一個(gè)巴西橡膠樹過氧化物酶基因克隆與生物信息學(xué)分析

鄧玉杰+余海洋+張宇+王萌

摘 要 采用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，在橡膠樹熱研7-33-97的葉片中擴(kuò)增了一個(gè)過氧化物酶基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為HbPRX2。該基因全長(zhǎng)1 179 bp，5端29 bp，3端145 bp，閱讀框1 005 bp，編碼335個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸理論分子量34.85 u，等電點(diǎn)4.98。推導(dǎo)的氨基酸含有過氧化物酶蛋白特征性的Peroxidase4結(jié)構(gòu)域。HbPRX2蛋白與巴西橡膠樹HbPRX1、HbPRX42、擬南芥AtPER42和水稻OsPRX33的過氧化物酶蛋白相似性分別為63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。生物信息學(xué)分析表明，橡膠樹HbPRX2蛋白定位于分泌途徑中，屬于親水性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定，在7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸處具有跨膜結(jié)構(gòu)域，在29-30氨基酸處具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。本研究為深入研究HbPRX2基因的結(jié)構(gòu)與功能及其抗逆機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；HbPRX2 ；生物信息學(xué) ；基因克隆

中圖分類號(hào) S794.1

Cloning and Bioinformatic Analysis of a Peroxidase Gene in Rubber Tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg）

DENG Yujie YU Haiyang ZHANG Yu WANG Meng

（Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract Peroxidase is the enzyme of catalytic oxidation of substrates using hydrogen peroxide as electron acceptor. In this study，one peroxidase gene full length cDNA was amplified in the leaf in rubber tree clone CATAS7-33-97，designated as HbPRX2， It was 1 179 bp in length，containing a 1 005 bp ORF which encodes 335 amino acid residues，a 145 bp 3'untranslation region and a 29 bp 5'untranslation region. The molecular mass of the putative protein is 34.85 kDa with its theoretical pI of 4.98. The deduced amino acid sequence had the specific domains of plant peroxidase like super-family domain peroxidase4. It shares 63.22%，32.37%，33.73% and 37.80% identities with Hevea brasiliensis HbPRX1，HbPRX42，Arabidopsis AtPER42 and rice OsPRX33，respectively. The bioinformatic analysis showed that HbPRX2 protein is a hydrophilous protein which have an secretion pathway signal. It was a stable protein with transmembrane region at 7-24，36-55，130-151，and 278-301 amino acid and signal Peptide at 29-30 amino acid， respectively. This study provides a fundamental knowledge of further study the structure and functions of HbPRX2.

Key words Hevea brasiliensis ；HbPRX2 ；bioinformatics ；gene cloning

ClassIII型過氧化物酶（Peorxidaes，EC1.11.1.7）是一類以血紅素為輔基的酶，在生物中廣泛存在，具有多種不同的生物功能[1-2]，主要催化過氧化氫對(duì)多種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用，包括酚類、生長(zhǎng)素、木質(zhì)素前體和次生代謝產(chǎn)物[3-4]。它是多基因家族成員，在水稻中有138個(gè)成員[5]，在擬南芥有73個(gè)成員[6]，同時(shí)它也是糖蛋白，位于植物液泡和細(xì)胞壁中[7]。過氧化物酶蛋白的分子量約為30-45 ku，由大概300個(gè)氨基酸殘基組成，其中存在酸堿催化域和血紅素結(jié)合區(qū)域[常含8個(gè)半胱氨酸（構(gòu)成4個(gè)二硫鍵橋）]，2個(gè)鈣離子結(jié)合區(qū)，在ASp99和Argl23還有一個(gè)鹽橋，2-6個(gè)糖基化位點(diǎn)，一個(gè)原高鐵血紅素。目前，除了水稻和擬南芥等模式植物外[8-10]，已在甘蔗[11]、大豆[12]中克隆了過氧化酶基因。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來源，橡膠樹的乙烯利刺激割制[13]、病原菌侵害和環(huán)境危害[14]等都會(huì)引起橡膠樹膠乳活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致黃色體破裂。過氧化物酶作為活性分子的主要生物淬滅劑，有助于保護(hù)橡膠樹免受活性氧的危害。因此，克隆巴西橡膠樹膠乳中的過氧化物酶基因并研究其結(jié)構(gòu)和功能對(duì)天然橡膠產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以定植在海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)基地的巴西橡膠樹無性系CATAS7-33-97的葉片為材料。

1.1.2 質(zhì)粒、菌種和試劑盒

克隆載體pMD18-T Vector、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自中國(guó)大連Takara公司；凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR Master Mix，pfu Master Mix等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；其他生化試劑和常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所有引物合成及測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 葉片RNA的提取

RNA提取參照馬瑞豐等[15]的方法。RNA質(zhì)量檢測(cè)：取1 μL RNA樣品用RNase-Free ddH2O稀釋至500 μL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD230、OD260、OD280的吸收值，并根據(jù)OD260/OD230、OD260/OD280計(jì)算總RNA溶液的濃度及純度。用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄

用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在0.2 mL的Eppendorf管中依次加入總RNA 1 μL，QT引物1 μL，以1 ‰ DEPC處理水補(bǔ)足12 μL，混勻，瞬時(shí)離心；隨后于70 ℃中孵育5 min，冰上冷卻，瞬時(shí)離心；依次加入5×reaction buffer 4 μL，RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor（20 u/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，輕輕混勻，瞬時(shí)離心；在37 ℃中孵育5 min；隨后加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200 u/μL）1 μL，于42 ℃中孵育60 min；最后以70 ℃加熱10 min終止反應(yīng)，冰上冷卻，稀釋5倍，于-20 ℃保存。

1.2.3 橡膠樹葉片過氧化物酶基因序列的克隆

根據(jù)在NCBI上搜索的橡膠樹EST序列，設(shè)計(jì)過氧化物酶基因特異引物（表1）。

在0.2 mL的離心管中分別加入以下成分：反轉(zhuǎn)錄液1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，PrxS1或PrxS2 1 μL，PrxA1或PrxA2 1 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。混勻后，在DNA Thermo Cycler T1上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切下目的片段，用凝膠回收純化試劑盒回收并克隆至pMD18-T載體，送交測(cè)序。

1.2.4 基因結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN7.0軟件進(jìn)行DNA和蛋白序列比對(duì)，用DNAstar軟件進(jìn)行ORF篩選，用NCBI Blast軟件和PROSITE軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，用ProtParam分析理化性質(zhì)，用ProtScale分析親水性，用SignalP分析信號(hào)肽，用TMpred和TMHMM分析跨膜結(jié)構(gòu)域，用PSORT、Mitoprot和TargetP分析細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

甲醛變性凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，28S rRNA、18S rRNA分帶清晰，且28S rRNA的量約是18S rRNA的2倍，說明所提取的總RNA完整性好，幾乎無降解（圖1-A）。取1 μL橡膠樹葉片總RNA稀釋至500 μL后進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其OD260/OD280為2.06，表明RNA樣品幾乎沒有蛋白質(zhì)污染，而OD260/OD230為2.1，表明幾乎沒有酚和多糖類物質(zhì)的污染，符合下一步反轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增要求。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明擴(kuò)增出了約1 200 bp的條帶（圖1-B），與預(yù)測(cè)片段大小基本一致。將擴(kuò)增的DNA片段回收后，與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選重組子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所克隆的cDNA全長(zhǎng)1 179 bp，命名為HbPRX2。

2.2 HbPRX2序列分析

HbPRX2基因全長(zhǎng)1 179 bp，5端29 bp，3端145 bp，閱讀框1 005 bp，編碼335個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸理論分子量為34.85 u，等電點(diǎn)為4.98（圖2）。分子式為C1513H2394N420O500S12，總原子數(shù)4 839。圖3和表2是根據(jù)橡膠樹HbPRX2的cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物中的過氧化物酶基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性比較結(jié)果。從中可以看出，HbPRX2推導(dǎo)的氨基酸含有HbPRX2蛋白特征性的PEROXIDASE_4結(jié)構(gòu)域。HbPRX2基因與巴西橡膠樹HbPRX1、HbPRX42、擬南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的過氧化物酶蛋白序列相似性分別為63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

2.3 HbPRX2生物信息學(xué)分析

2.3.1 HbPRX2蛋白結(jié)構(gòu)域功能分析

植物的過氧化物酶大多含有一個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域：PEROXIDASE_4， PS50873。Class III型過氧化物酶位于細(xì)胞外空間或者植物的液泡中，參與過氧化氫的解毒活動(dòng)、生長(zhǎng)素代謝、木質(zhì)素生物合成和脅迫反應(yīng)，含有4個(gè)保守的二硫化物橋和2個(gè)保守的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。從圖4可以看出HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4結(jié)構(gòu)域，并與其它過氧化物酶成員高度保守，屬于過氧化物酶家族成員（圖4）。

2.3.2 HbPRX2蛋白的信號(hào)肽分析

根據(jù)SignalP-4.1工具在線分析結(jié)果，HbPRX2蛋白在29-30氨基酸處具有一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖5）。

2.3.3 HbPRX2蛋白的親水性分析

利用ProtScale預(yù)測(cè)巴西橡膠樹HbPRX2蛋白氨基酸序列的親水性/疏水性（圖6）。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可以看出，多肽鏈第20位具有最高的分值3.600和最強(qiáng)的疏水性；第257位具有最低的分值-1.733和最強(qiáng)的親水性。橡膠樹HbPRX2的整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

2.3.4 HbPRX2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)TMHMM和TMpred網(wǎng)站分析，超過500分的才被認(rèn)為顯著。從圖7中可以看出HbPRX2蛋白有4個(gè)跨膜螺旋，分別位于7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸殘基處，分?jǐn)?shù)為3812，達(dá)到500分的顯著值，故可推測(cè)HbPRX2含有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖7）。

2.3.5 HbPRX2蛋白的細(xì)胞定位分析

根據(jù)TargetP 1.1分析， HbPRX2蛋白在葉綠體中的可能性為0.018，在分泌信號(hào)途徑中的可能性為0.905，在其他部位的可能性為0.009（表3），推測(cè)該蛋白含有信號(hào)肽，屬于分泌信號(hào)途徑，可靠性級(jí)別為1；經(jīng)Mitoprot分析可知，其在線粒體外的幾率為0.4163；運(yùn)用PSORT分析細(xì)胞定位，證明其在外部的確定性為0.82，在溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的確定性為0.100（表4）。

3 討論與結(jié)論

血紅素結(jié)合的過氧化物酶（EC1.11.1.）用過氧化氫作為電子受體實(shí)行各種合成和降解功能[10]。血紅素過氧化物酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物和脊椎動(dòng)物中。根據(jù)結(jié)構(gòu)特性，它們可劃分為植物和動(dòng)物2個(gè)大型超家族。植物過氧化物酶超家族可分為3類：第I類是原核來源的過氧化物酶，包括植物抗壞血酸過氧化物酶，它們?cè)诟叩戎参锶~綠體和細(xì)胞質(zhì)的過氧化氫去除過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如酵母細(xì)胞色素c過氧化物酶（EC1.11.1.5）；第II類是分泌真菌過氧化物酶——真菌木質(zhì)酶，木質(zhì)酶催化降解木質(zhì)素的第一步是通過催化C（α）C（β）丙基側(cè)鏈裂解木質(zhì)素；第III類是經(jīng)典分泌植物過氧化物酶——植物過氧化物酶（EC1.11.1.7）。植物中含有大量的過氧化物酶同工酶，其中一些在細(xì)胞栓化過程中起著催化細(xì)胞壁上的木栓質(zhì)芳香殘留沉積的作用，有些是參與傷信號(hào)的防御反應(yīng)，其他都參與生長(zhǎng)素的代謝和木質(zhì)素的生物合成[16-17]。

在橡膠樹愈傷組織中也檢測(cè)到了過氧化物酶[18]，并在橡膠樹樹皮中克隆了一個(gè)50 ku的過氧化物酶[19]，在細(xì)胞懸浮液中通過生化方法鑒定了一個(gè)過氧化物酶[20]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)HbPRX2蛋白與巴西橡膠樹HbPRX1、HbPRX42、擬南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的過氧化物酶蛋白相似性分別為63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

植物的過氧化物酶大多含有一個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域：PEROXIDASE_4， PS50873。所有的過氧化物酶都有非朊基血紅素基團(tuán)，以過氧化氫為受體參與多種氧化反應(yīng)[21-22]。HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4結(jié)構(gòu)域，并與其它過氧化物酶成員高度保守，屬于過氧化物酶家族成員。生物信息學(xué)分析表明，橡膠樹HbPRX2蛋白定位于分泌途徑中，屬于親水性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定，在7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸處具有跨膜結(jié)構(gòu)域，在29-30氨基酸處具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。可為下一步深入研究其功能及原核表達(dá)、亞細(xì)胞定位等提供參考。

從橡膠樹中克隆了橡膠樹過氧化物酶基因HbPRX2，其含有特征性的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，為深入研究HbPRX2的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

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