參苓白術(shù)散對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的療效評價

馬琪,翁與競,李佳,覃施媛,何燕鳳,馬旭東

(1.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;2.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫研究中心,重慶 402460)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性炎癥性腸道疾病,病變多侵襲結(jié)直腸的黏膜及黏膜下層,其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及便血等[1],常反復(fù)發(fā)作,很難痊愈。研究表明,該病可能與環(huán)境因素,基因遺傳等有關(guān)[2-3]。目前普遍認為,UC機體存在腸黏膜炎癥免疫耐受紊亂,腸黏膜免疫反應(yīng)異常激活是UC發(fā)生、發(fā)展的重要因素[4]。近年來,UC的發(fā)病率有持續(xù)升高的趨勢,且致癌風(fēng)險增大[5]。因此,尋找治療UC更為安全有效的藥物顯得尤為迫切。由于傳統(tǒng)中藥具有整體施治、安全可靠、毒副作用小等特點[6],中醫(yī)藥在治療本病方面已經(jīng)具有明顯的天然優(yōu)勢,并且已有大量研究顯示,中藥可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群[7],阻止腸道細菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位,平衡有益菌與細菌病毒,能明顯提高黏膜細胞的再生能力,降低過高的黏膜通透性,從而改善黏膜的屏障功能。

UC證型實證中以大腸濕熱為主,虛證中以脾虛證為主,在虛實夾雜證型中,多以脾虛為基礎(chǔ),并見濕熱、寒濕、氣滯、血瘀[8]。而在臨床上,大腸濕熱證、脾胃氣虛證及脾虛夾濕熱證三證型臨床多見,符合中醫(yī)學(xué)理論的病初起多屬于實證,發(fā)展日久耗傷正氣則形成虛證或虛實夾雜證的疾病發(fā)展觀[9]。本研究探討的脾虛泄瀉型UC的病機關(guān)鍵為脾虛濕盛,運化失健[10]。中醫(yī)認為,脾喜燥而惡濕,外來濕邪,最易困阻脾土,以致升降失調(diào),清濁不分,水谷雜下而發(fā)生泄瀉,即所謂“無濕不成泄”,故《雜病源流犀燭·泄瀉源流》說:“濕盛則飧泄,乃獨由于濕耳?！币虼?健脾溫腎、行氣導(dǎo)滯是中藥治療UC的重要原則[11]。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,是中醫(yī)治療脾虛夾濕證的經(jīng)典方劑,由黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗、蓮子、炙甘草組成,諸藥配伍,益氣健脾,滲濕止瀉[12]。常用于治療脾胃虛弱,體倦乏力,飲食消化不良,泄瀉,食少便溏等的脾虛泄瀉證。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)小鼠UC模型,探究參苓白術(shù)散對其治療效果。本研究采用DSS誘導(dǎo)的UC模型的方法,該造模方法操作簡單、方便重復(fù)、實用性強,成功率高[13]。DSS是一種水溶性硫酸多聚糖,其會增加腸道黏膜通透性、導(dǎo)致上皮細胞壞死、擾亂腸道微菌群、影響機體免疫應(yīng)答,從而誘導(dǎo)UC[14-16]。本研究通過預(yù)實驗對比不同濃度DSS(3%、3.5%、4%)誘導(dǎo)的小鼠UC模型的差異,篩選出誘導(dǎo)小鼠UC最優(yōu)濃度為3.5%水溶液,該濃度下,UC癥狀最典型,死亡率最低。DSS的給藥方式選擇為自由飲用。最后根據(jù)體重、大便性狀、便潛血、結(jié)腸長度、結(jié)腸損傷評分、DAI評分、結(jié)腸組織病理學(xué)評分等指標,判斷UC模型的建立是否成功以及評價參苓白術(shù)散的治療效果。本研究探討了參苓白術(shù)散對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的治療效果,希望能為參苓白術(shù)散治療UC提供科學(xué)依據(jù)并為抗?jié)冃滤幯兄频於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

36只6周齡SPF級雄性BALB/c小鼠,體重約18～20 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】。飼養(yǎng)于西南大學(xué)動物實驗室【SYXK(渝)2019-0003】,飼養(yǎng)期間各組小鼠為自由飲水、采食。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在25℃左右。所有操作均符合西南大學(xué)動物實驗倫理學(xué)要求(審批號:IACUC-20190620-02)。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉(DSS)(S0948,MW:36000-50000,MP Biomedicals),聯(lián)鄰甲苯胺(C10659221,上海麥克林),無水乙醇(20190818,成都金山化學(xué)),柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)(C10865372,上海麥克林生化),過氧化氫(200506,四川省伊潔士),冰醋酸(20170501,重慶川東化工)。

參考《太平惠民和劑局方》中參苓白術(shù)散的配方組成,藥材蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、黨參、甘草、白術(shù)、山藥購自重慶榮昌布美大藥房,經(jīng)西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院劉娟教授鑒定,蓮子為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥成熟種子,薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix.Lacryma-jobi L.var.mayuen(Roman)Stapf的干燥成熟種仁,砂仁為為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實,桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根,白扁豆為豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟種子,茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根,甘草為豆科植物甘草Clycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根莖,白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖,山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppasita Thunb.的干燥根莖。

1.2 方法

1.2.1 藥物及試劑的制備

參苓白術(shù)散浸膏制備:將藥物按蓮子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗(炒):扁豆(炒):茯苓、黨參、甘草、白術(shù)(炒)、山藥=2∶3∶4的比例稱取50 g,先后以八倍水、六倍水煎煮1 h,紗布過濾,合并濾液,蒸發(fā)濃縮至1 g/mL,再分別以65%、75%乙醇先后醇沉24 h,均取上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀75°C 106 r/min,蒸發(fā)至1 g/mL,烘干,4℃保存。灌胃時以純凈水溶解配置,高劑量12.56 g/(kg·d),中劑量6.28 g/(kg·d),低劑量3.14 g/(kg·d)。

柳氮磺胺吡啶溶液配制:用純凈水配置成0.045 g/mL的溶液,劑量為0.45 g/(mL·d)。

DSS配制:稱取葡聚糖硫酸鈉溶解于水中,配成3.5%的濃度。

聯(lián)鄰甲苯胺冰醋酸溶液配制:取0.5 g聯(lián)鄰甲苯胺,加入等體積的無水乙醇和冰醋酸,定容至50 mL,置于棕色瓶中,用錫紙包裹,避光4℃保存。

1.2.2 分組及動物的處理

采用隨機數(shù)字表法把小鼠分為6只/組。A組:參苓白術(shù)散高劑量組;B組:參苓白術(shù)散中劑量組;C組:參苓白術(shù)散低劑量組;D組:柳氮磺胺吡啶治療組;E組:空白對照組;F組:模型組。A、B、C、D、F組飲用3.5% DSS水溶液,E組飲用純凈水。每天更換新鮮飲水,連續(xù)1周。A、B、C、D、E、F組分別以高劑量參苓白術(shù)散、中劑量參苓白術(shù)散、低劑量參苓白術(shù)散、柳氮磺胺吡啶、純水、純水按10 mL/kg灌胃,共1周。

1.2.3 觀察指標

記錄小鼠每日體重變化、死亡率、糞便性狀和隱血。其中,采用鄰甲苯胺法檢測小鼠糞便隱血,鄰甲苯胺法為1983年中華醫(yī)學(xué)會全國臨床檢驗方法學(xué)術(shù)討論會推薦的方法,利用血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有過氧化物酶活性,催化過氧化氫釋放出新生態(tài)氧,使其顯色,此方法操作較為簡單易行[17]。檢測方法如下[18]:取小鼠糞便,涂壓于濾紙上,在糞便上滴加2～3滴15%鄰甲苯胺冰醋酸溶液;再滴加2～3滴3% H2O2;立即觀察結(jié)果,在2 min內(nèi)顯藍褐色為陽性。參照表1的標準評分。

表1 隱血檢測判斷標準Table 1 Criteria for occult blood detection

1.2.4 結(jié)直腸長度的測量

給藥結(jié)束后,處死小鼠,剖腹,取盲腸末端至肛門段的結(jié)直腸,測量其自然長度并記錄。

1.2.5 結(jié)腸組織黏膜損傷評分

沿腸系膜縱行剪開,平鋪于玻璃板上,用冷生理鹽水漂洗干凈,肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷程度,依Cooper方法進行評分,標準參照表2[19]。

表2 結(jié)腸黏膜肉眼觀察評分標準Table 2 Scoring criteria for eye observation of colonic mucosa

1.2.6 疾病活動指數(shù)(DAI)評分

參照表3的標準評估小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)。DAI=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+大便隱血分數(shù))/3。依Cooper方法進行評分,標準如表3[19]。

表3 DAI評分標準Table 3 DAI scoring criteria

1.2.7 臟器系數(shù)

依次稱取小鼠心、肝、脾、腎的臟器重量,計算各臟器與其體重之比值即為對應(yīng)的臟器系數(shù)。

1.2.8 結(jié)腸組織病理學(xué)評分

將小鼠整個結(jié)腸泡入10%中性福爾馬林固定后,用石蠟包埋,制成切片(約5 μm)后進行伊紅-美藍(HE)染色制成病理切片。采用Leica DFC顯微拍照系統(tǒng)對病理切片進行觀察與拍照并進行組織病理學(xué)評分,評分內(nèi)容包括腸上皮細胞損傷程度和炎癥浸潤程度,結(jié)果可以用于評價結(jié)腸組織損傷程度。評分標準如表4[20]。

表4 組織病理學(xué)評分標準Table 4 Histopathological scoring criteria

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般狀況

各組小鼠在實驗前精神狀態(tài)、體重及大便性狀等各方面均正常。造模期間,除E組小鼠外,其他各組小鼠隨著造模進程逐漸出現(xiàn)懶動、拱背,毛發(fā)無光澤,嗜臥扎堆,且部分小鼠因腹瀉便血嚴重表現(xiàn)出消瘦、站立不穩(wěn),肛周粘附有干涸的血便。給予治療的A、B、C組小鼠精神狀況隨治療深入逐漸好轉(zhuǎn),其中參苓白術(shù)散中劑量組小鼠的腹瀉、便血情況顯著減輕。

2.2 體重變化

在治療期間,B、C、E組小鼠體重先上升,后逐漸趨于平穩(wěn),A、D、F組的小鼠體重一直維持在低水平波動。與F組相比較,E組體重明顯升高,差異極具顯著性(P＜0.01),C組次之,差異極具顯著性(P＜0.01),B組小鼠體重較F組高,差異具有顯著性(P＜0.05)(見圖1)。

2.3 小鼠結(jié)腸黏膜損傷眼觀評分

F組小鼠炎癥病變主要靠近肛門段結(jié)腸,病變黏膜充血、水腫、糜爛和潰瘍形成。B組小鼠與E組小鼠的結(jié)腸評分相近,表明B組恢復(fù)較好,與F組比較,差異具有顯著性(P＜0.05)。A、C、D組無顯著性差異(見圖2)。

注:與F組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,與E組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。(下圖同)圖1 小鼠每日體重變化折線圖Note.Compared with group F,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with group E,#P＜0.05,##P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Daily weight change line chart of mice

注:A:結(jié)腸黏膜病變;B:結(jié)腸黏膜損傷眼觀評分。圖2 結(jié)腸黏膜病變及結(jié)腸黏膜損傷眼觀評分Note.A.Mucosal lesion of colon.B.Score of colonic mucosal injury by eye observation.Figure 2 Lesion and injury score by eye observation of colonic mucosal

2.4 小鼠結(jié)直腸長度

小鼠結(jié)腸長度縮短是UC的重要特征[21]。與E組相比,F組結(jié)腸長度明顯縮短(P＜0.05)。與F組相比,A組、B組、C組、D組DSS所致小鼠結(jié)腸縮短的現(xiàn)象均有不同程度的緩解。尤其B,C組(P＜0.05)效果最為明顯,治療效果好于其他組(見圖3)。

圖3 小鼠結(jié)腸長度變化Figure 3 Changes of colonic length in mice

2.5 隱血及肉眼便血

糞便帶血是UC的臨床特征之一。與E組相比,F組隱血及便血最嚴重(P＜0.05)。A組、C組及D組隱血及便血情況逐日嚴重,與F組相比情況較好。B組自第3天后,隱血及血便的情況逐漸好轉(zhuǎn),直到第6、7天,隱血檢測呈陰性。說明A組、B組、C組及D組對DSS誘導(dǎo)的UC有所改善,但與F組相比,A組、C組及D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,只有B組差異極具顯著性(P＜0.01),治療效果最明顯(見圖4)。

圖4 隱血及肉眼便血評分Figure 4 Occult blood and naked eye hematochezia score

2.6 DAI評分

F組的DAI評分基本呈上升趨勢,顯著高于E組。最后2 d,F組的疾病活動指數(shù)比其他組都高,說明各組的治療有一定的效果。B組、E組基本在同一水平上波動,表明B組治療效果最好(見圖5)。

圖5 小鼠DAI評分Figure 5 DAI score in mice

2.7 臟器系數(shù)

結(jié)果顯示,肝、脾、心、腎的臟器系數(shù)無顯著性差異,說明UC導(dǎo)致的病變不會影響肝、脾、心、腎的臟器功能。(見圖6)。

圖6 小鼠臟器系數(shù)Figure 6 Organ coefficient of mice

2.8 結(jié)腸組織病理切片及病理學(xué)評分

病理切片結(jié)果表明UC導(dǎo)致模型組小鼠結(jié)腸腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞,正常形態(tài)消失,上皮細胞及皺襞變矮,整個腸壁變薄,黏膜下層有炎性細胞浸潤,組織病理學(xué)評分與空白組相比差異具顯著性(P＜0.01)。同時,參苓白術(shù)散治療組小鼠結(jié)腸黏膜比較完整。但D組結(jié)腸腸黏膜上皮破損嚴重,腸黏膜有顯著糜爛,黏膜層、黏膜下層有大量炎性細胞浸潤,腸壁顯著增厚。說明參苓白術(shù)散對UC的治療有一定效果,同時柳氮磺胺吡啶治療UC未取得療效(見圖7)。

注:A:小鼠結(jié)腸組織HE染色病理切片;B:組織病理學(xué)評分。圖7 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(n=3)Note.A.Representative images of colon pathologic damages with hematoxylin and eosin(HE)staining.B.Histopathological score.Figure 7 Histopathological examination of colon tissues in mice(n=3)

3 討論

UC是一種黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥,病變主要在結(jié)腸和直腸,臨診主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排血便等。《醫(yī)學(xué)心悟》指出:“濕多成五瀉,瀉之屬濕明矣。然有濕熱,有寒濕,有積食,有脾虛,有腎虛,皆能致瀉,宜分而治之?！眳④甙仔g(shù)散有健脾滲濕之功,是用于治療脾虛泄瀉型UC的有效方劑。臨床上已有報道用參苓白術(shù)散的加減方或聯(lián)合方治療UC,且有較好的療效。研究表明中醫(yī)藥辨證治療UC,尤其是慢性階段的UC治療,有藥物副作用較小、療效顯著的優(yōu)勢[22]。

DSS會破壞腸道上皮細胞的完整性,擊破腸道的機械屏障,誘發(fā)急性UC,主要表現(xiàn)為腹瀉、潰瘍、直腸出血和粒細胞浸潤[14]。同時,還能對腸道生物屏障即腸道菌群產(chǎn)生影響,破壞有益菌的生存環(huán)境,導(dǎo)致腸內(nèi)細菌和病毒移位,使細菌病毒更容易進入上皮細胞而造成上皮損傷[7]。還因為DSS有抗凝作用,所以能延緩血液凝固[15-16],造成腸道出血。此外,還與機體免疫應(yīng)答失調(diào)有關(guān)。因此,本研究采用DSS自由飲水的方式建立UC小鼠模型,給予不同劑量的參苓白術(shù)散治療,通過對小鼠進行臨床表現(xiàn)及結(jié)腸相關(guān)指標量化評分,綜合評價了參苓白術(shù)散對UC小鼠的治療效果。

因DSS引起小鼠結(jié)腸長度的縮短,結(jié)腸黏膜損傷,糞便帶血,糞便稠度改變是UC的重要特征[21],故本實驗觀測小鼠的糞便性狀,隱血及肉眼血便,結(jié)腸長度,結(jié)腸黏膜損傷,組織病理學(xué)以及一些可以參考的相關(guān)體征。實驗數(shù)據(jù)表明,B組(P＜0.05)、C組(P＜0.01)、E組(P＜0.01)體重均明顯較F組高,B組結(jié)腸黏膜損傷眼觀評分明顯低于F組(P＜0.05),F組結(jié)腸長度與E組相比明顯縮短(P＜0.05)且B組、C組與F組相比小鼠結(jié)腸縮短的現(xiàn)象得到緩解(P＜0.05),F組與E組相比隱血及便血情況明顯嚴重(P＜0.05)且B組相較于F組隱血及便血情況明顯改善(P＜0.01),F組的DAI評分基本呈上升趨勢且顯著高于E組,同時B組與E組DAI評分波動相近,另外組織病理學(xué)結(jié)果顯示F組與E組相比結(jié)腸病變嚴重(P＜0.01),同時參苓白術(shù)散治療組病理切片與空白組較為相近。以上數(shù)據(jù)說明高中低劑量的參苓白術(shù)散均能改善UC小鼠臨床癥狀,其中參苓白術(shù)散中劑量治療組治療效果最佳。另外,本實驗中D組治療效果不明顯,可能是由于柳氮磺胺吡啶幾乎不溶于水,配成的溶液極易發(fā)生沉淀,導(dǎo)致灌胃后小鼠極難吸收,且藥物沉積于胃腸致其運化失職、升降失調(diào),以致傷食泄瀉,影響進食和給藥,進一步加劇了結(jié)腸炎炎癥,因而D組體重一直處于較低的狀態(tài),且結(jié)腸粘膜損傷眼觀評分、糞便隱血、DAI指數(shù)一直不見降低,病理切片也顯示結(jié)腸病變較為嚴重。因此,D組應(yīng)用羧甲基纖維素鈉來配置柳氮磺胺吡啶以增強溶解與吸收。

4 結(jié)論

本研究通過采用量化的UC臨床疾病活動指數(shù)評分、結(jié)腸眼觀評分、組織病理學(xué)評分及觀察臨床表現(xiàn)綜合評價了參苓白術(shù)散對DSS誘導(dǎo)的小鼠急性UC的治療效果。結(jié)果表明,參苓白術(shù)散浸膏可以有效改善UC小鼠的癥狀,其中參苓白術(shù)散中劑量組治療效果最好。