氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種常見淡水綠藻生長的影響

趙旭民，吳陳炎，曾 霖，張延軍，陳東良，毛 帥，李繼姬

(1.國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江華太生物科技有限公司，浙江義烏 322005；3.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022)

微藻——光能自養(yǎng)型單細胞藻類，廣泛分布于淡水、海水生態(tài)系統(tǒng)，種類繁多。微藻細胞太陽能利用率高、生長繁殖迅速、且營養(yǎng)豐富：富含蛋白質、脂質、糖類、維生素（A、B1、B2、B6、C 及E）、類胡蘿卜素（蝦青素及β-胡蘿卜素）、不飽和脂肪酸（EPA 及DHA）、藻多糖、礦質元素及抗氧化物質等多種營養(yǎng)成分[1]，可滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖動物在幼苗期的正常生長發(fā)育營養(yǎng)需求。利用微藻餌料加強種苗營養(yǎng)的做法已經(jīng)應用于對蝦、海參、海膽、雙殼貝類、甲殼類等動物育苗工作中[2-4]，微藻餌料在提高育苗存活率、保證幼苗正常變態(tài)和發(fā)育、提高生長速度、提高免疫力等方面具備一定的作用[5]。另外，微藻可以高效地利用光合作用降低養(yǎng)殖水體中常見的氨、氮等有害無機物并產(chǎn)生氧氣，凈化水質保證溶解氧的供應[6]。因此，微藻已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要基礎保障，養(yǎng)殖水體中養(yǎng)殖動物與微藻的合理搭配成為高效、健康養(yǎng)殖的必備舉措，實踐意義顯著。

小球藻Chlorella sp.為普生性單細胞綠藻，隸屬于綠藻門Chlorophyta，綠藻綱Chlorophyceae，卵囊藻科Oocystaceae，小球藻屬Chlorella，具備適應能力強、分布廣、生長速度快、營養(yǎng)豐富等特點[7]。斜生柵藻Scenedesmus obliquas，隸屬于綠藻門Chlorophyta，綠球藻目Chlorococcales，柵藻科Scenedesmaceae，柵藻屬Scenedesmus，具備易存活、繁殖能力強、環(huán)境耐受性強、氮磷利用率高、油脂及蝦青素含量高等特點[8-9]。卵囊藻Oocystis sp.，屬于綠藻門Chlorophyta，綠藻綱Chlorophyceae，綠球藻目Chlorococcales，卵囊藻科Oocystaceae，卵囊藻屬Oocystis，廣泛分布于小型湖泊和池塘等常見淡水水體中[10]。此3 種綠藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中均具有較高的應用價值：研究表明小球藻能夠明顯提高南美白對蝦的存活率、促進生長[11]；斜生柵藻細胞中富含的蝦青素作為魚類維生素A 的前體具備增強魚類和蝦、蟹類的免疫功能、促進生長和提高存活率的特點[12-14]；卵囊藻因細胞吸附有害物質的能力而具備調控改善養(yǎng)殖水環(huán)境及增強對蝦抗病力的特點[15]；因此水產(chǎn)養(yǎng)殖對上述綠藻的需求和依賴性是很高的。

針對3 種綠藻細胞的生長和繁殖已有諸多報道，研究發(fā)現(xiàn)不同添加物和培養(yǎng)基對于不同綠藻發(fā)揮了積極作用：維生素B1 對小球藻的增殖有極顯著的促進作用[16]，蛋白胨和牛肉膏對小球藻的生長促進作用大[17]，BG11-N 培養(yǎng)基有利于小球藻的快速生長，SE 培養(yǎng)基更有利于小球藻對油脂的積累[18]；BG11 培養(yǎng)基有利于斜生柵藻的生長，F(xiàn)/2 培養(yǎng)基更適合斜生柵藻油脂以及中性脂的積累[19]；魚汁、海泥抽出液和尿液均能促進卵囊藻的生長[20]。目前針對單一藻種所需的無機鹽[21]、微量元素[22]、維生素[23]、有機營養(yǎng)物質等開發(fā)針對性的單一最適培養(yǎng)基成為研究的側重點，但是投入成本偏高，作為淡水養(yǎng)殖水體的微藻也并非單一物種，而是多物種搭配，因此多物種普適性的水體添加物可能成為更經(jīng)濟、更高效的舉措。

本研究以F/2 和BG11 培養(yǎng)基為3 種綠藻的基礎培養(yǎng)基，以市售華太氨基酸蛋白營養(yǎng)液為培養(yǎng)添加物，在不同的溫度下設置不同濃度的雙向梯度實驗，評價該添加物對3 種綠藻的擴繁的效果，以期找到一種普適性的養(yǎng)殖水體添加物，為養(yǎng)殖體系中綠藻擴繁環(huán)節(jié)提供一個高效、經(jīng)濟的選項。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與及實驗儀器

小球藻 (Chlorella sp.，GY-D19)、斜生柵藻(S.obliquus，GY-D13)及卵囊藻(Oocystis sp.，GY-D5)藻種購自上海光語生物科技有限公司。配制基礎培養(yǎng)基的所有無機鹽及氨基酸試劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司。氨基酸蛋白營養(yǎng)液采用大米加工而成，其生產(chǎn)工藝如圖1 所示。對氨基酸蛋白營養(yǎng)液組成進行測定（國家標準GB/T 18246-2000），其主要成分見表1。

圖1 氨基酸蛋白液生產(chǎn)工藝圖Fig.1 Production process diagram of amino acid protein nutrient

表1 氨基酸蛋白液主要成分含量Tab.1 Content of main components in amino acid protein nutrient

實驗所用儀器有：生物顯微鏡(CX23LEDRFS1C 型，奧林巴斯)，血球計數(shù)板(AP-0650030 型，MARIENFELD)，紫外可見光分光光度計(UV-2550 型，島津)，人工氣候箱(RXZ-500D 型，寧波江南儀器廠)，純水儀(MilliporeElix)。

1.2 綠藻培養(yǎng)方法及雙梯度實驗設計

基礎培養(yǎng)基配制與氨基酸蛋白營養(yǎng)液脫水處理：F/2、BG11 基礎培養(yǎng)基配方參照王麗娟等[19]實驗標準。使用純水機處理后的超純水添加各組分無機鹽后經(jīng)121 ℃、20 min 高壓滅菌，隨后加入經(jīng)0.22 μm 孔徑濾膜過濾除菌的氨基酸組分制成基礎培養(yǎng)基備用。因營養(yǎng)液為膏液狀，含水量會因生產(chǎn)批次的不同有起伏，為了實驗的嚴謹性采取干重濃度設計（膏液狀營養(yǎng)液經(jīng)烘干測得干濕比為0.773 2）。

3 種綠藻均在人工氣候箱中培養(yǎng)，各參數(shù)設置為：光照強度4 000 Lux、濕度75%、光照周期16 L/8 D，培養(yǎng)過程中每天搖瓶4 次。取生長至對數(shù)期的藻種在無菌環(huán)境下接種于容量體積為100 mL 的透明錐形瓶中，培養(yǎng)體積為50 mL，用過濾孔徑為0.2～0.3 μm 的透氣封口膜封口以防止雜菌污染。綠藻初始接種濃度分別為小球藻0.33×105cells·mL-1、斜生柵藻0.16×105cells·mL-1和卵囊藻0.04×105cells·mL-1。

雙梯度實驗設置是6 個實驗溫度(16、19、22、25、28 及31 ℃)和4 個氨基酸蛋白營養(yǎng)液(添加物)濃度(0、10、100 及1 000 mg·L-1)，其中0 mg·L-1為空白對照，其他均為干重濃度。不同溫度分批進行，同一溫度下的4 組濃度實驗同時進行，設置4 組平行組，連續(xù)培養(yǎng)并觀測11～12 d，每24 h 測定藻液濃度。

1.3 藻濃度測定

本實驗采用紫外可見光分光光度計和血球計數(shù)板測量藻濃度。首先，取生長至較高濃度的3 種藻液進行全波長掃描確定每種藻的光譜特征峰波長：小球藻686 nm、斜生柵藻682 nm、卵囊藻687 nm。然后取培養(yǎng)好的3 種微藻懸浮液用基礎培養(yǎng)基按比例稀釋成各種濃度，用血球計數(shù)板法計算藻濃度（單位105cells·mL-1），重復6 次，取平均值。將相應藻濃度用分光光度計在每種藻的特征峰波長下測定吸光度，以基礎培養(yǎng)基為參比，求得每種藻細胞濃度(x)與藻液吸光度(y)之間的線性關系。

3 種微藻標準曲線方程為：

3 組標準曲線方程的r2均大于0.99，表明藻濃度與OD 值之間有較好的線性關系，可以用分光光度計法測定藻濃度，測得OD 值代入標準方程換算為藻濃度。

2 數(shù)據(jù)分析

所有藻液細胞濃度數(shù)據(jù)采用平均值±標準偏差(SD)的模式呈現(xiàn)，采用SPSS 軟件的單因素方差分析法(ANOVA)進行實驗組與對照組的顯著性差異分析(P＜0.05)。使用比生長率(SGR)來表示特定時間段內藻細胞群體的單位時間增長率，公式如下：

式中：A、B 為培養(yǎng)天數(shù)，d；CA、CB為第A 天和第B 天的藻濃度，105Cells·mL-1；(TB-TA)為第A 天到第B 天的培養(yǎng)時間長度，d。

3 結果與討論

3.1 不同溫度下營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響

以3 ℃為間隔的梯度設計橫跨16～31 ℃共6 個溫度，覆蓋了水產(chǎn)養(yǎng)殖實際生產(chǎn)過程中季節(jié)交換導致的多級溫度變化。圖2～7 的(a)分圖分別顯示的是6 個溫度下經(jīng)過11～12 d 培養(yǎng)后的3 種綠藻的細胞濃度，營養(yǎng)液對綠藻生長的影響因不同溫度和不同物種而存在較大的差異。

溫度梯度實驗的最低溫是16 ℃，小球藻的對照組和實驗組均停止生長，斜生柵藻和卵囊藻均適應低溫并對營養(yǎng)液的添加作出積極響應，相比對照組細胞濃度在一定程度上顯著增加，見圖2(a)。隨著實驗溫度的上升，小球藻對照組均停止生長，而營養(yǎng)液的添加提升了小球藻的低溫耐受性并顯著提升了細胞濃度，見圖3(a)。在高溫31 ℃時，小球藻對照組同樣受到高溫脅迫停止生長，而營養(yǎng)液的添加同樣提升了小球藻的抗高溫性能并顯著提升了細胞濃度，見圖7(a)。由此可見，氨基酸蛋白營養(yǎng)液的添加使得小球藻提升了溫度耐受性，適宜溫度跨度得到擴展。然而，31 ℃(圖7(a))、28 ℃(圖6(a))及22 ℃(圖4(a))實驗組的卵囊藻受到添加的營養(yǎng)液的脅迫作用，細胞濃度顯著低于對照組，而其他溫度下呈促進生長的作用，暫未發(fā)現(xiàn)卵囊藻這種無規(guī)律變化的原因。對于斜生柵藻，所有溫度下的實驗組均呈現(xiàn)較好的生長態(tài)勢，相較于對照組促進作用顯著。

圖2 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(16 ℃).(a)：經(jīng)過12 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖；(b)、(c)及(d)：12 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.2 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (16 ℃)(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 12 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

圖3 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(19 ℃).(a)：經(jīng)過12 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖；(b)、(c)及(d)：12 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.3 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (19 ℃).(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 12 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

圖4 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(22 ℃).(a)：經(jīng)過12 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖；(b)、(c)及(d)：12 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.4 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (22 ℃).(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 12 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

圖5 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(25 ℃).(a)：經(jīng)過12 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖；(b)、(c)及(d)：12 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.5 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (25 ℃).(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 12 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

圖6 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(28 ℃).(a)：經(jīng)過11 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖；(b)、(c)及(d)：11 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.6 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (28 ℃).(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 11 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

圖7 添加氨基酸蛋白營養(yǎng)液對3 種綠藻生長的影響(31 ℃).(a)：經(jīng)過12 d 培養(yǎng)期的3 種綠藻細胞濃度柱狀圖;(b)、(c)及(d)：12 d 培養(yǎng)期內小球藻、斜生柵藻及卵囊藻的生長曲線圖Fig.7 Effects of adding amino acid protein nutrient on the growth of three green microalgae (31 ℃).(a)：Histogram of cell concentrations of three green microalgae after 12 d;(b),(c) and (d)：Growth curves of Chlorella sp., S.obliquus and Oocystis sp.,during 12 d culture period

相對于營養(yǎng)物質如葡萄糖或尿素，溫度對小球藻細胞生長的影響更大，最適宜的溫度在25～30 ℃之間[24]，本研究中的小球藻適宜溫度寬度相對得到擴展(19～31 ℃)，是氨基酸蛋白營養(yǎng)液的功效。

3.2 不同營養(yǎng)液濃度對3 種綠藻生長的影響

營養(yǎng)液的濃度是決定細胞群體生長的關鍵，不同營養(yǎng)液濃度的設計的目的是期望為實際生產(chǎn)過程提供使用劑量參考。圖2～7 的(b、c、d)分圖分別顯示的是3 種綠藻在4 種濃度(0、10、100 及1 000 mg·L-1)培養(yǎng)液施用后的生長曲線，不同濃度營養(yǎng)液產(chǎn)生的細胞群體生長促進程度不同。

對于小球藻，除低溫16 ℃實驗組之外，其他溫度實驗組的3 個濃度梯度與促進效果均呈現(xiàn)正相關性，濃度越高，促進細胞群體生長的程度越高。與之類似的是斜生柵藻，16 ℃實驗組的最高濃度(1 000 mg·L-1)的促進作用明顯小于中濃度(100 mg·L-1)，其他溫度的促進效果均與濃度呈現(xiàn)正相關性。而卵囊藻實驗組細胞增殖的效果與營養(yǎng)液濃度沒有呈現(xiàn)明顯的相關性。

營養(yǎng)添加物或者必需微量元素對于微藻細胞具有促進生長和增殖的作用，但濃度升高之后便使藻細胞受到脅迫造成負面影響：高濃度種畜禽糞便浸出液對小球藻生長產(chǎn)生脅迫[25]，超過0.015 mmol·L-1的磷添加使得小球藻的生長速度降低[26]，質量濃度大于0.284 9 μg·L-1的微量元素Co2+對斜生柵藻產(chǎn)生不同程度的抑制效應[27]。本研究中出現(xiàn)的抑制效應部分出現(xiàn)在高濃度，相關機制可能與上述現(xiàn)象一致，為高濃度脅迫。有研究表明：隨著培養(yǎng)液鹽度的上升，卵囊藻的生物量顯著下降，推測原因可能是卵囊藻生長所需滲透壓較低[28]，這與本研究中高濃度氨基酸營養(yǎng)液反而抑制生長的現(xiàn)象吻合。

3.3 單位時間增長率的變化與分析

經(jīng)過11～12 d 培養(yǎng)之后的細胞濃度反映的是最終的增殖結果，每天的細胞群體生長情況與單位時間增長率可以反饋不同時間段的生長情況，可以給生產(chǎn)實踐提供第一手的信息。表2 表示3 種綠藻在不同溫度和不同濃度氨基酸蛋白營養(yǎng)液的培養(yǎng)下的比生長率，清晰展示了每天的細胞群體增殖情況，同時也直觀地反映在生長曲線圖上(圖2～7(b、c、d))。

生長曲線的交叉反映了比生長率的變化，19 ℃高濃度營養(yǎng)液在第5 天的時候顯著增強了斜生柵藻的細胞生長(圖3(c))，SGR(4-5)=1.84±0.37 和SGR(5-6)=1.08±0.13 相較于SGR(3-4)=0.06±0.33 明顯增加，并高于同期中、低濃度及對照組，相似的增殖轉折情況在斜生柵藻22～31 ℃實驗組均有所體現(xiàn)。高濃度(1 000 mg·L-1)的營養(yǎng)液添加并未在培養(yǎng)前期1～3 d 內發(fā)生較大的生長率變化，反而有一定的抑制作用，進入4～5 d 之后開始發(fā)生明顯的上升轉折直至11～12 d 的培養(yǎng)期結束，相同的情況也發(fā)生在小球藻的培養(yǎng)體系內。這一段0～4 d 的培養(yǎng)期可以稱為高濃度營養(yǎng)液調整適應期，因此高濃度營養(yǎng)液的添加效果在4 d 之后呈現(xiàn)可以指導生產(chǎn)實踐過程中施肥操作。低溫情況下，最適宜斜生柵藻的營養(yǎng)液濃度是中濃度(100 mg·L-1)，然而中濃度并未出現(xiàn)調整適應期，這是一個值得注意的地方。而卵囊藻的生長曲線多重交叉現(xiàn)象，生長曲線未能呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，可能需要更進一步的實驗去解析卵囊藻與營養(yǎng)液之間的相關性。

4 結論

本研究雙梯度實驗結果表明：華太氨基酸蛋白營養(yǎng)液的添加對小球藻和斜生柵藻的細胞增殖具有顯著的提升作用，除16 ℃低溫特殊情況之外高濃度(1 000 mg·L-1)的增殖效果最好；對小球藻表現(xiàn)出顯著的適宜溫度跨度擴展，增加了小球藻在高、低溫時期淡水水體擴繁的可能性；部分濃度的營養(yǎng)液在特定溫度下對卵囊藻表現(xiàn)出一定程度的抑制效應，需要進一步的實驗探究造成抑制效應的機理。期望本研究的結果可以為華太氨基酸蛋白營養(yǎng)液在淡水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應用提供藻種篩選、培育溫度及培養(yǎng)濃度等方面的參考。