懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因克隆和表達(dá)分析

洪森榮 陳正夢(mèng) 戴慧珍 鄧曼蕾

摘要：【目的】對(duì)懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，為進(jìn)一步揭示懷玉山三葉青黃酮醇合酶的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繎延裆饺~青黃酮醇合酶基因的核心片段通過其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因利用逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行克隆，序列分析采用生物信息學(xué)進(jìn)行分析，器官表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行比較?！窘Y(jié)果】懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因cDNA總長(zhǎng)度為987 bp，G+C含量為47.92%。懷玉山三葉青黃酮醇合酶由329個(gè)氨基酸組成，分子量37578.03 Da，理論等電點(diǎn)5.39，為親水性蛋白;其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的比例分別占27.66%、21.88%和50.46%。懷玉山三葉青黃酮醇合酶主要存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在進(jìn)化上與山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）和葡萄（Vitis vinifera）的親緣關(guān)系較近，尤其是與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析結(jié)果表明，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因的表達(dá)在2個(gè)栽培種中存在器官特異性表達(dá)，懷玉2號(hào)在根中的相對(duì)表達(dá)量最高，懷玉1號(hào)在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高。【結(jié)論】懷玉山三葉青黃酮醇合酶具有典型黃酮醇合酶的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，在進(jìn)化上高度保守，且懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因的表達(dá)存在組織器官差異性。

關(guān)鍵詞： 懷玉山三葉青;黃酮醇合酶;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S687.301 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）08-2061-08

Cloning and expression analysis of flavonol synthase gene of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

HONG Sen-rong1，2，3，4， CHEN Zheng-meng1， DAI Hui-zhen1， DENG Man-lei1

（1College of Life Sciences， Shangrao Normal University， Shangrao， Jiangxi ?334001， China; 2Shangrao Key Laboratory of Protection and Utilization of Medicinal and Edible Homologous Plant Resources， Shangrao， Jiangxi ?334001， China; 3Shangrao Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg Conservation and Utilization Technology Innovation Center， Shangrao， Jiangxi 334001， China; 4Shangrao Agricultural Technology Innovation Research Institute，

Shangrao， Jiangxi ?334001， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for revealing the biological function of flavonol synthase of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan， the flavonol synthase gene of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan was cloned and analyzed by expression. 【Method】The core fragment of flavonol synthase gene was screened from the transcriptome database of plantlets of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan. The flavonol synthase gene of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan was cloned by reverse transcription PCR（RT-PCR） technique， sequenced by bioinformatics method and analyzed in organ expression by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The total length of flavonol synthase gene cDNA of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan was 987 bp and the content of G+C was 47.92%. The flavonol synthase of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan was made up of 329 amino acids with molecular weight of 37578.03 Da and isoelectric point of 5.39， which was hydrophilic protein. The secondary structure was composed of α-helix（27.66%）， β-lamella（21.88%）， irregular curl（50.46%）. The flavonol synthase of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan mainly existed in the endoplasmic reticulum. The evolution of flavonol synthase of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan was closely related to Nekemias grossedentata， Vitis riparia and V. vinifera， especially to flavonol synthase of N. grossedentata， they had the highest phylogenetic relationship. The results of qRT-PCR showed that the expression of flavonol synthase gene was organ specific in the two cultivars of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan. Huaiyu No.2 had the highest expression in the root and Huaiyu No.1 had the highest expression in the stem. 【Conclusion】The flavonol synthase of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan has typical structural characteristics of flavonol synthase. Its amino acid sequence and nucleic acid sequence are highly similar to homologous species and highly conserved in evolution. There are tissue organ differences in the expression of flavonol synthase gene of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan.

Key words： Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan;flavonol synthase;gene cloning;expression ana-lysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960079）; General Project of Key Research and Development Plan of Jiangxi Department of Science and Technology（20192BBGL70050， 20202BBG73010）; Science and Technology Research Project of Jiangxi Department of Education（GJJ201704）

0 引言

【研究意義】三葉青是我國(guó)特有珍稀瀕危藥用植物，屬葡萄科崖爬藤屬藤本植物，學(xué)名為三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）（Zhu et al.，2020）。三葉青全株均可藥用，以地下塊根和果實(shí)藥用效果最佳，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、廣東、廣西、四川、貴州和云南等地（Wang et al.，2015），主要含有黃酮類、甾醇類、有機(jī)酸類和多糖等成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎保肝、鎮(zhèn)痛解熱、消腫抑瘤及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能（Ji et al.，2019），被譽(yù)為安全有效、無毒、無副作用及無抗藥性的植物抗生素（林國(guó)衛(wèi)等，2020）。其中黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，在自然界中最常見的黃酮類化合物主要有黃酮和黃酮醇。黃酮醇（Flavonol）是以糖基化的形式存在于植物中的無色多酚類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抵御紫外線傷害、抗寒抗旱、抗氧化、抗衰老、抗炎和降糖降脂等作用（Peng et al.，2019）。黃酮醇合酶（Flavonol synthase，F(xiàn)LS）屬于類黃酮代謝的節(jié)點(diǎn)酶，可將二氫槲皮素和二氫山奈酚等二氫黃酮醇催化合成槲皮素和山奈酚等黃酮醇，不僅直接影響黃酮醇的合成，對(duì)其他黃酮類化合物的積累及植物生理特征也有很重要的影響（Lukacin et al.，2003）。懷玉山三葉青是上饒市玉山縣國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，其保健與藥用價(jià)值高。因此，對(duì)懷玉山三葉青的黃酮醇合酶基因進(jìn)行克隆和序列分析，對(duì)認(rèn)識(shí)黃酮類化合物生物代謝途徑及進(jìn)一步分析黃酮類化合物的生物合成具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于黃酮醇合酶研究的報(bào)道較多，蔣潔等（2013）克隆金蕎麥黃酮醇合酶（FdFLS）基因的編碼序列，研究了該基因的序列、原核表達(dá)和活性，可深入了解金蕎麥黃酮類物質(zhì)生物合成的分子途徑;柳愛玲等（2013）克隆甜櫻桃黃酮醇合酶基因，并進(jìn)行原核表達(dá)和組織時(shí)空表達(dá)分析，顯示黃酮醇合酶基因可能與黃酮醇參與花粉萌發(fā)及利于授粉有關(guān);沈笑飛等（2014）克隆黑果枸杞和寧夏枸杞中的黃酮醇合酶基因，并分析其在2種枸杞果實(shí)4個(gè)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式差異;楊文婷等（2015）克隆紅花黃酮醇合酶基因的全長(zhǎng)cDNA，植物表達(dá)載體成功構(gòu)建，有助于進(jìn)一步了解黃酮化合物的合成機(jī)制;趙歡歡等（2016）和李青青等（2018）對(duì)苦蕎黃酮醇合酶基因FtFLS4和FtFLS2進(jìn)行克隆，并研究了p ET47b-FtFLS2的重組表達(dá)及多克隆抗體制備，為從蛋白表達(dá)水平上分析FtFLS4和FtFLS2與苦養(yǎng)黃酮類化合物累積的關(guān)系奠定基礎(chǔ);鞠志剛等（2018）對(duì)黔產(chǎn)艾納香黃酮醇合酶基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為黃酮醇類化合物的生物合成提供理論基礎(chǔ);鄒慶軍等（2018）研究杭菊黃酮醇合酶基因的原核表達(dá)和重組蛋白體外活性，為從分子水平調(diào)控杭菊黃酮醇成分代謝及體外催化合成黃酮醇提供新思路;李海鴻等（2019）對(duì)葡萄風(fēng)信子黃酮醇合酶基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，為開展單子葉植物花色育種提供理論依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)三葉青的研究主要集中在化學(xué)成分（付立忠等，2019）、組織培養(yǎng)（洪春桃等，2019）、種植栽培（徐惠龍等，2020）及藥理臨床（林鈺久等，2021）等方面，關(guān)于三葉青黃酮醇合酶方面的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)進(jìn)行克隆，序列和組織表達(dá)分別利用生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行分析和比較，為進(jìn)一步揭示懷玉山三葉青黃酮醇合酶的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為懷玉山三葉青黃酮醇成分代謝的分子調(diào)控以及其體外催化合成黃酮醇提供新視野。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

懷玉山三葉青栽培種懷玉1號(hào)和懷玉2號(hào)試管苗由上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。懷玉1號(hào)特點(diǎn)：形成塊根早，個(gè)頭偏小，塊根紡錘形，葉薄而小。懷玉2號(hào)特點(diǎn)：形成塊根稍晚，個(gè)頭偏大，塊根長(zhǎng)柱狀，葉厚且大。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 于2020年4月用TRIzol試劑按RNA提取說明書提取總RNA（懷玉1號(hào)和懷玉2號(hào)試管苗），采用紫外分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)兩者RNA濃度及其完整性。以提取的RNA為模板，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo（dT）18 Primer：5'-GGCCACGCGTCGAC TA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'，具體步驟按RNA逆轉(zhuǎn)錄說明進(jìn)行操作。

1. 2. 2 黃酮醇合酶基因克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（F：5'-ATGCAGATTGAGAGAGTGCAAGCCA-3';R：5'-CTTATTAAATTTGCGGTGGCGGAAC-3'）。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶切膠回收后與pMD19-T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1. 2. 3 黃酮醇合酶基因的生物信息學(xué)分析 氨基酸序列：利用BioEdit 7.2.1對(duì)基因序列進(jìn)行翻譯。酶理化性質(zhì)預(yù)測(cè)：在線工具ExPASy ProtParam Tool。酶疏/親水性預(yù)測(cè)：ProtScale程序。酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：GOR IV。酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：SWISS-MOLD?；虮磉_(dá)部位預(yù)測(cè)：WoLFPsort在線軟件。氨基酸序列比對(duì)分析：DNAMAN和BioEdit軟件。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建：MEGA 5.0的鄰接法。

1. 2. 4 黃酮醇合酶基因的組織表達(dá)分析 提取懷玉1號(hào)和懷玉2號(hào)試管苗根、莖、葉的RNA（各500 ng），然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，熒光染料為SYBR Green I。黃酮醇合酶基因引物設(shè)計(jì)為F：5'-ATATGTACCCACCATGCC CACA-3';R：5'-CGGCGATCCAGTTATCGTCTT-3'。內(nèi)參基因GAPDH引物設(shè)計(jì)為F：5'-CCATTACTGCT ACCCAAAAAACT-3';R：5'-GTGAGGTCAACCA CCGACACATC-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量計(jì)算：2-△△Ct法。qRT-PCR試驗(yàn)重復(fù)3次。基因表達(dá)水平表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，黃酮醇合酶基因組織表達(dá)的差異顯著性采用SPSS 19.0的單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因cDNA序列

懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因經(jīng)PCR擴(kuò)增（圖1），其cDNA總長(zhǎng)度為987 bp（圖2），其G+C含量為47.92%（圖3）。

2. 2 懷玉山三葉青黃酮醇合酶氨基酸序列

ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示懷玉山三葉青黃酮醇合酶氨基酸序列見圖4。懷玉山三葉青黃酮醇合酶由329個(gè)氨基酸組成，分子量37578.03 Da，理化等電點(diǎn)5.39，為親水性蛋白。各氨基酸的Ala（A）數(shù)目和比例分別為17和5.2%，Arg（R）數(shù)目和比例分別為10和3.0%，Asn（N）數(shù)目和比例分別為17和5.2%，Asp（D）數(shù)目和比例分別為14和4.3%，Cys（C）數(shù)目和比例分別為3和0.9%，Gln（Q）數(shù)目和比例分別為10和3.0%，Glu（E）數(shù)目和比例分別為34和10.3%，Gly（G）數(shù)目和比例分別為19和5.8%，His（H）數(shù)目和比例分別為10和3.0%，Ile（I）數(shù)目和比例分別為16和4.9%，Leu（L）數(shù)目和比例分別為35和10.6%，Lys（K）數(shù)目和比例分別為26和7.9%，Met（M）數(shù)目和比例分別為8和2.4%，Phe（F）數(shù)目和比例分別為15和4.6%，Pro（P）數(shù)目和比例分別為24和7.3%，Ser（S）數(shù)目和比例分別為17和5.2%，Thr（T）數(shù)目和比例分別為14和4.3%，Trp（W）數(shù)目和比例分別為7和2.1%，Tyr（Y）數(shù)目和比例分別為10和3.0%，Val（V）數(shù)目和比例分別為23和7.0%。帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）為48，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為36。懷玉山三葉青黃酮醇合酶失穩(wěn)指數(shù)（II）計(jì)算為44.57，為不穩(wěn)定蛋白。

2. 3 懷玉山三葉青黃酮醇合酶親/疏水性分析

從圖5可知，高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的低谷區(qū)域是親水區(qū)域;親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，最大疏水值為2.5左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強(qiáng)，親水峰最大值為-3.5左右;整個(gè)蛋白表現(xiàn)出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白。

2. 4 懷玉山三葉青黃酮醇合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

懷玉山三葉青黃酮醇合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋Alpha helix（Hh，27.66%）、β-折疊Extended strand（Ee，21.88%）、無規(guī)則卷曲Random coil（Cc，50.46%）構(gòu)成。從分布位點(diǎn)上來看，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋，無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋則散布于整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)中（圖7）。

2. 5 懷玉山三葉青黃酮醇合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由圖8可知，懷玉山三葉青黃酮醇合酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體（SWISS-MODEL預(yù)測(cè)）。

2. 6 懷玉山三葉青黃酮醇合酶亞細(xì)胞定位

采用WoLFPsort在線軟件對(duì)懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖9）顯示，基因定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量為5.5，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜的數(shù)量為4.0，定位于細(xì)胞外的數(shù)量為3.0，定位于細(xì)胞質(zhì)的數(shù)量為2.0，定位于線粒體中的數(shù)量為2.0，定位于質(zhì)膜的數(shù)量是1.5。表明懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2. 7 懷玉山三葉青黃酮醇合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖10）可知，懷玉山三葉青與山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）、葡萄（Vitis vinifera）在一個(gè)大分支下，說明懷玉山三葉青黃酮醇合酶在進(jìn)化上與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶、河岸葡萄（V. ripa-ria）黃酮醇合酶/黃烷3-羥化酶樣、葡萄（V. vinifera）假設(shè)蛋白VITISV-029566、葡萄（V. vinifera）黃酮醇合酶/黃烷3-羥化酶的親緣關(guān)系較近，特別與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶具有較高的親緣關(guān)系。

2. 8 懷玉山三葉青黃酮醇合酶同源蛋白序列比對(duì)分析

懷玉山三葉青黃酮醇合酶同源蛋白序列比對(duì)分析結(jié)果見圖11，該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域用※號(hào)表示。懷玉山三葉青黃酮醇合酶同源蛋白的序列與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶（AGO02176.1）的序列除幾個(gè)位點(diǎn)有變動(dòng)外，其余位點(diǎn)氨基酸序列一致，進(jìn)一步驗(yàn)證懷玉山三葉青黃酮醇合酶與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶具有較高的親緣關(guān)系。

2. 9 懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中黃酮醇合酶基因的表達(dá)分析

以懷玉山三葉青的GAPDH為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因在懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中的表達(dá)情況。從圖12可知，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因在根莖葉中均有表達(dá)，因此，懷玉山三葉青的根莖葉均可檢測(cè)到總黃酮;但在不同器官的表達(dá)情況差異顯著（P<0.05，下同），其中對(duì)于懷玉2號(hào)，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因在其根中的相對(duì)表達(dá)量最高，而對(duì)于懷玉1號(hào)，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因在其莖中的相對(duì)表達(dá)量最高。

3 討論

黃酮醇是植物內(nèi)在品質(zhì)和道地性形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是植物較為重要的次生代謝物質(zhì)。作為黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化二氫黃酮醇合成黃酮醇，黃酮醇合酶已在多種植物中被克隆和表達(dá)分析（Owens et al.，2008）。在本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)首次成功克隆獲得懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和同源蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因氨基酸序列較保守，同時(shí)懷玉山三葉青與山甜菜（N. grossedentata）黃酮醇合酶、河岸葡萄（V. riparia）黃酮醇合酶/黃烷3-羥化酶樣、葡萄（V. vinifera）黃酮醇合酶/黃烷3-羥化酶等共用一個(gè)節(jié)點(diǎn)，具有較高的同源性，表明懷玉山三葉青的黃酮醇合酶在進(jìn)化上與山甜菜、河岸葡萄和葡萄關(guān)系密切。

三葉青被譽(yù)為天然廣譜的植物抗生素，含有黃酮類物質(zhì)具有抗腫瘤活性，可促進(jìn)機(jī)體免疫，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，能起到抑瘤抗癌的作用（Peng et al.，2019）。黃酮醇合酶基因以二氫黃酮醇為底物，最后經(jīng)過一系列反應(yīng)形成楊梅素、山奈酚和槲皮素等黃酮醇，對(duì)植物中黃酮類物質(zhì)的累積具有重要作用（Moriguchi et al.，2002），因此可采用調(diào)控黃酮醇合酶表達(dá)量的方法影響三葉青地下塊根的品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，黃酮醇合酶基因在懷玉山三葉青2個(gè)栽培種中的表達(dá)一般存在器官特異性，說明黃酮醇合酶在懷玉山三葉青2個(gè)栽培種黃酮代謝途徑中扮演著不同的角色，與柳愛玲等（2013）、趙歡歡等（2016）、李海鴻等（2019）在蕎黃酮醇合酶上的研究結(jié)果相似，為深入研究懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因的調(diào)控模式提供了分子依據(jù)。

4 結(jié)論

懷玉山三葉青黃酮醇合酶具有典型黃酮醇合酶的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，在進(jìn)化上高度保守，且懷玉山三葉青黃酮醇合酶基因的表達(dá)存在組織器官差異性。

參考文獻(xiàn)：

付立忠，趙利梅，呂惠卿，程俊文，盧廷高. 2019. 鉀對(duì)三葉青生物量及其莖葉化學(xué)成分、抗氧化活性的影響[J]. 中藥材，42（12）：2751-2754. [Fu L Z，Zhao L M，Lü H Q，Cheng J W，Lu T G. 2019. Effects of potassium on biomass，chemical composition and antioxidant activity of Tetrastigma hemsleyanum[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials，42（12）：2751-2754.] doi：10.13863/j.issn 1001-4454.2019.12.003.

洪春桃，沈登鋒，魏斌，章建紅. 2019. 幾種三葉青組織培養(yǎng)快繁體系的比較及其優(yōu)化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，60（10）：1846-1849.[Hong C T，Shen D F，Wei B，Zhang J H. 2019. Comparison and optimization of several micropropagation systems for tissue culture of Tetrastigma hemsleyanum[J]. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences，60（10）：1846-1849.] doi：10.16178/j.issn.0528-9017.2019 1047.

蔣潔，白悅辰，李成磊，陳惠，吳琦. 2013. 金蕎麥黃酮醇合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 中草藥，44（14）：1974-1978. [Jiang J，Bai Y C，Li C L，Chen H，Wu Q. 2013. Cloning of flavonol synthase gene from Fago-pyum dibotrys and its expression in Escherichia coli[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，44（14）： 1974-1978.] doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2013.14.020.

鞠志剛，孫世宇，申鵬，楊芳芳，繆艷燕，陳曉蘭. 2018. 黔產(chǎn)艾納香黃酮醇合酶基因的克隆及其生物信息學(xué)分析[J].分子植物育種，16（21）：7004-7008.[Ju Z G，Sun S Y，Shen P，Yang F F，Miu Y Y，Chen X L. 2018. Cloning and bioinformatics analysis of FLS in Blumea balsami-fera from Guizhou[J]. Molecular Plant Breeding，16（21）： 7004-7008.] doi：10.13271/j.mpb.016.007004.

李海鴻，劉雅莉，劉紅利，婁倩. 2019. 葡萄風(fēng)信子黃酮醇合酶基因克隆和表達(dá)分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，34（2）：116-121.[Li H H，Liu Y L，Liu H L，Lou Q. 2019. Cloning and expression analysis of FLS gene in Muscari armeniacum[J]. Journal of Northwest Forestry University，34（2）：116-121.] doi：10.3969/j.issn.1001-7461.2019.02.18.

李青青，張潤(rùn)敏，石冠藍(lán)，姚攀鋒，王曉麗，李成磊. 2018. 苦蕎黃酮醇合酶基因 FtFLS4 的克隆及其在大腸桿菌的表達(dá)[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，36（5）：611-617.[Li Q Q，Zhang R M，Shi G L，Yao P D，Wang X L，Li C L. 2018. Cloning of flavonolsynthase gene FtFLS4 from tartary buckwheat and expression in E. coli[J]. Journal of Sichuan Agricultural University， 36（5）： 611-617.] doi：10.16036/j.issn.1000-2650.2018.05.007.

林國(guó)衛(wèi)，聞靜，石光禹，潘彬彬，陳麗麗，丁歡歡，蔡紅，陳榮華，洪森榮. 2020. 侵染懷玉山三葉青的病毒RT-PCR鑒定[J]. 分子植物育種，18（3）：968-975.[Lin G W，Wen J，Shi G Y，Pan B B，Chen L L，Ding H H，Cai H，Chen R H，Hong S R. 2020. Identification of viruses infecting Huaiyushan Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg by RT-PCR[J]. Molecular Plant Breeding，18（3）：968-975.] doi：10.13271/j.mpb.018.000968.

林鈺久，柴樹人，龍坤蘭，陳駿，石冀敏，徐靜靜. 2021. 三葉青黃酮對(duì)荷Lewis肺癌小鼠免疫功能及腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，33（1）：8-15.[Lin Y J，Cai S R，Long K L，Chen J，Shi J M，Xu J J. 2021. Effects of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg flavone on immune function and apoptosis-related proteins in tumor tissues of Lewis lung cancer mice[J]. Natu-ral Product Research and Development，33（1）： 8-15.] doi：10.16333/j.1001-6880.2021.1.002.

柳愛玲，沈欣杰，劉蕓，袁華招，張曉明，李天紅. 2013. 甜櫻桃黃酮醇合酶基因的克隆及其表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，18（2）：56-63.[Liu A L，Shen X J，Liu Y，Yuan H Z，Zhang X M，Li T H. 2013. Cloning and expression analysis of PacFLS in sweet cherry（Prunus avium L.）[J]. Journal of China Agricultural University，18（2）：56-63.]

沈笑飛，劉永亮，王瑛，曾少華. 2014. 黑果枸杞和寧夏枸杞中黃酮醇合酶基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，33（3）：591-597. [Shen X F，Liu Y L，Wang Y，Zeng S H. 2014. Molecular cloning and expression analysis of flavonol synthase in Lycium ruthenicum Murr. and Lycium barbarum L.[J]. Genomics and Applied Biology，33（3）： 591-597.] doi：10.13417/j.gab.033.000591.

徐惠龍，劉江明，范小芳，許文，范世明. 2020. 不同光照強(qiáng)度對(duì)三葉青生長(zhǎng)發(fā)育及其總黃酮的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，22（11）：1866-1870. [Xu H L，Liu J M，F(xiàn)an X F，Xu W，F(xiàn)an S M. 2020. Effects of different light intensity on growth and total flavonoids of Tetrastigma hemsleyanum[J]. Modern Chinese Medicine，22（11）：1866-1870.] doi： 10.13313/j.issn.1673-4890.20200211007.

楊文婷，劉秀明，萬秋，姚娜，王南，張雪萌，焦重達(dá)，李海燕，李校堃. 2015. 紅花黃酮醇合酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 中國(guó)中藥雜志，40（4）：634-638.[Yang W T，Liu X M，Wan Q，Yao N，Wang N，Zhang X M，Jiao Z D，Li H Y，Li X K. 2015. Full-length cDNA cloning of flavonol synthase genes of Carthamus tinctorius and construction plant expression vector[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，40（4）： 634-638.] doi：10. 4268/cjcmm20150412.

趙歡歡，張鐘仁，李學(xué)俊，陳鵬. 2016. 苦蕎黃酮醇合酶FtFLS2的重組表達(dá)及多克隆抗體制備[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，30（2）：240-245. [Zhao H H，Zhang Z R，Li X J，Chen P. 2016. Prokaryotic expression of tartary buckwheat flavonol synthase FtFLS2 and preparation of its polyclonal antibody[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，30（2）： 240-245.] doi：10.11869/j.issn.100-8551.2016.02.0240.

鄒慶軍，汪濤，郭巧生，張文燕，王蕊，王宇暉，肖有梅. 2018. 杭菊黃酮醇合酶基因的原核表達(dá)與重組蛋白體外活性研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，43（17）：3471-3476.[Zou Q J，Wang T，Guo Q S，Zhang W Y，Wang R，Wang Y H，Xiao Y M. 2018. Prokaryotic expression and in vitro enzyme activity analysis of flavonol synthase in Chrysanthemum morifolium cv. ‘Hangju[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，43（17）： 3471-3476.] doi：10.19540/ j.cnki.cjcmm.20180510.007.

Ji W W，Peng X，Lou T L，Wang J，Qiu W Y. 2019. Total flavonoids from Tetrastigma hemsleyanum ameliorates inflammatory stress in concanavalin A-induced autoimmune hepatitis mice by regulating Treg/Th17 immune homeostasis[J]. Inflammopharmacology，27（6）：1297-1307. doi：10.1007/s10787-019-00599-0.

Lukacin R，Wellmann F，Britsch L，Martens S，Matern U. 2003. Flavonol synthase from Citrus unshiu is a bifunctional dioxygenase[J]. Phytochemistry，62（3）： 287-292. doi：10.1016/S0031-9422（02）00567-8.

Moriguchi T，Kita M，Ogawa K，Tomono Y，Endo T，Omura M. 2002. Flavonol synthase gene expression during citrus fruit development[J]. Physiologia Plantarum，114（2）： 251-258. doi：10.1034/j.1399-3054.2002.1140211.x.

Owens D K，Alerding A B，Crosby K C，Bandara A B，Westwood J H，Winkel B S J. 2008. Functional analysis of a predicted flavonol synthase gene family in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，147（3）： 1046-1061. doi：10.1104/pp.108.117457.

Peng X，Wu H，Chen H J，Zhang Y J，Qiu D，Zhang Z Y. 2019. Transcriptome profiling reveals candidate flavonol-related genes of Tetrastigma hemsleyanum under cold stress[J]. BMC Genomics，20（1）：687. doi：10.1186/s12864-019- 6045-y.

Wang Y H，Jiang W M，Comes H P，Hu F S，Qiu Y X，F(xiàn)u C X. 2015. Molecular phylogeography and ecological niche modelling of a widespread herbaceous climber，Tetrastigma hemsleyanum（Vitaceae）： Insights into Plio-Pleistocene range dynamics of evergreen forest in subtropical China[J]. New Phytologist，206（2）： 852-867. doi：10.1111/nph. 13261.

Zhu R Y，Xu X F，Ying J L，Cao G，Wu X. 2020. The phytochemistry，pharmacology，and quality control of Tetrastigma hemsleyanum Diels & Gilg in China： A review[J]. Frontiers in Pharmacology，11：550497. doi：10.3389/fphar. 2020.550497.

（責(zé)任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2021-02-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960079）;江西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（20192BBGL70050，20202BBG73010）;江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ201704）

第一作者：洪森榮（1974-），https：//orcid.org/0000-0002-9219-8303，教授，主要從事植物生物技術(shù)研究工作，E-mail：hongsenrong@163.com