• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵巢癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)篩選

    2021-03-09 06:53:50余展鵬
    中國臨床新醫(yī)學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌調(diào)控通路

    余展鵬, 彭 亮, 姜 巧

    卵巢癌是婦科最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,病死率位居女性惡性腫瘤的第8位[1]。卵巢癌起病隱匿,大部分患者確診時(shí)已為晚期,預(yù)后不佳,5年生存率僅為30%~40%[2,3]。為此,尋找與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)聯(lián)的基因,對其診斷、治療和預(yù)后評估具有重要意義。本研究擬使用生物信息學(xué)方法,整合分析高通量基因表達(dá)(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫和癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫及KMplot(Kaplan-Meier Plotter)等多個(gè)數(shù)據(jù)庫中與卵巢癌的相關(guān)數(shù)據(jù)集,以篩選卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1數(shù)據(jù)來源與差異基因(differentially expressed ge-nes,DEGs)篩選 (1)在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,按以下設(shè)置檢索:(“ovarian neoplasms”[MeSH terms] or ovarian cancer[all fields]) and “homo sapiens”[porgn] and (“gse”[filter] and “expression profiling by array”[filter])。根據(jù)檢索結(jié)果下載得到GSE54388、GSE105437、GSE40595數(shù)據(jù)集,3份數(shù)據(jù)均由GPL570平臺完成、上傳。它們分別包含6例、5例及8例正常卵巢上皮樣本(正常組)和16例、10例及31例卵巢癌樣本(卵巢癌組)。使用R 3.5.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理:以log FC>1.5或log FC<-1.5且校正P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選正常組與腫瘤組的DEGs,并選出其中的共有部分,作為本研究的候選基因。(2)從Xena數(shù)據(jù)庫[4](https://xena.ucsc.edu/)下載TCGA與GTEx(Genotype-Tissue Expression)的合并數(shù)據(jù)集(卵巢癌組=426,正常組=88),分析兩組候選基因的表達(dá)情況,進(jìn)一步確定正常卵巢組織與卵巢癌組織的DEGs。

    1.2DEGs與患者預(yù)后關(guān)系分析 使用KMplot數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)卵巢癌數(shù)據(jù)集分析DEGs對患者預(yù)后的影響,以其自動計(jì)算各DEGs的cut-off值將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,并通過數(shù)據(jù)庫缺省設(shè)置分別繪制各組Kaplan-Meier生存曲線,分析DEGs與患者生存預(yù)后的關(guān)系,篩選卵巢癌關(guān)鍵基因。

    1.3卵巢癌關(guān)鍵基因的表達(dá)數(shù)據(jù)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中檢索“Ovarian cancer”,下載380例卵巢癌組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)集及與之對應(yīng)的臨床信息。剔除石蠟包埋標(biāo)本,整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,分析卵巢癌關(guān)鍵基因表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系。

    1.4卵巢癌關(guān)鍵基因調(diào)控機(jī)制的初步分析

    1.4.1 基因集富集分析 選取TCGA下載的卵巢癌組織RNA-Seq數(shù)據(jù),運(yùn)行GSEA 3.0(Gene Set Enrichment Analysis 3.0)軟件,以兩個(gè)卵巢癌關(guān)鍵基因[ARX(Aristaless Related Homeobox),F(xiàn)AM150B(Family with Sequence Similarity 150 Member B)]的中位表達(dá)值為界,分為高表達(dá)組(190例)和低表達(dá)組(189例),設(shè)置Hallmark Gene Sets為參照基因集,進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路聚類分析。

    1.4.2 卵巢癌關(guān)鍵基因與免疫相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析 使用在線工具TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/),選取“Ovarian Serous Cystadenocarcinoma”數(shù)據(jù)集,設(shè)置“tumor purity”為校正變量,分別使用GSEA富集得到的免疫系統(tǒng)相關(guān)信號通路的關(guān)鍵分子與ARX和FAM150B基因的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。

    1.4.3 卵巢癌關(guān)鍵基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分別檢索“ARX”和“FAM150B”及與之相關(guān)的蛋白(即1.4.2步驟獲得的信號通路的關(guān)鍵分子),構(gòu)建ARX和FAM150B的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

    2 結(jié)果

    2.1卵巢癌DEGs的篩選結(jié)果 從GEO數(shù)據(jù)庫下載的GSE54388、GSE105437、GSE40595數(shù)據(jù)集中分別篩選到450、925、1097個(gè)DEGs。根據(jù)其上調(diào)、下調(diào)情況進(jìn)行韋恩圖分析,得到10個(gè)下調(diào)的候選基因及4個(gè)上調(diào)的候選基因。見表1。使用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)集中的卵巢癌組織及正常卵巢組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)對DEGs進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示有13個(gè)基因?yàn)槁殉舶┑暮蜻x關(guān)鍵基因。見圖1。

    2.2卵巢癌DEGs與患者生存預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 使用KMplot數(shù)據(jù)庫分析以上13個(gè)DEGs與卵巢癌患者總生存期的關(guān)系,按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01,結(jié)果顯示,在下調(diào)的9個(gè)DEGs中,ADH1B低表達(dá)組的生存預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)組(P<0.01);而ARX、FAM150B低表達(dá)組預(yù)后顯著差于高表達(dá)組(P<0.01)。在上調(diào)的4個(gè)DEGs中,COL4A1高表達(dá)組預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)組(P<0.01)。見圖2。

    表1 卵巢癌DEGs基因

    圖1 卵巢癌DEGs驗(yàn)證結(jié)果圖

    圖2 卵巢癌DEGs與患者生存預(yù)后的生存曲線圖

    2.3ARX和FAM150B表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 結(jié)合2.2的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)ARX和FAM150B表達(dá)量的下調(diào),可能會導(dǎo)致患者的預(yù)后不良,鑒此,本研究選取ARX和FAM150B作進(jìn)一步研究。結(jié)果顯示,ARX的表達(dá)量與卵巢癌患者腫瘤直徑具有關(guān)聯(lián)性(P<0.05),腫瘤直徑越大,ARX表達(dá)量越低。FAM150B的表達(dá)量與患者的年齡及腫瘤直徑具有關(guān)聯(lián)性(P<0.05),年齡或腫瘤直徑越大,F(xiàn)AM150B表達(dá)量越低。見圖3。

    圖3 ARX和FAM150B表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果圖

    2.4ARX及FAM150B調(diào)控機(jī)制的初步分析結(jié)果 使用TCGA卵巢癌RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA PATHWAY富集分析,結(jié)果顯示,ARX低表達(dá)組較高表達(dá)組富集的通路有24條;FAM150B低表達(dá)組較高表達(dá)組富集的通路有14條。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),ARX與FAM150B低表達(dá)組富集到的通路中分別有12條和8條與免疫系統(tǒng)相關(guān)。整理以上免疫系統(tǒng)相關(guān)信號通路的關(guān)鍵分子,并使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析其與ARX和FAM150B表達(dá)量的相關(guān)關(guān)系。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,ARX與PIK3R2(Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 2)的表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-6及PIK3CD的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。FAM150B與PIK3R1的表達(dá)量呈正相關(guān),與VAV1、PIK3CA、RAC2、MAPK1的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。使用STRING數(shù)據(jù)庫分別構(gòu)建ARX與IL-6、PIK3R2、PIK3CD,以及FAM150B與VAV1、PIK3CA、RAC2、PIK3R1、MAPK1的互作網(wǎng)絡(luò),預(yù)測結(jié)果顯示,ARX可能可以通過EGFR對IL-6、PIK3R2及PIK3CD進(jìn)行調(diào)控,F(xiàn)AM150B可能可以通過PLXNA2對VAV1、PIK3CA、RAC2、PIK3R1、MAPK1進(jìn)行調(diào)控。見圖4。

    表2 ARX與免疫相關(guān)基因的Spearman相關(guān)分析結(jié)果

    表3 FAM150B與免疫相關(guān)基因的Spearman相關(guān)分析結(jié)果

    圖4 ARX和FAM150B與免疫相關(guān)基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖

    3 討論

    3.1本研究通過聯(lián)合GEO、TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ARX與FAM150B基因在卵巢癌中顯著下調(diào),且它們的表達(dá)量與腫瘤體積及患者預(yù)后密切相關(guān),表達(dá)量越低,腫瘤體積越大,患者預(yù)后越差(P<0.01)。ARX基因定位于Xp22.1-Xp21.3之間,其包含5個(gè)外顯子,編碼含562個(gè)氨基酸的ARX蛋白,該蛋白為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。既往研究[5]表明其在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用,近來也有研究顯示ARX基因與胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、前列腺癌、卵巢癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FAM150B基因定位于2p25.3,其包含11個(gè)外顯子,編碼含152個(gè)氨基酸的FAM150B蛋白,該蛋白為ALK(anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase)和LTK(leukocyte receptor tyrosine kinase)的配體。既往研究[6]表明其在細(xì)胞的增殖、分化中起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,但目前國內(nèi)外與之相關(guān)的研究較少,僅發(fā)現(xiàn)其與成神經(jīng)細(xì)胞瘤和鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

    3.2本研究使用TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù),將獲取數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組與低表達(dá)組進(jìn)行GSEA PATHWAY富集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的低表達(dá)組均大比例地富集到與免疫系統(tǒng)相關(guān)的信號通路。因此,我們推測這兩個(gè)基因的下調(diào)可能會影響機(jī)體的免疫功能。鑒此,本研究進(jìn)一步使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析ARX基因及FAM150B基因和與之相關(guān)免疫信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在ARX基因下調(diào)的狀態(tài)下,IL-6和PIK3CD基因的表達(dá)量上調(diào),PIK3R2基因的表達(dá)量下調(diào);而在FAM150B基因下調(diào)的狀態(tài)下,VAV1、RAC2、MAPK1及PIK3CA基因的表達(dá)量上調(diào),PIK3R1基因的表達(dá)量下調(diào)。其中PIK3R1和PIK3R2基因編碼的蛋白為PI3K的調(diào)節(jié)亞基,PIK3CA和PIK3CD基因編碼的蛋白為PI3K的催化亞基[7]。調(diào)節(jié)亞基的下調(diào)或催化亞基的上調(diào)都會導(dǎo)致PI3K的活性增強(qiáng),從而減弱抗腫瘤免疫效應(yīng)[8]。Vav1基因編碼的蛋白是一種鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子,能促進(jìn)Rho家族的Rac2表達(dá)量增加[9],而Rac2又可以進(jìn)一步上調(diào)MAPK1的表達(dá)[10]。MAPK1基因編碼蛋白ERK2作為MAPK信號通路上的重要分子,其上調(diào)可使MAPK信號通路激活,繼而上調(diào)PD-L1的表達(dá)量,使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受[11,12]。IL-6基因編碼的IL-6作為炎癥因子,在腫瘤微環(huán)境中不但能抑制樹突細(xì)胞的遷移能力,減少其與T細(xì)胞的有效接觸[13],還能下調(diào)Th1細(xì)胞MHC Ⅱ類分子的表達(dá),并減少IFN-γ和IL-2的釋放,從而降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性[14],使腫瘤細(xì)胞能夠逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)。

    3.3為了探討ARX和FAM150B調(diào)控上述基因的機(jī)制,本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫繪制了它們的互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示ARX可能通過TUBA1A及EGFR對IL-6、PIK3R2、PIK3CD進(jìn)行調(diào)控;FAM150B可能通過PLXNA2對VAV1、PIK3CA、RAC2、PIK3R1、MAPK1進(jìn)行調(diào)控。EGFR作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的至關(guān)重要的基因,目前已被廣泛研究[15],而對于TUBA1A和PLXNA2的研究則相對較少,但近來亦有研究[16,17]表明TUBA1A和PLXNA2也是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)控基因。TUBA1A基因編碼的α-微管蛋白是微管蛋白家族中重要的一員,是參與細(xì)胞分裂和運(yùn)動所必需的蛋白。Zhu等[18]研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌中TUBA1A可作為miR-15a-5p和miR-15b-5p的靶點(diǎn),參與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲過程的調(diào)控。另外,PLXNA2既往一直只被認(rèn)為在機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,但目前也有越來越多的研究強(qiáng)調(diào)了其在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移過程中的調(diào)控功能。Tian等[19]分析基因芯片發(fā)現(xiàn),與原發(fā)或局限性的前列腺癌相比,在轉(zhuǎn)移性的前列腺癌組織中,PLXNA2基因顯著上調(diào)。該研究還通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PLXNA2參與了前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控。因此,通過對上述結(jié)果的分析,我們推測在卵巢癌中下調(diào)的ARX和FAM150B可能可以通過調(diào)控TUBA1A、EGFR、PLXNA2,進(jìn)而對IL-6、PIK3R2、PIK3CD、VAV1、PIK3CA、RAC2、PIK3R1及MAPK1進(jìn)行調(diào)控,從而使機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)減弱,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸或者產(chǎn)生免疫耐受,促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

    綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ARX和FAM150B在卵巢癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài),且它們的表達(dá)量和患者的預(yù)后密切相關(guān),經(jīng)過進(jìn)一步分析,我們還發(fā)現(xiàn)ARX和FAM150B能對一系列基因進(jìn)行調(diào)控,從而減弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在此研究中,所有用于分析的基因芯片原始數(shù)據(jù)均來自于同一平臺,研究方法一致,數(shù)據(jù)客觀,因此認(rèn)為本研究能在一定程度上為ARX和FAM150B在卵巢癌中的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    卵巢癌調(diào)控通路
    卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
    Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義
    順勢而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
    microRNA與卵巢癌轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認(rèn)識
    在线观看美女被高潮喷水网站| 999精品在线视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品人妻久久久影院| 桃花免费在线播放| 少妇人妻 视频| 亚洲怡红院男人天堂| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久久电影| 免费观看在线日韩| 久久精品人人爽人人爽视色| 伦精品一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 尾随美女入室| 亚洲成色77777| 国产在线免费精品| 亚洲成色77777| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线看a的网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品国产一区二区久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩亚洲欧美综合| 99热这里只有是精品在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 青春草视频在线免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 日本色播在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久免费观看电影| 久久亚洲国产成人精品v| 99视频精品全部免费 在线| 在线看a的网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 十八禁网站网址无遮挡| 国产午夜精品一二区理论片| 新久久久久国产一级毛片| 999精品在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产精品国产精品| 高清毛片免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 青春草视频在线免费观看| kizo精华| 欧美最新免费一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品无大码| 少妇人妻久久综合中文| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品少妇久久久久久888优播| videossex国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产精品无大码| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产av精品麻豆| 国产一区二区在线观看av| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 插逼视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲国产精品国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产成人精品无人区| videos熟女内射| 天天影视国产精品| 青春草视频在线免费观看| 国产不卡av网站在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 人体艺术视频欧美日本| 大话2 男鬼变身卡| 日本wwww免费看| 在线观看三级黄色| 国产精品一国产av| 国产精品无大码| 国产视频首页在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 能在线免费看毛片的网站| 婷婷成人精品国产| 成年女人在线观看亚洲视频| 九草在线视频观看| 2022亚洲国产成人精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 草草在线视频免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产色片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 超碰97精品在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| a级片在线免费高清观看视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 视频区图区小说| 男女边吃奶边做爰视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产熟女午夜一区二区三区 | 夫妻性生交免费视频一级片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲国产av新网站| 人妻少妇偷人精品九色| 91精品一卡2卡3卡4卡| 街头女战士在线观看网站| 久久97久久精品| 中文字幕免费在线视频6| 国产av精品麻豆| 高清av免费在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品美女久久av网站| 日本wwww免费看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲在久久综合| 国产一区二区在线观看av| 一本一本综合久久| 在线精品无人区一区二区三| 男人操女人黄网站| 国产高清国产精品国产三级| 一本大道久久a久久精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线观看人妻少妇| 美女视频免费永久观看网站| 欧美成人午夜免费资源| 免费大片黄手机在线观看| 国产永久视频网站| 久久久久视频综合| 精品少妇久久久久久888优播| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品少妇内射三级| 最近的中文字幕免费完整| 国产在线一区二区三区精| 免费看不卡的av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩大片免费观看网站| 久久韩国三级中文字幕| 在线观看免费视频网站a站| 制服诱惑二区| 女性被躁到高潮视频| 久久av网站| 人人妻人人澡人人看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 男的添女的下面高潮视频| 天美传媒精品一区二区| 成人综合一区亚洲| 99热国产这里只有精品6| 国产在视频线精品| 午夜视频国产福利| 美女国产视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 亚洲经典国产精华液单| 日韩强制内射视频| 国产高清三级在线| 午夜av观看不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区免费毛片| 久久久久久久久久成人| 亚洲av.av天堂| 51国产日韩欧美| 久久鲁丝午夜福利片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久国产精品麻豆| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成人二区视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲国产av新网站| 韩国av在线不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲成人一二三区av| 黑丝袜美女国产一区| 伦理电影免费视频| 中文字幕免费在线视频6| 欧美+日韩+精品| av黄色大香蕉| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产欧美亚洲国产| 91国产中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 精品少妇久久久久久888优播| 热re99久久精品国产66热6| 免费看不卡的av| 18在线观看网站| 色哟哟·www| 国产精品久久久久久精品电影小说| 丝袜喷水一区| 免费观看av网站的网址| 成人国产av品久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲国产欧美在线一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人精品无人区| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 久久久精品区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产一区二区在线观看日韩| 下体分泌物呈黄色| 欧美三级亚洲精品| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品不卡视频一区二区| 一级a做视频免费观看| 自线自在国产av| 亚洲精品亚洲一区二区| a级毛片黄视频| 国产精品.久久久| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品一区蜜桃| 69精品国产乱码久久久| 一级黄片播放器| 日本免费在线观看一区| 丝袜美足系列| 亚洲精品一二三| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 在线看a的网站| 国产成人a∨麻豆精品| 国产午夜精品一二区理论片| 少妇的逼好多水| av线在线观看网站| 街头女战士在线观看网站| 美女国产高潮福利片在线看| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久久久精品精品| 午夜福利,免费看| 大码成人一级视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产伦精品一区二区三区视频9| 麻豆乱淫一区二区| 久久热精品热| 国产老妇伦熟女老妇高清| 色94色欧美一区二区| 9色porny在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 女人久久www免费人成看片| 国产色爽女视频免费观看| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av男天堂| 日韩免费高清中文字幕av| 日本欧美视频一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费高清在线观看日韩| 一级毛片 在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| h视频一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 最近最新中文字幕免费大全7| 大香蕉97超碰在线| 久久久精品免费免费高清| 一区在线观看完整版| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av二区三区四区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 青春草视频在线免费观看| 99热网站在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 一级,二级,三级黄色视频| 国内精品宾馆在线| 在线天堂最新版资源| 久久97久久精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一区亚洲一区在线观看| videos熟女内射| 日韩精品有码人妻一区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久99精品国语久久久| 午夜激情福利司机影院| 一级,二级,三级黄色视频| 五月天丁香电影| 插逼视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 精品少妇久久久久久888优播| 免费看不卡的av| 少妇的逼好多水| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本wwww免费看| 飞空精品影院首页| 国产 一区精品| 三级国产精品片| 中文天堂在线官网| 水蜜桃什么品种好| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 色视频在线一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 日本vs欧美在线观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩亚洲高清精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看www视频免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av女优亚洲男人天堂| av.在线天堂| 亚洲综合精品二区| 在线天堂最新版资源| 一级毛片我不卡| 久久久久久久久久久免费av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品少妇内射三级| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 一区二区三区四区激情视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成人手机| 精品国产露脸久久av麻豆| 丰满少妇做爰视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av电影中文网址| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 看免费成人av毛片| 99久久综合免费| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 欧美三级亚洲精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线看a的网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 我的老师免费观看完整版| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男女免费视频国产| 亚洲国产色片| 18在线观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 大香蕉久久成人网| 蜜桃国产av成人99| 国产一区二区在线观看日韩| 国产在线一区二区三区精| 日本vs欧美在线观看视频| 新久久久久国产一级毛片| 日日撸夜夜添| 欧美97在线视频| 一级片'在线观看视频| 黄色欧美视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 综合色丁香网| av有码第一页| 午夜91福利影院| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩亚洲欧美综合| 午夜日本视频在线| 日本黄色片子视频| 最新中文字幕久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女国产视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费人成在线观看视频色| 欧美bdsm另类| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 午夜激情av网站| 99国产综合亚洲精品| 好男人视频免费观看在线| 九九在线视频观看精品| 国产片特级美女逼逼视频| 伊人亚洲综合成人网| 一级黄片播放器| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人免费观看mmmm| 久久狼人影院| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品一二三| 久久久久久久精品精品| 在线播放无遮挡| 各种免费的搞黄视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| videossex国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 水蜜桃什么品种好| 国产精品.久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 岛国毛片在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产av影院在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成人毛片60女人毛片免费| 大片免费播放器 马上看| 国产成人freesex在线| 99久久综合免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久婷婷青草| 爱豆传媒免费全集在线观看| 自线自在国产av| 国产 一区精品| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| videossex国产| 亚洲中文av在线| 99视频精品全部免费 在线| 久久青草综合色| 日韩成人伦理影院| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产一区二区在线观看av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲综合色惰| 午夜视频国产福利| 日日爽夜夜爽网站| 制服丝袜香蕉在线| 日本黄色片子视频| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久午夜综合久久蜜桃| av有码第一页| 国产片特级美女逼逼视频| 只有这里有精品99| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产成人精品婷婷| 亚洲久久久国产精品| 午夜福利视频精品| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲av男天堂| 久久久欧美国产精品| 日日爽夜夜爽网站| 满18在线观看网站| 婷婷成人精品国产| 97超视频在线观看视频| av视频免费观看在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 波野结衣二区三区在线| 午夜激情av网站| 一区在线观看完整版| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品三级大全| 黄色一级大片看看| 最近手机中文字幕大全| 只有这里有精品99| 新久久久久国产一级毛片| 国国产精品蜜臀av免费| 久久鲁丝午夜福利片| 我要看黄色一级片免费的| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 777米奇影视久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 边亲边吃奶的免费视频| 特大巨黑吊av在线直播| 五月玫瑰六月丁香| 99re6热这里在线精品视频| 国模一区二区三区四区视频| 午夜日本视频在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产成人精品福利久久| 丝袜脚勾引网站| 亚洲天堂av无毛| 欧美精品高潮呻吟av久久| 9色porny在线观看| 日本免费在线观看一区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av男天堂| 日韩成人伦理影院| 性色avwww在线观看| 18在线观看网站| 国产在线一区二区三区精| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品.久久久| 丝袜脚勾引网站| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 观看美女的网站| 久久人妻熟女aⅴ| 超碰97精品在线观看| www.色视频.com| 国产精品人妻久久久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产黄色免费在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 女人久久www免费人成看片| a 毛片基地| 少妇丰满av| 美女中出高潮动态图| av在线播放精品| 边亲边吃奶的免费视频| 99热这里只有精品一区| 国产精品免费大片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 香蕉精品网在线| 五月玫瑰六月丁香| 久久鲁丝午夜福利片| 美女国产高潮福利片在线看| 26uuu在线亚洲综合色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久精品久久精品一区二区三区| 日本黄大片高清| 蜜桃国产av成人99| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产最新在线播放| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 青青草视频在线视频观看| 亚洲av二区三区四区| 99热全是精品| 各种免费的搞黄视频| 国产在线视频一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜视频国产福利| 性色avwww在线观看| 国产一区二区三区av在线| 欧美97在线视频| 国产免费视频播放在线视频| 国产黄色免费在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 精品少妇久久久久久888优播| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 性色av一级| 午夜激情久久久久久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 秋霞在线观看毛片| 日韩三级伦理在线观看| 黄色一级大片看看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 各种免费的搞黄视频| 看免费成人av毛片| 少妇 在线观看| 美女国产视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 99热网站在线观看| 国产探花极品一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 十分钟在线观看高清视频www| 国产一区二区三区综合在线观看 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲成人手机| 国产精品成人在线| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲高清免费不卡视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美97在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产成人精品在线电影| 日韩一区二区三区影片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美3d第一页| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人精品在线电影| 婷婷色av中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产伦理片在线播放av一区| 插阴视频在线观看视频| 中文欧美无线码| 免费人成在线观看视频色| 日韩欧美精品免费久久|