lncRNA TUG1靶向調(diào)控miR-199a-3p對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的作用與機制研究*

盧發(fā)菊，王 麗，陳永建

（青海省第五人民醫(yī)院 1.腎臟內(nèi)科；2.內(nèi)分泌科，西寧 810000）

糖尿病腎病是糖尿病常見的嚴重并發(fā)癥，導(dǎo)致終末期腎病[1]。糖尿病腎病早期臨床表現(xiàn)為腎小球超濾和尿白蛋白排泄率增加[2]。其中，足細胞凋亡在糖尿病腎病腎小球硬化和蛋白尿的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[3]。當發(fā)生足細胞損傷時，腎小球濾過屏障無法維持，從而導(dǎo)致蛋白尿[4]。長非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1）是人類癌癥、心血管疾病等中廣泛表達的lncRNA，Lei 等[5]報道了糖尿病腎病大鼠和高葡萄糖處理的MPC5 細胞中，TUG1 的表達下調(diào)，Duan 等[6]揭示TUG1 通過介導(dǎo)miR-377 減輕糖尿病腎病的細胞外基質(zhì)積累。miR-199a-3p 在糖尿病性神經(jīng)病患者的表達明顯高于正常對照[7]。本研究的生物信息學(xué)預(yù)測顯示，TUG1和miR-199a-3p存在靶向結(jié)合位點。因此，本研究探討TUG1 是否通過靶向miR-199a-3p 影響高糖環(huán)境下MPC5細胞的增殖、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激，并在高糖誘導(dǎo)的小鼠腎足細胞MPC5損傷模型中進行驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠腎足細胞MPC5 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Podocin 抗體購自美國Thermo Fisher Scientific，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）白介素（IL）-1β試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒購自美國R＆D Systems，CCK-8、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酸（LDH）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天，抗細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）、Nephrin抗體購自Proteintech。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 MPC5 細胞在補充10%FBS 和抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃和5%CO2條件下進行培養(yǎng)。將MPC5細胞分為NG組（正常對照，5.3 mmol/L葡萄糖）、HG組（高糖，30.0 mmol/L葡萄糖[8]）、HG+pcDNA-NC 組、HG+pcDNA-lncRNA TUG1 組、HG+anti-miR-NC 組、HG+anti-miR-199a-3p組、HG+pcDNA-lncRNA TUG1+miR-NC組、HG+pcDNA-lncRNA TUG1+miR-199a-3p 組。HG 作用時間均為48 h。將MPC5 細胞以每孔6×104的密度鋪在6 孔板中，使用Lipofectamine 2000，按照制造商的協(xié)議進行pcDNA-NC、pcDNA-TUG1、anti-miRNC、miR-199a-3p inhibitor（anti-miR-199a-3p）、miRNC 和miR-199a-3p mimic 的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h 后進行30.0 mmol/L 葡萄糖損傷。48 h 后測定TUG1、miR-199a-3p 的表達。后續(xù)分析lncRNA TUG1 對miR-199a-3p 表達的調(diào)控時，將MPC5 細胞分為pcDNANC 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-NC）、pcDNA-lncRNA TUG1 組（pcDNA-TUG1）、si-NC 組（si-NC）和si-lncRNA TUG1 組（si-TUG1），48 h 后測定TUG1、miR-199a-3p的表達。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

利用Trizol試劑從MPC5細胞中提取RNA。然后使用PrimeScript?RT-PCR 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄和Master Mix SYBR-Green PCR 試劑盒進行RTqPCR。U6 和GAPDH 用作內(nèi)參。反應(yīng)條件如下：95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行45 個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算相對lncRNA 和miRNA表達水平。

1.4 CCK-8 法 MPC5 細胞根據(jù)“1.2 項”分組進行不同處理，48 h 后，以10 μL CCK-8 溶液孵育細胞1 h，于酶標儀記錄450 nm 的OD450nm值。細胞增殖率=OD實驗組/OD對照組。

1.5 Western blotting MPC5 細胞 用RIPA 裂解緩沖液裂解。通過十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜。膜與一抗CyclinD1抗體（1∶2 000）、p21（1∶1 000）、Caspase-3（1∶3 000）、Bax（1∶5 000）、Podocin（1∶1 000）、Nephrin（1∶5 000）、內(nèi)參β 肌動蛋白（β-actin）（1∶2 000）在4 ℃孵育過夜、與二抗IgG（1∶3 000）在37 ℃下孵育1 h。將膜浸入增強的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)溶液。通過ImageJ2x軟件分析圖像。

1.6 流式細胞術(shù) 按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明檢測MPC5細胞凋亡。凋亡率為細胞在早期和晚期凋亡階段的百分比。

1.7 試劑盒測定炎性因子IL-1β、TNF-α、氧化應(yīng)激因子MDA、LDH 水平 MPC5 細胞經(jīng)“1.2 項”分組處理后，收集上清液，分別用IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒測定炎性因子IL-1β、TNF-α 水平，用MDA、LDH 測定試劑盒檢測氧化應(yīng)激因子MDA、LDH 水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 將含miR-199a-3p預(yù)測互補位點的TUG1野生型（WT）和突變型（MUT）序列插入pGL3 對照載體，分別記為WT-lncRNA TUG1 和MUT-lncRNA TUG1。用WT-lncRNA TUG1 或MUT-lncRNA TUG1 熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染miR-NC 或miR-199a-3p mimic，24 h 以熒光素酶報告試劑盒測定各組熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。組間差異比較通過t檢驗、單因素方差分析或SNK-q檢測進行，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對MPC5細胞TUG1、miR-199a-3p及細胞損傷的影響 與NG 組相比，HG 組MPC5 細胞中TUG1 表達量減少，miR-199a-3p 表達量增加，細胞增殖率、增殖蛋白CyclinD1、特異性蛋白Podocin 及Nephrin 表達量降低，miR-199a-3p、凋亡蛋白Caspase-3、Bax 及p21 表達量升高，同時IL-1β、TNF-α、MDA、LDH水平升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 高糖對MPC5細胞TUG1、miR-199a-3p及細胞損傷的影響（，n=9）

2.2 過表達TUG1 對細胞損傷的影響 相比于HG+pcDNA-NC 組，HG+pcDNA-lncRNA TUG1 組MPC5 細胞中TUG1 表達量、細胞增殖率增加，CyclinD1、Podocin 及Nephrin 表達量升高，凋亡率、Caspase-3、Bax 表達量及p21 表達量減少，以及IL-1β、TNF-α、MDA及LDH水平降低（P＜0.05），見圖2。2.3 TUG1 靶向調(diào)控miR-199a-3p 的表達 如圖3所示，TUG1 與miR-199a-3p 具有結(jié)合位點。miR-199a-3p 組WT-lncRNA TUG1 熒光活性低于miRNC組（P＜0.05）。TUG1負調(diào)控miR-199a-3p的表達。

圖2 過表達lncRNA TUG1對細胞損傷的影響（，n=9）

圖3 TUG1靶向調(diào)控miR-199a-3p的表達（，n=9）

2.4 抑制miR-199a-3p表達對MPC5細胞損傷的影響 與HG+anti-miR-NC 組比較，HG+anti-miR-199a-3p 組miR-199a-3p、p21 表達量、凋亡率、Caspase-3及Bax表達量降低，細胞增殖率、CyclinD1表達量，Podocin、Nephrin 表達量升高，并且IL-1β、TNF-α、MDA及LDH水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 抑制miR-199a-3p表達對MPC5細胞損傷的影響（，n=9）

2.5 過表達miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)TUG1過表達對細胞損傷的影響 與HG+pcDNA-lncRNA TUG1+miR-NC 組相比，HG+pcDNA-lncRNA TUG1+miR-199a-3p 組MPC5 細胞中凋亡率、miR-199a-3p、p21、凋亡蛋白Caspase-3、Bax 表達量升高，細胞增殖率、CyclinD1、Podocin及Nephrin表達量降低，同時提高IL-1β、TNF-α、MDA 及LDH 水平（P＜0.05），見圖5。

圖5 過表達miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)TUG1過表達對細胞損傷的影響（，n=9）

3 討論

lncRNA 可以調(diào)節(jié)糖尿病腎病中足細胞的損傷過程[9-10]。根據(jù)報道，TUG1 在糖尿病小鼠的足細胞中表達減少，而TUG1 在足細胞中過表達減少了糖尿病引起的活性氧形成和蛋白尿[11-12]。糖尿病大鼠和高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞中TUG1 表達下調(diào)，其過表達可以抑制系膜細胞的增殖[13]。本研究檢測到，高糖減少MPC5 細胞中TUG1 表達，過表達TUG1 顯著提高MPC5 細胞增殖率、Podocin、Nephrin表達，抑制細胞凋亡和炎性因子、氧化應(yīng)激，表明過表達TUG1具有保護高糖損傷足細胞的作用。

研究顯示TUG1可以通過調(diào)節(jié)靶向miR-377來調(diào)節(jié)糖尿病腎病的細胞外基質(zhì)積累[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，TUG1 靶向調(diào)控miR-199a-3p 的表達，提示靶向miR-199a-3p 可能是TUG1 參與糖尿病腎病的新途徑。資料顯示，miR-199a 在2 型糖尿病患者血漿中的表達增高[14]。本研究中，高糖誘導(dǎo)miR-199a-3p水平的增加，抑制miR-199a-3p表達顯著降低MPC5細胞的凋亡、炎性因子表達和氧化應(yīng)激，并提高細胞增殖率和Podocin、Nephrin 表達，說明抑制miR-199a-3p的表達可保護足細胞，減少其凋亡及炎癥反應(yīng)。此外，過表達miR-199a-3p 后，過表達TUG1 保護高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的功能被逆轉(zhuǎn)，表明TUG1可能通過靶向miR-199a-3p來保護足細胞，減少高糖誘導(dǎo)的損傷。

綜上，TUG1促進高糖誘導(dǎo)的足細胞的增殖，抑制其凋亡、炎性因子表達和氧化應(yīng)激水平，機制可能與靶向miR-199a-3p有關(guān)。這為更好了解糖尿病腎病各種水平的調(diào)節(jié)機制提供了理論基礎(chǔ)，為糖尿病腎病的治療提供新思路。