miR-486對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖及PI3k-Akt信號通路相關(guān)基因表達的影響

王世銀 張偉 劉曉娜 楊力偉 鄧雙義

摘要：【目的】明確miR-486對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖及PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達的影響，為揭示miR-486對綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳园褪舶菅?日齡羔羊后肢骨骼肌衛(wèi)星細胞為研究對象，通過轉(zhuǎn)染miR-486 mimics和miR-486 inhibitor致使綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486水平上調(diào)或下調(diào)，探究miR-486對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度及PI3K-Akt信號通路中PTEN、GSK3b、PRKCα、Raf-1、MAPK1、PKN1、Casp9和SGK1等8個相關(guān)基因表達變化的影響?！窘Y(jié)果】空白對照及轉(zhuǎn)染miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞均表現(xiàn)出典型的S形增殖曲線，但各處理間的細胞增殖速度存在明顯差異。當綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486水平上調(diào)可促使細胞進入快速增殖狀態(tài)，而miR-486水平下調(diào)可使細胞保持靜止狀態(tài)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，當綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486水平上調(diào)時，可引起PTEN、Raf-1和MAPK1基因相對表達量極顯著下調(diào)（P<0.01，下同），PRKCα和PKN1基因相對表達量極顯著上調(diào)，SGK1基因相對表達量顯著上調(diào)（P<0.05）;而GSK3β和Casp9基因相對表達量在不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞間的差異均不顯著（P>0.05），可能在維持綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞基本生命活動中發(fā)揮作用?！窘Y(jié)論】miR-486通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達而參與綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞生長發(fā)育及增殖，為深入研究miR-486對綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機理及優(yōu)質(zhì)肉羊品種培育打下了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 綿羊;miR-486;骨骼肌衛(wèi)星細胞;PI3K-Akt信號通路;增殖;基因表達

中圖分類號：S826.8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2276-08＼

Effects of miR-486 on proliferation of sheep （Ovis aries） skeletal muscle satellite cells and expression of genes related

to PI3K-Akt signal pathway

WANG Shi-yin， ZHANG Wei*， LIU Xiao-na， YANG Li-wei， DENG Shuang-yi

（Xinjiang Agricultural Professional Technological College， Changji， Xinjiang ?831100， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of miR-486 on proliferation of sheep （Ovis aries） skeletal muscle sa-tellite cell and expression level of genes related to PI3K-Akt signal pathway， and finally lay the foundation for illumina-ting the ?regulatory mechanism of miR-486 on development of sheep skeletal muscle. 【Method】Here the skeletal muscle satellite cells of one day-old Bashby sheep were applied， and the proliferation of satellite cells and the expression levels of 8 key genes， PTEN， GSK3b， PRKCα， Raf-1， MAPK1， PKN1， Casp9 and SGK1 in PI3K-Akt signal pathway were detected when the level of miR-486 in cells were up- or down-regulated by transferring into miR-486 mimics and miR-486 inhibitor. 【Result】The result showed that the skeletal muscle satellite cells in blank control and treated by miR-486 mi-mics， miR-486 mimics negative control， and miR-486 inhibitor negative control all performed the typical S-shaped proli-feration curve， but thespeed of proliferation existed great differenceamong treatments. The proliferation of satellite cells was accelerated when the level of miR-486 was up-regulated， conversely when the level of miR-486 was down-regulated and the cells kept rest state. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression levels of PTEN， Raf-1， and MAPK1 were extremely significantly down-regulated （P<0.01， the same below）， levels of PRKCα and PKN1 were extremely significantly up-regulated， and level of SGK1gene was also significantly up-regulated（P<0.05）， when the level of miR-486 was up-regulated in satellite cells， but the relative expression levels of GSK3β and Casp9 gene did not show significantly different（P>0.05） no matter the level of miR-486 was up-regulated or down-regulated in satellite cells， maybe these two genes played important roles in essential activity of satellite cells. 【Conclusion】miR-486 can affect the proliferation of sheep skeletal muscle satellite cell by regulating the expression of genes in PI3K-Akt signal pathway， and provided a theoretical basis for further investigate the regulation mechanism of miR-486 on skeletal muscle development of sheep and breeding of high-quality mutton sheep breeds.

Key words： sheep; miR-486; skeletal muscle satellite cell; PI3K-Akt signal pathway; proliferation; gene expression

Foundation item： Xinjiang Natural Science Foundation （2017D01A51）

0 引言

【研究意義】提高產(chǎn)肉性能一直是綿羊育種的重要目標。在動物骨骼肌生長發(fā)育過程中，從胚胎期成肌細胞的遷移、增殖和分化，到出生后骨骼肌細胞的進一步生長發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持，均受一個分子網(wǎng)絡(luò)的精細調(diào)控（Puri and Sartorelli，2000），但目前對于這一網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的作用機制知之甚少。因此，深入研究并闡明綿羊骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機制，尋找與綿羊骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)的基因及信號通路，并應(yīng)用于分子育種方案，能有效提高綿羊育種效率及促進優(yōu)良肉羊品種培育?！厩叭搜芯窟M展】miRNA是一類由22個左右核苷酸構(gòu)成的小分子非編碼RNA，參與細胞增殖、凋亡、分化，以及機體發(fā)育、代謝和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程的調(diào)控（Cheng et al.，2005;Croce and Calin，2005;Hwang and Mendel，2006;Tavazoie et al.，2008）。miRNA-148（miR-486）來源于Ankyrin-1基因（Ank-1）的第40個內(nèi)含子，最早發(fā)現(xiàn)于人類胚胎肝組織中（Small et al.，2010）。PI3K-Akt信號通路參與肌肉生長發(fā)育、代謝調(diào)控及穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學(xué)過程的調(diào)控，在抗肌萎縮蛋白缺陷型肌肉和杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥等疾病中均能檢測到PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的異常表達或蛋白的異常磷酸化（Small et al.，2010;Alexander et al.，2011）。已有研究表明，miR-486通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達，而在肌肉發(fā)育及杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥等疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用（Alexander et al.，2011;Hitachi et al.，2014）。骨骼肌衛(wèi)星細胞來源于胚胎階段的成肌細胞（Myoblast），對骨骼肌組織的損傷修復(fù)及穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要（Shahini et al.，2018）。骨骼肌衛(wèi)星細胞附著在肌纖維肌膜與基底膜之間，保持靜息狀態(tài)，當骨骼肌組織受損時，衛(wèi)星細胞被激活，并進入增殖和分化狀態(tài)，最終形成新的肌纖維以修復(fù)受損的骨骼肌組織（解一凡等，2019;秦本源等，2020）。綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞在體外易于培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，是研究骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控機制的理想材料（張偉等，2019）。豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖能力強且具有多向分化潛能，可作為種子細胞用于未來組織工程研究（秦本源等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】miR-486在綿羊骨骼肌和心肌中高表達，且在出生后綿羊骨骼肌中的表達量顯著上調(diào)（張偉等，2018，2020），但在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中miR-486是否是通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達而發(fā)揮其生物學(xué)功能仍有待進一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過上調(diào)或下調(diào)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的miR-486，探究miR-486對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖及PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達的影響，以期為闡明miR-486對綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗所用綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞為省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室使用巴什拜羊1日齡羔羊后肢骨骼肌組織通過原代培養(yǎng)獲得，保存于液氮中。DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA和胎牛血清購自美國Gibco公司，青霉素+鏈霉素（雙抗）購自美國Sigma公司，Lipofectamine 3000、TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Thermo公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，細胞培養(yǎng)皿和24孔板購自美國Corning公司，miR-486 mimics和miR-486 inhibitor及其陰性對照序列（表1）委托GenePharma公司合成，對應(yīng)的擴增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出1支綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞凍存管，迅速置于50 ℃水浴鍋中，待完全解凍后取出，擦干水，并以75%酒精消毒凍存管表面，然后轉(zhuǎn)入6 cm培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基（89% DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗），然后置于5% CO2培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)。

1. 2. 2 細胞轉(zhuǎn)染 將綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞按每孔約5000個細胞的密度接種至24孔板，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞良好貼壁生長后參照Lipofectamine 3000的操作說明將miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control、miR-486 inhibitor和miR-486 inhibitor negative control分別轉(zhuǎn)染綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞，以不轉(zhuǎn)染任何試劑的細胞組為空白對照。每處理轉(zhuǎn)染8孔細胞，共計40孔細胞。

1. 2. 3 細胞增殖速度測定 上述轉(zhuǎn)染細胞每組留1孔用于觀察細胞的生長狀態(tài)，其余各孔每隔24 h消化1孔，采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，評估不同處理對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度的影響。

1. 2. 4 細胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 上述培養(yǎng)72 h的轉(zhuǎn)染細胞待完成細胞計數(shù)后，參照TRIzol說明提取細胞總RNA，使用微量分光光度計（ND2000，美國Thermo公司）和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。檢測合格的RNA參照SuperScript IV VILO（美國Thermo公司）操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存，用于相關(guān)基因表達的定量檢測。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR檢測 選擇PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵基因PTEN（Phosphatase and tensin homolog）、GSK3b（Glycogen synthase kinase-3 beta）、PRKCα（Protein kinase C alpha）、Raf-1（Raf-1 proto-oncogene，serine/threonine kinase）、MAPK1（Mitogen-activated protein kinase 1）、 PKN1（Protein kinase N1）、Casp9（Caspase 9）和SGK1（Serum/glucocorticoid regulated kinase 1），檢索Ensembl數(shù)據(jù)庫，獲取其mRNA序列，然后使用Oligo 6.0設(shè)計實時熒光定量PCR擴增引物（表2），以β-actin為內(nèi)參基因，空白對照組細胞中相應(yīng)基因的表達量為對照，對上述基因在不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達變化進行定量分析。上述基因在Ensembl數(shù)據(jù)庫中的登錄號及實時熒光定量PCR擴增引物見表2。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。實時熒光定量PCR定量分析在Roche LightCycler 96（德國Germany公司）上完成，擴增反應(yīng)結(jié)束后以0.1 ℃/s的速度進行熔解曲線分析。

1. 3 統(tǒng)計分析

PI3K-Akt號通路關(guān)鍵基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行換算，并以SPSS 13.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。各試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2. 1 miR-486對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

由圖1可知，空白對照組及轉(zhuǎn)染miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞表現(xiàn)出典型的S形增殖曲線，但各處理間的細胞增殖速度存在明顯差異。轉(zhuǎn)染miR-486 mimics能使綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的miR-486水平上調(diào)，骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度加快，培養(yǎng)至48 h即開始進入對數(shù)生長階段;而空白對照組及轉(zhuǎn)染miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度未見明顯變化;轉(zhuǎn)染miR-486 inhibitor致使綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的miR-486水平下調(diào)，骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖基本停滯（圖2），提示miR-486在促進綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用。

2. 2 PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達變化

PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測的熔解曲線均為單峰，實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得明亮的單一條帶，且條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖3），說明實時熒光定量PCR的反應(yīng)效率和特異性均較高，檢測結(jié)果可靠。

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖4）表明，PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因在不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的相對表達量存在明顯差異。其中，PTEN、Raf-1和MAPK1基因在轉(zhuǎn)染miR-486 mimics綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的相對表達量極顯著低于其他處理組（P<0.01，下同），但在其他處理組間的差異不顯著（P>0.05，下同）;PRKCα和PKN1基因在轉(zhuǎn)染miR-486 mimics綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的相對表達量極顯著高于其他處理組，但在其他處理組間的差異不顯著;SGK1基因在轉(zhuǎn)染miR-486 mimics綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的相對表達量顯著高于其他處理組（P<0.05，下同），但在其他處理組間的差異不顯著;GSK3β和Casp9基因在不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞間的差異均不顯著。

綜合不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖情況可知，轉(zhuǎn)染miR-486 mimics綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度的加快，可能與細胞中PTEN、Raf-1和MAPK1基因下調(diào)表達，以及PRKCα、PKN1和SGK1基因上調(diào)表達有關(guān);而GSK3β和Casp9基因可能在維持綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞基本生命活動中發(fā)揮作用，因此其相對表達量在不同處理組間無顯著差異。

3 討論

骨骼肌衛(wèi)星細胞由胚胎期的成肌細胞分化而來，屬于肌源性干細胞（Shahini et al.，2018）。在體內(nèi)，當骨骼肌受高強度鍛煉、損傷或其他刺激后，處于靜止狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細胞被激活，通過增殖和分化成肌纖維以維持骨骼肌組織的進一步生長或完成受損組織修復(fù)（Griffin et al.，2010;Yin et al.，2013;鄭琪等，2017）。在體外，骨骼肌衛(wèi)星細胞不僅可被誘導(dǎo)分化為肌管，還能通過不同誘導(dǎo)方式使其分化為脂肪細胞、骨細胞及胰島素生成細胞等（薛科等，2014;任宇等，2018;秦本源等，2020;張軍芳等，2020）。可見，骨骼肌衛(wèi)星細胞是體外研究細胞增殖和誘導(dǎo)分化調(diào)控機制的理想材料。本研究結(jié)果表明，上調(diào)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486的水平可其進入快速分裂增殖狀態(tài)，而骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486的水平下調(diào)后，即使在增殖培養(yǎng)基中其仍保持靜止狀態(tài)，故推測miR-486水平上調(diào)可激活骨骼肌衛(wèi)星細胞，并促進其增殖。在杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥患者的肌組織中，肌纖維出現(xiàn)萎縮，處于靜止狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細胞未被激活而直接進入增殖及分化狀態(tài)，因此無法修復(fù)萎縮的肌組織（仝昕煒，2017）。已有研究表明，肌組織中miR-486的表達水平顯著低于正常值，故推測骨骼肌衛(wèi)星細胞無法被激活與miR-486表達水平下調(diào)有關(guān)（Small et al.，2010;Alexander et al.，2014），提示miR-486的表達對骨骼肌組織正常生長發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持具有重要意義。

不同處理組綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，當綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486表達上調(diào)時，PTEN、Raf-1和MAPK1基因的相對表達量極顯著下調(diào)，PRKCα和PKN1基因的相對表達量極顯著上調(diào)，SGK1基因的相對表達量顯著上調(diào)，而GSK3β和Casp9基因的相對表達量無顯著變化，提示在綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達而影響其生長發(fā)育。本課題組對綿羊骨骼肌中miR-486靶基因cDNA文庫的研究表明，PI3K-Akt信號通路中的PTEN、Foxo1和PIK3R1基因直接受miR-486靶向調(diào)控，說明本研究檢測到因miR-486表達上調(diào)引起的PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達變化是通過PTEN和PIK3R1基因表達下調(diào)而引起，而在細胞水平上表現(xiàn)為骨骼肌衛(wèi)星細胞進入快速增殖狀態(tài)。此外，PI3K-Akt信號通路在骨骼肌穩(wěn)態(tài)的維持中也發(fā)揮重要作用。Small等（2010）研究表明，miR-486可通過激活PI3K-Akt信號通路而參與小鼠肌肉的生長調(diào)控及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定維持;Alexander等（2014）在杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥的動物模型中發(fā)現(xiàn)，當提高肌組織中的miR-486表達水平，可有效降低DOCK3和PTEN基因表達量，提高Akt磷酸化水平，最終促使肌肉營養(yǎng)不良的癥狀得到緩解;Yue等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在成年人骨骼肌衛(wèi)星細胞中若敲除PTEN基因，骨骼肌衛(wèi)星細胞將不經(jīng)過增殖而直接轉(zhuǎn)入成熟分化狀態(tài)，導(dǎo)致骨骼肌衛(wèi)星細胞數(shù)量消耗，這種情況若發(fā)生在體內(nèi)則會影響骨骼肌損傷的修復(fù)和再生;石田培等（2020）對綿羊胚胎不同發(fā)育階段骨骼肌中circRNA的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，大量差異表達基因富集于PI3K-Akt信號通路上?？梢?，在綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達而參與細胞的生長發(fā)育，骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-486也可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路中的其他基因而發(fā)揮作用，但具體作用機制有待進一步探究。

4 結(jié)論

miR-486通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達而參與綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞生長發(fā)育及增殖，為深入研究miR-486對綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機理及優(yōu)質(zhì)肉羊品種培育打下了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-07-15

基金項目：新疆自然科學(xué)基金項目（2017D01A51）

通訊作者：張偉（1978-），https：//orcid.org/0000-0003-1007-1681，博士，副教授，主要從事畜禽功能基因研究工作，E-mail：zhangweigsau@163.com

第一作者：王世銀（1979-），https：//orcid.org/0000-0003-3460-7671，副教授，主要從事動物遺傳育種研究工作，E-mail：wangshiyin xjnzy@163.com