中華絨螯蟹過氧化物還原酶基因克隆及其在鰻弧菌感染下的表達(dá)分析

李輝 馮偉 唐永凱 蘇勝彥 王美垚 李建林

摘要：【目的】克隆中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）過氧化物還原酶基因（EsPrx）的開放閱讀框（ORF），并分析EsPrx基因的組織表達(dá)特征及細(xì)菌感染下的表達(dá)情況，為中華絨螯蟹的先天免疫和抗病機(jī)制研究提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^RT-PCR結(jié)合轉(zhuǎn)錄組序列比對克隆出EsPrx基因，利用DNAStar、ClustalW、ExPASy、TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0及NetPhos 3.1 Server等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以實時熒光定量PCR檢測EsPrx基因的組織表達(dá)特征及鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染下的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】EsPrx基因ORF為597 bp，共編碼198個氨基酸殘基，含有Prx特有的2個結(jié)構(gòu)域（FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA）。EsPrx蛋白分子式為C994H1544N258O293S8，分子量為22.05 kD，理論等電點（pI）為5.67，無跨膜域和信號肽，屬于非分泌性蛋白。EsPrx氨基酸序列與扁額青蟹（Eurypanopeus depressus）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的Prx氨基酸序列高度同源，對應(yīng)的相似性分別89%、89%和88%;基于Prx氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，EsPrx氨基酸序列先與擬穴青蟹、扁額青蟹及南美白對蝦（Penaeus vannamei）的Prx氨基酸序列聚在一起，再與其他動物的2-Cys Prx氨基酸序列聚類，證實EsPrx基因?qū)儆谖捶只腜rx基因，即Prx1/2基因。EsPrx基因在中華絨螯蟹各組織中廣泛表達(dá)，以肝胰腺的相對表達(dá)量最高，極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量（P<0.01）;EsPrx基因表達(dá)在鰻弧菌感染不同時間段存在明顯差異，感染6～24 h其相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而后迅速降至正常水平?！窘Y(jié)論】EsPrx基因為甲殼動物未分化的Prx1/2基因，在中華絨螯蟹肝胰腺中高表達(dá)，并參與鰻弧菌感染的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，即在抗逆過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 中華絨螯蟹;過氧化物還原酶;基因克隆;鰻弧菌感染;組織表達(dá)特征

中圖分類號： S966.16 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2267-09

Cloning of peroxiredoxin gene（EsPrx） in Eriocheir sinensis and its expression analysis under Vibrio anguillarum infection

LI Hui1，2， FENG Wei2，3， TANG Yong-kai1，2，3*， SU Sheng-yan1，2，3，

WANG Mei-yao2，3， LI Jian-lin2

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuxi， Jiangsu ?214081，

China; 3Wuxi Fisheries College， Nanjing Agricultural University， Wuxi， Jiangsu ?214081， China）

Abstract：【Objective】Cloned the open reading frame（ORF） of peroxiredoxin gene（EsPrx） of Eriocheir sinensis， and analyzed the tissue expression characteristics of EsPrx gene and its expression under bacterial infection， which provi-ded reference for the study of innate immunity and disease resistance mechanism of E. sinensis. 【Method】The EsPrx gene was cloned by combining RT-PCR with transcriptome sequence alignment analysis. Bioinformatics analysis was performed using online software such as DNAStar， ClustalW， ExPASy， TMHMM Server v.2.0， SignalP 5.0， and NetPhos 3.1 Server. The tissue expression characteristics of the EsPrx gene and its expression in the presence of Vibrio anguillarum infection were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The ORF of EsPrx gene was 597 bp， enco-ding a total of 198 amino acid residues， and it contained two domains specific to Prx （FYPLDFTFVCPTEI and GEVCPA）. The molecular formula of EsPrx protein was C994H1544N258O293S8， with a molecular weight of 22.05 kDa and a theoretical isoelectric point（pI） of 5.67. Without transmembrane domain and signal peptide， it was a non-secretory protein. The amino acid sequence of EsPrx was highly homologous with the Prx amino acid sequence of Eurypanopeus depressus， Scylla paramamosain and Portunustri tuberculatus， with the corresponding similarities of 89%， 89% and 88%， respectively. The phylogenetic tree constructed based on the similarity of Prx amino acid sequence showed that the amino acid sequence of EsPrx was first clustered with the Prx amino acid sequence of S. paramamosain， E. depressus and Penaeus vannamei， and then clustered with the 2-Cys Prx amino acid sequence of other animals， confirming that the EsPrx gene belonged to the undifferentiated Prx gene， namely， Prx1/2 gene. The EsPrx gene was widely expressed in various tissues of E. sinensis， and the relative expression level of EsPrx gene in hepatopancreas was the highest， which was extremely significantly higher than that in other tissues（P<0.01）. The expression of EsPrx gene was greatly different at different time points of Vibrio anguillarum infection， and its relative expression was significantly increased 6-24 h after infection（P<0.05）， and then rapidly decreased to normal level. 【Conclusion】EsPrx gene is an undifferentiated Prx1/2 gene of crustacean， which is highly expressed in hepatopancreas of E. sinensis， and participates in the anti-oxidative stress response of V.anguillarum infection， that is， plays an important role in the resistance process.

Key words： Eriocheir sinensis; peroxiredoxin; gene cloning; Vibrio anguillarum infection;tissue expression chara-cters

Foundation item：The Fundamental Research Funds for The Central Public Welfare Research Institutes（2020TD36）; Jiangsu Agricultural Major New Variety Creation Project（PZCZ201749）; Jiangsu Modern Agricultural Industrial Techno-logy System Construction Special Project（JATS〔2019〕385）; Fishery Technology Major Project of Jiangsu（D2018-4）

0 引言

【研究意義】過氧化物還原酶（Peroxiredoxin，Prx）是抗氧化酶家族的成員之一，最初發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中，被命名為巰基特異性抗氧化酶（Thiol-specific antioxidant enzyme，TSA）。隨后發(fā)現(xiàn)Prx既存在于動物中，又存在于植物中，在抗氧化和清除體內(nèi)過多活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等方面發(fā)揮重要作用（Wood et al.，2003;章波等，2004;Kang et al.，2005）。在正常情況下，ROS和抗氧化酶呈動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生超出其清除能力時即出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)（張星瑩等，2019）。無脊椎動物的氧化還原平衡是疾病與生理學(xué)變化相互作用的結(jié)果，是先天免疫不可或缺的一部分（Aispuro-Hernandez et al.，2008）。在外界生物和非生物的脅迫下，將誘導(dǎo)機(jī)體體內(nèi)產(chǎn)生和積累大量ROS，而抗氧化酶表達(dá)的增加能抵御ROS造成的危害。因此，闡明Prx基因參與細(xì)菌感染調(diào)控的分子機(jī)制對保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】在哺乳動物中，已鑒定出6種不同的Prx亞型，分別為Prx1、Prx2、Prx3、Prx4、Prx5和Prx6（章波等，2004）。此外，在發(fā)狀念珠藻（岳思君等，2016）、小麥（趙明明，2017）、異育銀鯽（稅典章等，2018）、田鼠巴貝斯蟲（彭夢華，2019）、冰島硫化葉菌（鐘晴，2019）及櫛孔扇貝（Cheng et al.，2020）等物種上也有發(fā)現(xiàn)。與哺乳動物略有不同，甲殼動物的Prx亞型分為Prx1/2、Prx3、Prx4、Prx5和Prx6。Tu等（2018）首次對擬穴青蟹（Scylla paramamosain）Prx基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明，擬穴青蟹Prx1/2符合典型的2-Cys Prx結(jié)構(gòu)特征，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中先與其他甲殼動物聚為一個支，再與Prx1～Prx4聚集。因此，甲殼動物中的Prx1/2基因被推測為Prx1和Prx2的祖先基因，即未分化的Prx基因。針對甲殼動物Prx基因的相關(guān)研究，Mu等（2008）以鰻弧菌（Vibrio anguillarum）人工感染中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），結(jié)果發(fā)現(xiàn)EsPrx6基因的相對表達(dá)量在感染3～12 h內(nèi)持續(xù)下降，感染后12 h達(dá)最低水平，顯著低于對照組，但感染24 h后開始上升，表明EsPrx6基因參與中華絨鰲蟹鰻弧菌感染的免疫應(yīng)答過程;Duan等（2013）對脊尾白蝦（Exopa-laemon carinicauda）進(jìn)行人工感染鰻弧菌和白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV），結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞和肝胰腺中EcPrx5基因的表達(dá)在感染早期上調(diào)，而后逐漸下降，表明EcPrx5基因可能參與對鰻弧菌和WSSV感染的免疫應(yīng)答;謝亞凱（2016）在日本囊對蝦（Penaeus japonicus）中發(fā)現(xiàn)由鰻弧菌感染引起的H2O2可誘導(dǎo)Prx6基因表達(dá)上調(diào)，Prx6基因通過發(fā)揮谷胱甘肽過氧化物酶活性而調(diào)節(jié)對蝦體內(nèi)H2O2水平，維持對蝦體內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，防止H2O2持續(xù)積累;卜瑞倩（2018）從斑節(jié)對蝦（P. monodon）中克隆出PmPrx1、PmPrx5和PmPrxn基因，在非生物環(huán)境條件下進(jìn)行毒性脅迫，發(fā)現(xiàn)PmPrx1、PmPrx5和PmPrxn基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜，說明這3種基因均參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。【本研究切入點】近年來，中華絨螯蟹市場需求量日益增加，養(yǎng)殖密度和規(guī)模不斷擴(kuò)大，隨之而來的是養(yǎng)殖水體環(huán)境日益惡化及病害頻發(fā)（黃曉東等，2019;臧亞南等，2019），尤其是以弧菌感染為主的細(xì)菌性疾病，導(dǎo)致黑鰓、水腫及爛肢等癥狀，給中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失（房海，2008;鄭世雄，2013）。Prx在氧化應(yīng)激應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能作用，但至今鮮見有關(guān)中華絨螯蟹Prx基因（EsPrx）的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用RT-PCR克隆EsPrx基因的完整開放閱讀框（ORF），系統(tǒng)分析其生物信息學(xué)，并采用實時熒光定量PCR檢測EsPrx基因的組織表達(dá)特征及細(xì)菌感染下的表達(dá)情況，旨在為中華絨螯蟹的先天免疫和抗病機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試中華絨螯蟹取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)中心陽澄湖蝦蟹綠色養(yǎng)殖基地，規(guī)格為78±5 g/只，暫養(yǎng)于實驗室1周。暫養(yǎng)水溫（27±1）℃，于每日下午17：00時投喂河蟹配合飼料。采集肝胰腺、鰓、腸道、血細(xì)胞、心臟、肌肉和眼柄等組織于液氮迅速冷凍后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。在鰻弧菌感染試驗中，將中華絨螯蟹隨機(jī)分成對照組和感染組，每組30只。對照組每只注射40.0 μL PBS緩沖液;感染組每只注射40.0 μL鰻弧菌懸液，菌液濃度為1.0×107 CFU/mL，并分別于感染后0、6、12、24、48和72 h時采集中華絨螯蟹的肝胰腺組織。HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ SYBR? qPCR Master Mix及FastPure Tissue Total RNA Isolation Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖、pMD19-T載體、DNA Marker和連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司，鰻弧菌菌種購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心。

1. 2 RNA提取及cDNA合成

使用FastPure Tissue Total RNA Isolation Kit試劑盒提取中華絨螯蟹肝胰腺組織總RNA，提取的總RNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計測定其濃度和純度;再以HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 EsPrx基因克隆

將中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，從中篩選出EsPrx基因片段，采用Primer 5.0設(shè)計引物（表1），并委托天霖生物科技（上海）有限公司合成。以中華絨螯蟹肝胰腺cDNA為模板，使用特異性引物X1-F、X1-R、Prx1-F和AP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行切膠回收，并連接至pMD19-T載體上，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1. 4 生物信息學(xué)分析

采用Vector NTI Suite對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接;利用DNAStar獲取EsPrx基因開放閱讀框（ORF），并預(yù)測其推導(dǎo)氨基酸序列;通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行同源比對分析;使用ClustalW對EsPrx氨基酸序列和其他物種的Prx氨基酸序列進(jìn)行多序列對比，同時以MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;利用ExPASy（http：//www.expasy.org/proteomics）分析EsPrx蛋白理化性質(zhì)，運(yùn)用TMHMM Server v.2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，使用PSORTⅡServer（https：//www.genscript. com/psort.html）預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位，采用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，運(yùn)用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽分析，并以NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測其磷酸化位點。

1. 5 EsPrx基因組織表達(dá)分析

以β-actin為內(nèi)參基因，無菌水為陰性對照。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，5倍稀釋的cDNA模板2.0 μL，10 μmol/L的上、下游引物（qPrx1-F和qPrx1-R）各1.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán);熔解段為95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，采用2-ΔΔCt法換算EsPrx基因相對表達(dá)量，并以SPSS 22.0和GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 EsPrx基因序列分析結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄組序列比對，得知EsPrx基因全長1599 bp，其中，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）為46 bp，ORF為597 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）為956 bp。3'-UTR包括1個終止密碼子（TGA）及典型的加尾信號（AATAAA）和poly（A）尾巴（圖1）。EsPrx基因共編碼198個氨基酸殘基，含有Prx特有的2個結(jié)構(gòu)域（FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA）。

2. 2 EsPrx蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果

EsPrx蛋白分子式為C994H1544 N258O293S8，原子總數(shù)為3097，分子量為22.05 kD，理論等電點（pI）為5.67。在EsPrx蛋白氨基酸序列中，氨基酸豐度依次為亮氨酸（Leu，占8.6%）、甘氨酸（Gly，占7.6%）、賴氨酸（Lys，占7.6%）、丙氨酸（Ala，占7.1%）、天冬氨酸（Asp，占7.1%）、苯丙氨酸（Phe，占7.1%）、纈氨酸（Val，占6.6%）、谷氨酸（Glu，占6.1%）、絲氨酸（Ser，占6.1%）、蘇氨酸（Thr，占6.1%）、異亮氨酸（Ile，占5.6%）、脯氨酸（Pro，占5.1%）、精氨酸（Arg，占4.0%）、天冬酰胺（Asn，占3.5%）、谷氨酰胺（Gln，占3.0%）、絡(luò)氨酸（Tyr，占2.5%）、半胱氨酸（Cys，占2.0%）、蛋氨酸（Met，占2.0%）、組氨酸（His，占1.5%）和色氨酸（Trp，占1.0%）。EsPrx蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，多肽鏈的第41位氨基酸分值最高（1.889），第63位氨基酸分值最低（-2.178），總平均親水性為 -0.193，即為親水性蛋白。EsPrx蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為30.34，表明該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。NetPhos 3.1 Server預(yù)測結(jié)果顯示，EsPrx蛋白的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位點數(shù)分別為7、9和1個。

2. 3 EsPrx蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

SignalP 5.0預(yù)測結(jié)果顯示，EsPrx蛋白無信號肽。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果表明，EsPrx蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有78個無規(guī)則卷曲（占39.39%）、62個α-螺旋（占31.31%）、42條延伸鏈（占21.21%）及16個β-折疊（占8.08%）。EsPrx蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，第1～198位氨基酸均位于細(xì)胞膜表面（圖2）;PSORTⅡServer亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，EsPrx蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率為52.2%，定位于線粒體的概率為26.1%，而其他細(xì)胞器的定位概率相對較低。由此推測EsPrx蛋白屬于非分泌性蛋白。

2. 4 EsPrx基因同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

從NCBI下載已公布的Prx氨基酸序列，利用BLAST對EsPrx氨基酸序列與各參考Prx氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)EsPrx氨基酸序列與扁額青蟹（Eurypanopeus depressus）、擬穴青蟹和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的Prx氨基酸序列高度同源，對應(yīng)的相似性分別89%、89%和88%?；赑rx氨基酸序列相似性，對中華絨螯蟹、擬穴青蟹、扁額青蟹、南美白對蝦（P. vannamei）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）和斑馬魚（Danio rerio）等13個物種的18種Prx氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，EsPrx氨基酸序列先與擬穴青蟹、扁額青蟹及南美白對蝦的Prx氨基酸序列聚在一起，再與其他動物的2-Cys Prx氨基酸序列聚類。

2. 5 EsPrx基因在中華絨螯蟹組織中的表達(dá)特征

以β-actin為內(nèi)參基因，同時以血細(xì)胞的EsPrx基因相對表達(dá)量為基準(zhǔn)，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，在中華絨螯蟹肝胰腺、血細(xì)胞、鰓、肌肉、眼柄、心臟和腸道等組織中均能檢測到EsPrx基因，即EsPrx基因廣泛表達(dá)（圖5）。在中華絨螯蟹各組織中，以肝胰腺的EsPrx基因相對表達(dá)量最高，為血細(xì)胞的3.66倍;鰓組織的EsPrx基因相對表達(dá)量次之，為血細(xì)胞的2.27倍;其他組織中的相對表達(dá)量則極顯著低于肝胰腺和鰓組織（P<0.01，下同），尤其是在腸道和心臟的相對表達(dá)量較低，約為血細(xì)胞的25%。

2. 6 EsPrx基因在鰻弧菌感染下的表達(dá)情況

以鰻弧菌感染中華絨螯蟹后，利用實時熒光定量PCR測定EsPrx基因在中華絨螯蟹肝胰腺中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，以感染0 h肝胰腺中的EsPrx基因相對表達(dá)量為基準(zhǔn)，感染6 h的EsPrx基因相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05，下同），感染12 h的EsPrx基因相對表達(dá)量持續(xù)升高，至感染24 h其相對表達(dá)量達(dá)最高值，與對照組的差異極顯著;隨后急速下降，降至正常水平以下，感染48 h時與對照組的差異顯著，但感染72 h后又恢復(fù)至正常水平（圖6）。對照組中各時間點的EsPrx基因相對表達(dá)量略有起伏，但差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

Prx進(jìn)化相對保守，廣泛存在于原核生物和真核生物中（Hofmann et al.，2002），能調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織中ROS的平衡，既能有效保護(hù)生物不受氧化應(yīng)激的侵害，又能準(zhǔn)確控制正常生理代謝中的過氧化物濃度（Wood et al.，2003）。至今，已在多種甲殼動物中研究發(fā)現(xiàn)Prx基因，但大部分只發(fā)現(xiàn)某一亞型，如三疣梭子蟹（Chen et al.，2011）、脊尾白蝦（Duan et al.，2013）及日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）（孫盛明等，2014）等。本研究結(jié)果表明，EsPrx氨基酸序列的N端和C端均含有1個保守的半胱氨酸殘基，且與其他蝦蟹類的Prx氨基酸序列高度相似，即屬于未分化的Prx1/2。基于Prx氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，EsPrx氨基酸序列先與擬穴青蟹、扁額青蟹及南美白對蝦的Prx氨基酸序列聚在一起，再與其他動物的2-Cys Prx氨基酸序列聚類，進(jìn)一步證實EsPrx基因?qū)儆谖捶只腜rx基因，即Prx1/2基因。

大量研究表明，Prx基因在生物體內(nèi)的各種組織中均有表達(dá)，說明Prx具有廣泛的抗氧化作用（Gross et al.，2001;卜瑞倩，2018）;但Prx基因在不同組織中的表達(dá)水平存在差異，且一般在免疫組織中高表達(dá)，即Prx基因具有組織偏好性。Mu等（2008）研究證實，Prx6基因在中華絨螯蟹的肝胰腺、心臟、性腺、血細(xì)胞、肌肉和鰓組織中均有表達(dá)，但以肝胰腺中的表達(dá)量最高。Chen等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，Prx基因在三疣梭子蟹的肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸道、鰓、卵巢和血細(xì)胞中均有表達(dá)，尤其以在肝胰腺和鰓組織中的表達(dá)量較高。孫盛明等（2014）研究表明，Prx基因在日本沼蝦的肝胰腺、卵巢、肌肉、心臟、鰓和腸道中均有表達(dá)，且以在肝胰腺中的表達(dá)量最高。本研究通過實時熒光定量PCR檢測到EsPrx基因在所檢測組織中均有表達(dá)，但不同組織中的相對表達(dá)量存在明顯差異，其中以肝胰腺中的相對表達(dá)量最高，極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量，與在三疣梭子蟹（Chen et al.，2011）和日本沼蝦（孫盛明等，2014）中的研究結(jié)果類似，同時說明肝胰腺在中華絨螯蟹體內(nèi)發(fā)揮著重要的免疫作用。

甲殼動物的肝胰腺在體液免疫和基礎(chǔ)代謝中發(fā)揮著重要作用，其功能與哺乳動物的肝臟和胰臟相似（Roszer，2014），大多數(shù)免疫相關(guān)基因在肝胰腺中均呈高水平表達(dá)（Gross et al.，2001）。大量研究表明，當(dāng)生物機(jī)體受應(yīng)激時，Prx作為維持機(jī)體氧化平衡的重要生物酶，其表達(dá)發(fā)生明顯變化（Fujii and Ikeda，2002;章波等，2004）。經(jīng)人工感染W(wǎng)SSV后，中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）Prx4基因在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)顯著上調(diào)（Zhang et al.，2014）;在鰻弧菌侵染后，脊尾白蝦EcPrx5基因在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)水平也顯著增加，且顯示出不同的表達(dá)譜（Duan et al.，2013）;在鎘刺激條件下，擬穴青蟹Prx基因相對表達(dá)量在刺激6 h后迅速升高，但在刺激12 h后隨即恢復(fù)正常水平（Tu et al.，2018）。在本研究中，EsPrx基因表達(dá)在鰻弧菌刺激下的不同時間段存在明顯差異，在感染6～24 h其相對表達(dá)量顯著升高，而后迅速降至正常水平，表明EsPrx基因在鰻弧菌感染過程中發(fā)揮了重要作用，與Zhang等（2014）、Tu等（2018）的研究結(jié)論一致，即在外界因子刺激下Prx基因的表達(dá)水平先上升后降低。可見，Prx對外部環(huán)境刺激敏感，能及時清除機(jī)體損傷產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促使機(jī)體盡快恢復(fù)至正常生理狀態(tài)（朱江艷，2013）。

4 結(jié)論

EsPrx基因為甲殼動物未分化的Prx1/2基因，在中華絨螯蟹肝胰腺中高表達(dá)，并參與鰻弧菌感染的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，即在抗逆過程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-08-25

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項（2020TD36）;江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（PZCZ201749）;江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（JATS〔2019〕385）;江蘇省漁業(yè)技術(shù)類重大項目（D2018-4）

通訊作者：唐永凱（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-5643-2844，博士，研究員，主要從事河蟹遺傳育種研究工作，E-mail：tangyk@ffrc.cn

第一作者：李輝（1995-），https：//orcid.org/0000-0003-2207-9090，研究方向為河蟹遺傳育種，E-mail：1147067174@qq.com