68表達明顯降低,轉移前微環(huán)境中炎癥細胞的浸潤能力被抑制。孟星君等[38]分別采用腹腔注射、皮下注射及尾靜脈注射法將C57BL/6小鼠接種B16F10黑色素瘤細胞,結果顯示尾靜脈組肺部轉移率最高,說明腫瘤細胞主要通過血液循環(huán)途徑實現(xiàn)轉移,轉移前微環(huán)境中血管的生成是主要推動因素。Sohn等[39]將B16F10-shControl細胞和B16F10-shAhnak細胞通過尾靜脈注射至C57BL/6小鼠中,探討橋粒聯(lián)結蛋白(recombinant desmoyokin,AHNAK)在腫瘤轉移過程中的作用,成功建立了黑色素瘤肺前微環(huán)境模型,證明了AHNAK參與TGF-β誘導的EMT,有助于腫瘤細胞的遷徙。關于腫瘤肺轉移前微環(huán)境模型常見的動物選擇及方法如表1所示。

表1 腫瘤肺轉移前微環(huán)境模型動物選擇及造模方法Table 1 Selection of animals and modeling method of the pre-metastasis niche of lung model

4 肺轉移前微環(huán)境模型的評價方法

模型構建是實驗研究進行的前提,現(xiàn)如今隨著技術不斷完善,多種方法可供選擇作為評價模型構建是否成功的指標。當選擇模型時,應當盡可能地選擇與人類癌癥相似的模型為其設計干預療法。例如,動物腫瘤模型發(fā)病機制、進展和分期、病理因素、轉移潛能、腫瘤負荷程度、激素反應性和免疫抑制等與人類是否相似,能否適合針對治療術后環(huán)境中的轉移性疾病的測試療法。在肺轉移前微環(huán)境模型構建中,HE染色法(hematoxylin and eosin stain)是常見的評價手段,所得成功率為100%[40]。熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)現(xiàn)已被廣泛用于細胞生物學、腫瘤學等多種研究,其可作為一種細胞標記物為研究人員提供了檢測基因表達和細胞跟蹤的方法[41]。生物發(fā)光成像是一種高度敏感、高通量的技術,其能夠使實驗動物的疾病進程呈現(xiàn)可視化并對治療效果進行縱向評估,檢測到的光信號作為腫瘤負荷的定量指標,已在許多腫瘤模型中得到驗證[42]。使用熒光作為檢測和量化轉移的方法,能夠更直觀地分析候選基因如何影響腫瘤細胞的轉移、定植,可以給研究人員提供獨立的數(shù)據(jù),提高結果的可信度,然而由GFP轉染引起的細胞損傷可能會導致對實驗結果有一定的誤差,因此在實驗過程中應仔細考慮GFP對細胞的毒性作用。

正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)是近幾年發(fā)展迅速的診斷技術,現(xiàn)已被用于評估腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移過程中的代謝途徑,其原理為放射性標記的正電子發(fā)射斷層掃描底物在生理濃度下進行追蹤,從而可以對腫瘤模型和腫瘤異質性進行無創(chuàng)成像[43]。另外,對腫瘤轉移相關的目標基因及特異性生物標記的定性分析也可作為模型建立的評價指標,通常涉及免疫組化、蛋白印跡分析、實時定量PCR等多種方法。

5 總結和展望

癌癥是目前危害人類健康的主要疾病,其轉移是導致死亡的主要原因之一,“腫瘤轉移前微環(huán)境”的提出無疑是一個突破點,抑制PMNs的形成,對腫瘤的復發(fā)和轉移會有一定的積極作用。癌癥發(fā)展到中后期,原發(fā)性腫瘤不斷增值,器官和組織發(fā)生病理性改變,形成以低氧、低pH、組織高壓為特點的微環(huán)境,在適合的局部微環(huán)境下,存在于外周血中的循環(huán)腫瘤細胞才能“播散”、“定植”、進入次級或遠端器官組織,從而發(fā)展為轉移灶。因此能否對轉移前微環(huán)境進行干預來達到抗腫瘤作用,從而發(fā)現(xiàn)新型藥物及療法,現(xiàn)已成為熱門的研究問題。

續(xù)表1

盡管多數(shù)研究人員認為動物模型能夠提供關于新型免疫療法和藥物等有價值的臨床前信息,但部分腫瘤模型并不能很好地預測人類臨床試驗,存在著因模型建立不充分而導致多種不可控因素的存在,從而影響結果可行性,這也是為什么實驗效果不能在臨床中得到體現(xiàn)。因此,無論采用何種模型來評估新療法,理解每種方法的局限性都是至關重要的。