甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1抗菌肽的分離及抑菌作用研究

張寶俊，馬 超，郭潔心，孫卓楠，張曉杰

（山西農業(yè)大學植物保護學院，太谷 030801）

芽胞桿菌Bacillussp.作為一類重要的生防資源，在植物病害微生物防治方面應用廣泛。我國現已登記使用有130余個芽胞桿菌產品，包括：枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens、蠟質芽胞桿菌Bacillus cereus等近10個種。以解淀粉芽胞桿菌F727為活性成分開發(fā)的Stargus在美國獲批登記，可用于葡萄、豆科作物、馬鈴薯多種病害的防治[1]。以短小芽胞桿菌BUF-33為主要成分登記的Integral? F?33，主要用于尖孢鐮刀菌和鏈格孢菌引起的多種病害的防治[2]。芽胞桿菌可通過核糖體途徑合成SubtilosinA、TasA、Subtilin及非核糖體途徑合成Iturin、Surfactin、Fengycin、Bacilysin等多種抗菌物質，作用范圍廣，能有效控制植物病害[9]。Wang等[10]研究發(fā)現短小芽胞桿菌W-7純化得到Surfactin和Fengycin B物質，其中fengycin B可直接抑制致病疫霉菌絲的生長，而surfactin可誘導馬鈴薯植株的防御反應，以控制晚疫病的發(fā)生。Jin等[11]研究發(fā)現貝萊斯芽胞桿菌HN-2次生代謝物Bacillomycin D能損傷膠孢炭疽菌菌絲和孢子的細胞壁和細胞膜，導致細胞內容物滲出。

隨著RNA-seq等高通量測序技術的發(fā)展，為在分子水平上分析生防微生物對植物病原菌的抑菌機制提供了便利。Laur等[12]對大麥白粉病菌Blumeria graminisf. sp.hordei與大麥相互作用的轉錄分析表明，生防絲狀真菌可以寄生在大麥上，通過短暫釋放特異效應物來轉移病菌汲取的營養(yǎng)物質，從而起到生防效果。大麗輪枝菌Verticillium dahliae在枯草芽胞桿菌C232抗菌脂肽的作用下，出現菌絲腫脹、細胞溶解和黑色素合成相關基因顯著下調[13]。前期研究表明，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1分泌的脂肽類抗菌物質對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌等具有良好的拮抗活性[14]，本研究通過對其抗菌物質的分離鑒定，明確其抗菌物質的類型及抑菌活性，并借助轉錄組測序技術，在轉錄組水平上分析番茄灰霉病菌應對脂肽類抗菌物質脅迫的響應機制，有助于生防微生物抑菌機理及作用靶標的研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1（Genbank登錄號：MT032113）分離自山西農業(yè)大學校園丁香樹莖部，由山西省植物內生菌服務共享平臺保藏并提供。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea由山西省綠色生物農藥工程技術中心保存與提供。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，pH 7，蒸餾水定容至1 L。C18反相柱（38 g，粒徑40～63 μm，孔徑60 ?，流速10～25 mL/min），ODS C18柱（Shim-pack PREP-10 μm，20×250 nm）購自常州三泰科技有限公司?？?RNA 提取試劑（Trizol）試劑盒、反轉錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with DNA Eraser）、熒光定量試劑盒（2X SG Fast qPCR Master Mix）等購自上海生工工程有限公司。

1.2 菌株G-1抗菌肽的分離、純化

采用鹽酸沉淀、甲醇提取的方法[15]從菌株G-1發(fā)酵液中提取抗菌脂肽粗提物，采用中壓層析分離系統(tǒng)進行分離。色譜柱為C18反相柱；流動相為去離子水和100%甲醇；洗脫條件為梯度洗脫，200～600 nm全波長掃描；流速為10 mL/min；進樣量為5 mL；柱溫為室溫。采用抑菌圈法測定各峰洗脫液抑菌活性，將150 μL 1×108cfu/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液涂布于PDA平板中，用直徑5 mm打孔器打3個孔（孔間夾角為120°），孔中依次加入80 μL的無菌水及各峰洗脫液，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后測定抑菌活性。

采用制備型高效液相色譜對抗菌活性物質進行再次洗脫分離，色譜柱為ODS C18柱，流動相A液為含0.05% TFA的去離子水，流動相B液為100%甲醇；洗脫程序為甲醇:水（v:v=1:4～4:1），線性梯度洗脫45 min，在211 nm波長檢測；流速為1 mL/min；柱溫30 ℃。按峰收集濃縮，甲醇溶解后采用抑菌圈法測定各峰洗脫液的抑菌活性。

1.3 菌株G-1抗菌肽的鑒定

采用Thermo Fisher液相色譜質譜聯(lián)用儀對分離的抑菌物質進行鑒定。液相條件：流動相為甲醇和含0.1% TFA的去離子水；流速1 mL/min；進樣量10 μL；洗脫為10%～90%甲醇梯度洗脫45 min；分子量掃描范圍為500～2000 Da。

1.4 菌株G-1抗菌肽抑制番茄灰霉病菌的顯微觀測

用直徑5 mm打孔器打取3個番茄灰霉病菌菌餅，將其接種于100 mL PDB培養(yǎng)液中，25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，加入1.2獲得的抑菌活性物質1 mL，分別在處理3和5 d時挑取病菌菌絲，無菌水清洗2～3次后，4 ℃、8000 r/min離心10 min收集菌體。一份置于2.5%戊二醛固定液中固定，0.1 mol/L（pH 7.4）磷酸緩沖液漂洗3遍，30%～100%乙醇梯度脫水，經冷凍干燥、噴金處理后在掃描電鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。一份液氮速凍并置于-80 ℃保存用于后續(xù)試驗。以在PDB培養(yǎng)5 d的番茄灰霉病菌菌絲為對照，3次重復。

1.5 抗菌肽抑制番茄灰霉病菌轉錄組測序及分析

采用RNA提取試劑盒（Trizol）提取番茄灰霉病菌菌絲總RNA，檢測合格后采用反轉錄試劑盒將RNA進行反轉錄，構建cDNA文庫后，由北京百邁克生物科技有限公司使用Illumina HiSeq平臺完成轉錄測序與分析。原始序列（Raw Read）經過濾，去除接頭、無效堿基大于5%及低質量的Reads得到Clean Reads。使用TopHat2軟件將得到的Clean Reads與葡萄孢菌基因組序列（GCF_000143535.2，參考基因組來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/494）進行比對，獲得Mapped Reads用于表達量計算[16]。利用DESeq,軟件進行DEGs篩選，篩選條件：FDR＜0.05 & |log2FC(Fold Change)|≥1。利用COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot 數據庫對Unigene進行基因功能注釋。在BMKCloud（www.biocloud.net）平臺對差異表達基因進行顯著性富集分析。

1.6 差異表達基因的qRT-PCR驗證

隨機挑選差異表達基因8個，根據cDNA序列設計、合成qRT-PCR引物（表1），以cDNA為模板建立擴增體系，擴增片段長度約90～140 bp。采用熒光定量試劑盒2×SG Fast qPCR預混液進行驗證，反應體系為 20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.4 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.4 μL，DNF Buffer（Optional）2 μL，cDNA1 μL，PCR-grade water 補足至 20 μL。反應程序為：95 ℃預變性7 min，95 ℃變性30 s，55 ℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個循環(huán)。以Actin基因作為內參基因，基因相對表達量的計算方法采用2-△△CT法。

表1 qRT-PCR驗證基因選擇及引物設計Table 1 Gene selection and primer design for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 菌株G-1抗菌肽分離結果

菌株G-1抗菌粗提物經中壓層析分離、HPLC純化，共檢測到5個吸收峰（圖1）。將洗脫液濃縮回收后，發(fā)現僅峰3有較好的抑菌活性，抑菌圈達41 mm，其余峰無明顯抑菌效果，表明菌株G-1主要的抗菌物質基本得到純化（圖2）。

圖1 菌株G-1脂肽物質HPLC分離圖譜Fig. 1 The HPLC purification map of the lipopeptide material from strain G-1

圖2 各吸收峰對番茄灰霉病菌的抑菌活性Fig. 2 The antifugnal activity of each absorption peak against B. cirere

2.2 抗菌肽LC-MS分析

LC-MS分析結果表明，在保留時間29.08和29.38 min出現較強的吸收峰（圖3）。質譜分析結果表明，保留時間為29.08 min時，碎片離子質核比為（m/z）為1043.55、1065.53、1081.51，并且離子峰分子量之間分別相差22和16，其規(guī)律同脂肽化合物中C14 IturinA的理論分子量及相應離子質核比1043.5508（C14 iturin [M+H]+）、1065.5328（C15 iturin [M+Na]+）、1081.5067（C16 iturin [M+K]+）相同，表明菌株G-1產生的抗菌脂肽類物質主要為Iturin A類（圖4）。

圖3 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1脂肽抗菌物質色圖譜Fig. 3 UPLC-ESI -MS TICs of antimicrobial lipopeptide antimicrobial material of B. methylotrophicus G-1

圖4 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1脂肽抗菌物質保留時間29.08 min時MS圖譜Fig. 4 The MS chromatograms of antimicrobial lipopeptide of B. methylotrophicus G-1 at the retention time of 29.08 min

2.3 抗菌肽對番茄灰霉病菌菌絲的影響

掃描電鏡觀測結果表明，對照組灰霉病菌菌絲表面光滑，細胞壁完整（圖5A），抗菌肽處理菌絲3 d后，灰霉病菌菌絲細胞壁發(fā)生穿孔、破裂現象（圖5B）；處理5 d后，部分菌絲表面皺縮、部分畸形腫脹，胞內物質外溢，甚至出現菌絲消融現象（圖5C）。

圖5 抗菌肽處理番茄灰霉病菌后掃描電鏡圖Fig. 5 Scanning electron micrographs of B. cinerea treated with antimicrobial peptides

2.4 轉錄組組裝與注釋

利用Illumina 2×150 bp雙端測序共測得149671736條Reads，產生22.33 Gb數據。經Trinity從頭組裝得到12207條轉錄本，與基因功能注釋數據庫的比對結果表明，12084條在NCBI的非冗余蛋白序列數據庫（NR）中可注釋到（98.99%）；4173條在蛋白質直系同源簇（COGs）數據庫可注釋到（34.19%）、6230條在基因本體論（GO）數據庫中得到注釋（51.04%），3169條在 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數據庫（KEGG）中得到注釋（25.96 %），6179條注釋到SwissProt數據庫中（50.62 %）（表2）。

表2 基因功能注釋統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of gene function annotation

在3個轉錄組樣品的GO功能注釋中，共有28135條Unigene得到注釋，其中8284條Unigene注釋到細胞組分，其中“cell”和“cell part”注釋的占比最高，分別為21.17%和21.19%，其次 “membrane”、“membrane part”分別占18.86%和18.32%，而“extracellular region part”注釋到的Unigene只有1個，占比最低為0.01%；分子功能中注釋比例較高的是“catalytic activity”和“binding”分別為 47.30%和 37.28%，注釋比例最低的為“protein tag”僅占0.01%；有7671個Unigene注釋到分子功能中，12180個Unigene在生物學過程中得到注釋（圖6）。在生物學過程分類中，有4167個Unigene 注釋到“metabolic process”中，占 34.21%為最高，“rhythmic process”注釋到的Unigene僅有1個。

圖6 GO功能注釋Fig. 6 GO function annotation classification

2.5 轉錄組差異表達基因比較分析

以FDR＜0.05、|log2FC|≥1作為篩選條件進行差異表達基因的篩選結果表明，CK vs 3 d的DEGs數目有90個，其中上調基因35個，下調基因55個；CK vs 5 d的DEGs 數目有1831個，其中上調基因1058個，下調基因773個；3 d vs 5 d的DEGs 數目有1692個，其中上調基因928個，下調基因764個。且抗菌肽處理番茄灰霉病菌后共有40個基因在2個時期均差異表達，其中與萜烯合酶、氨基酸跨膜轉運有關的 15個基因在各時期均上調表達，與細胞表面受體信號通路、氧化還原酶、果膠裂解酶、單加氧酶等有關的25個基因均下調表達（圖7）。

圖7 差異表達基因維恩圖Fig. 7 Venn diagram of differentially expressed genes

2.6 差異表達基因GO及KEGG功能富集分析

將篩選的40個unigenes在GO蛋白數據庫進行聚類，在生物學過程中有15個差異表達基因顯著富集，23個差異表達基因在分子功能中顯著富集，在細胞組分中僅有3個差異表達基因被富集。從40對差異表達基因中篩選了8個相關候選基因，其中調控3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶合成的Bcin04g04450基因、與P450單加氧酶活性相關的Bcin01g00020基因、細胞表面受體信號通路相關的Bcin04g03050基因、與果膠裂解酶活性Bcin03g05820基因、氧化還原Bcin04g05700基因、與血紅素相關Bcin01g0003基因均下調表達；與氨基酸跨膜轉運相關的Bcin08g04970基因、與萜烯合酶活性相關的Bcin01g03520基因上調表達（圖8）。

圖8 差異表達基因的GO富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

KEGG功能富集分析表明，Bcin04g04450基因參與到丁酸代謝（ko00650）、酮體的合成與降解（ko00072）、萜類骨架生物合成（ko00900）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（ko00280）等 4條代謝通路中，Bcin03g05820基因參與戊糖與葡萄糖醛酸酯的相互轉化（ko00040）（圖9）。

圖9 差異表達基因的Pathways富集分析Fig. 9 Pathways enrichment analysis of differentially expressed genes

2.7 候選基因表達水平的qRT-PCR驗證

通過 FPKM 值進行統(tǒng)計分析發(fā)現，Bcin04g04450、Bcin01g00030、Bcin01g00040、Bcin03g05820、Bcin04g03050、Bcin04g05700、Bcin01g03520和Bcin08g04970基因在整個抗菌肽處理灰霉病菌的不同時均差異表達。以Actin基因為內參，采用qRT-PCR對篩選的8對候選基因進行驗證（圖10），將RNA-seq和qRT-PCR中差異基因變化倍數均Log2轉化后進行比較，結果表明兩組數據R2達0.7144， 被檢測基因在3、5 d時期的相對表達量與DGE分析結果具有相似的表達趨勢（圖11）。

圖10 基因表達水平及qRT-PCR 驗證結果Fig. 10 Gene expression levels and qRT-PCR validation results

3 討論

芽胞桿菌可以產生Surfactin、Iturin及Fengycin等多種抗菌脂肽類物質[17]，可通過抑制病原菌細胞壁組分的生物合成，降低真菌細胞膜表面的張力，形成微孔，促使K+及其他重要離子的滲漏等方式，導致細胞死亡[18,19]。Rong等[20]從沙福芽胞桿菌Bacillus safensis中分離得到Iturin A2和Iturin A6 2種抗真菌化合物，可通過改變菌絲的膜透性而抑制菌絲的生長。本研究從甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌G-1發(fā)酵液中純化得到的抗菌脂肽經LC-MS分析鑒定為Iturin A，掃描電鏡觀測發(fā)現G-1抗菌肽處理番茄灰霉病菌后菌絲發(fā)生畸形腫脹，大量內溶物外滲，表明G-1菌株抑菌物質可破壞灰霉病菌細胞壁、細胞膜的完整性來達到抑制或殺菌的效果。

為揭示番茄灰霉病菌受到甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌脅迫后基因表達特征的變化，本研究利用轉錄組測序技術發(fā)現有40個基因在3、5 d時期均差異表達，其中與萜烯合酶、氨基酸跨膜轉運相關的15個基因在各時期均上調表達，與細胞表面受體信號通路、氧化還原酶、果膠裂解酶、單加氧酶等有關的 25個基因在各時期均下調表達。KEGG代謝通路分析發(fā)現，下調表達基因Bcin02g06840和Bcin04g04450分別參與了琥珀酸、甲羥戊酸的形成，其中Bcin02g06840基因編碼琥珀脫氫酶（SDH），Bcin04g04450基因編碼3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶（HMGR）。

研究表明，琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅱ中的關鍵酶，是三羧酸循環(huán)中可以與內膜結合的酶蛋白，可為生物體生長發(fā)育提供能量。甾醇調節(jié)膜的流動性和某些膜蛋白的功能，HMGR是甾醇生物合成的限速酶，可作用于3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原生成甲羥戊酸，甲羥戊酸是真菌合成麥角甾醇（ERG）的重要前體[21,22]，而麥角甾醇是真菌細胞膜必需的脂質組分，在維持細胞膜的完整性、流動性中起關鍵作用。楊智娟[23]構建了大豆疫霉琥珀酸脫氫酶A亞基PsSDHA基因的沉默表達載體，該基因沉默轉化菌株菌絲形態(tài)發(fā)生變異，菌絲生長速率、孢子囊的形成、游動孢子釋放速度明顯下降。Basson[24]、Croxen[25]分別將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、玉米黑穗菌Ustilago maydis中的 HMGR序列敲除后發(fā)現細胞不能正常進行孢子萌發(fā)和營養(yǎng)生長。田雪亮等[26]在轉錄組水平上揭示玉米大斑病菌Setosphaeria turcica對解淀粉芽胞芽胞桿菌脅迫的響應機制，揭示了玉米大斑病菌可通過調節(jié)葡聚糖生物合成途徑、麥角固醇合成途徑等相關基因的表達以響應芽胞桿菌環(huán)脂肽類抗菌物質的脅迫作用。因此，推測甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 G-1抗菌肽可能抑制 SDH的生物合成，致使多聚葡聚糖的合成和能量代謝受阻，或通過降低HMGR的活性，使得下游麥角固醇的合成受阻，導致番茄灰霉病菌生長緩慢，產孢能力下降。

本研究在轉錄組水平揭示了番茄灰霉病菌對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌抗菌肽脅迫的響應機制，將有助于生防微生物抑菌機理及作用靶標的研究。但 HMGR作為次生代謝的重要調控因子，缺失后是否影響麥角固醇產量，麥角固醇作為細胞質膜合成的主要物質，其變化是否影響番茄灰霉病菌細胞膜形態(tài)和功能等有待進一步研究。