斜生四鏈藻對(duì)水中四環(huán)素的脅迫響應(yīng)及去除作用

楊 俊，陳正杰，王海烽, 謝正鑫, 2，唐 俊, 2*

斜生四鏈藻對(duì)水中四環(huán)素的脅迫響應(yīng)及去除作用

楊 俊1，陳正杰1，王海烽1, 謝正鑫1, 2，唐 俊1, 2*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部合肥農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測(cè)試驗(yàn)站，合肥 230036)

四環(huán)素由于其低生物降解性和水溶性而在水環(huán)境中持續(xù)存在，對(duì)生態(tài)環(huán)境安全造成較高的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為探討水環(huán)境中殘留的四環(huán)素與藻類的相互作用，以斜生四鏈藻為研究對(duì)象，考察了斜生四鏈藻對(duì)水中不同濃度四環(huán)素（0.5、1.0、1.5、2.5、4.0和6.0 mg·L-1）的脅迫響應(yīng)及去除作用。結(jié)果表明，各濃度四環(huán)素處理組均對(duì)斜生四鏈藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，最高抑制率達(dá)到了72.99%，四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度（96 h - EC50）和抑制效應(yīng)為80%質(zhì)量濃度（96 h - EC80）分別為2.46和6.9 mg·L-1。在相同濃度四環(huán)素脅迫下，斜生四鏈藻的光合色素含量和v/m值呈現(xiàn)出和斜生四鏈藻細(xì)胞密度變化相同的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，6.0 mg·L-1濃度處理組中斜生四鏈藻的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量在96 h的抑制率分別是87.32%、66.91%和87.58%，v/m值降幅達(dá)到了77.4%。在低、中、高濃度四環(huán)素（0.5、1.5和6.0 mg·L-1）脅迫下暴露96 h，斜生四鏈藻的丙二醛（MDA）含量整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)；超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量均受到不同程度的誘導(dǎo)作用，6.0 mg·L-1濃度處理組暴露96 h時(shí)，SOD活性為對(duì)照組的1.25倍，GSH含量為對(duì)照組的1.53倍。在斜生四鏈藻初始OD690值為0.15，四環(huán)素濃度為4.0 mg·L-1的條件下，48 h內(nèi)斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除率為90%，對(duì)照組的去除率為19%。研究結(jié)果為四環(huán)素對(duì)水體初級(jí)生產(chǎn)者的生態(tài)毒性提供了新資料，同時(shí)也為水體中殘留四環(huán)素的生態(tài)修復(fù)提供了新的方向。

四環(huán)素；斜生四鏈藻；急性毒性；去除作用

四環(huán)素是最常用的典型抗生素之一，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物感染治療和動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1]。然而，抗生素在生物體內(nèi)通常難以代謝，相當(dāng)一部分四環(huán)素（30%～90%）通過動(dòng)物糞便和廢水釋放到周圍環(huán)境中[2]。由于動(dòng)物糞便在農(nóng)田中的應(yīng)用導(dǎo)致抗生素廣泛存在于多種環(huán)境介質(zhì)中，包括鄰近的地表水、沉積物、土壤和地下水[3]。受污染淡水中抗生素的濃度范圍為ng·L-1至μg·L-1[4]。在某些情況下，在生產(chǎn)設(shè)施的局部污染源中，它們的濃度可高達(dá)50 mg·L-1[5]。四環(huán)素由于其低生物降解性和水溶性而在環(huán)境中持續(xù)存在，而殘留部分由于可以刺激細(xì)菌種群中抗生素抗性基因的發(fā)展而受到廣泛關(guān)注[6]。大量研究已證實(shí)四環(huán)素對(duì)多種生物具有潛在毒性，包括浮萍[7]、藻類[8]和細(xì)菌[9]。

微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵主要組成部分，具有高生物質(zhì)生產(chǎn)力、全球分布廣泛、高增長(zhǎng)率等特點(diǎn)，可作為模式生物來評(píng)價(jià)四環(huán)素在水環(huán)境中的潛在毒性[10]。迄今為止，已有研究評(píng)估了四環(huán)素對(duì)多種藻類的影響。徐冬梅等[11]研究報(bào)道了高濃度的四環(huán)素顯著增強(qiáng)了膜通透性并改變了藻類細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。姜蕾等[12]研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素暴露能夠阻礙銅綠微囊藻的光合作用，破壞抗氧化酶的系統(tǒng)平衡，抑制藻類生物量的增長(zhǎng)。董聰聰?shù)萚13]研究認(rèn)為微囊藻在四環(huán)素濃度較低時(shí)，可以通過自身調(diào)節(jié)改變PSⅡ中能量配置，提高光合效率來應(yīng)對(duì)四環(huán)素脅迫。還有研究報(bào)道四環(huán)素可脅迫萊茵衣藻和羊角月牙藻產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[14-15]。

此外，有研究表明利用微藻可以有效去除廢水中的抗生素等新興污染物[16]。例如，一個(gè)高效的藻池塘（HRAP）系統(tǒng)在長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的過程中，從城市廢水中去除了64種藥品及個(gè)人護(hù)理品（PPCPs），包括33種抗生素（平均濃度為223 μg·L-1），抗生素去除效率比傳統(tǒng)活性污泥法高5%～50%[17]。先前的研究還表明，微藻對(duì)污染物的去除效率主要取決于初始藻細(xì)胞密度[14]。

斜生四鏈藻作為一種常見的淡水微藻，由于其具有快速繁殖的能力以及對(duì)污染物的敏感性，已被廣泛用作水安全評(píng)價(jià)和環(huán)境毒理學(xué)檢測(cè)的模型生物[18]。雖然目前已有研究報(bào)道了四環(huán)素對(duì)其他藻類的毒性效應(yīng)，但四環(huán)素的毒性機(jī)制還取決于微藻的種類。因此，本研究在分析了四環(huán)素對(duì)水環(huán)境中斜生四鏈藻生長(zhǎng)特性（生物量、光合色素含量、葉綠素?zé)晒狻⒈∕DA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量）影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了斜生四鏈藻去除水中四環(huán)素的能力，以期為水環(huán)境中四環(huán)素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及污染治理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源 斜生四鏈藻（，F(xiàn)ACHB-1810），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，在無菌條件下，采用BG-11培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，光暗比為14 h∶10 h，光照強(qiáng)度為5 000 lx，每天定時(shí)搖晃培養(yǎng)瓶數(shù)次。

1.1.2 主要儀器及試劑 儀器：超高效液相色譜儀（Waters UPLC，美國(guó)沃特世科技有限公司），智能人工氣候箱（RGDF-1000C，合肥右科儀器設(shè)備有限公司），潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），紫外分光光度計(jì)（UV-1900i，日本島津儀器公司）。

試劑：鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（純度>97.70%），購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司，BG11培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自合肥拜爾迪化學(xué)科技有限公司，其余試劑為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗(yàn) 為排除助溶劑對(duì)斜生四鏈藻和蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響，采用超純水溶解四環(huán)素。稱取0.027 7 g 四環(huán)素，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并使用超純水進(jìn)行定容，配制成500 mg·L-1的四環(huán)素母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)OECD第 201號(hào)指南（OECD 201），四環(huán)素暴露濃度梯度設(shè)置根據(jù)不同濃度四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻生長(zhǎng)影響的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化調(diào)整，四環(huán)素處理斜生四鏈藻的質(zhì)量濃度最終確定為0.5、1.0、1.5、2.5、4.0和6.0 mg·L-1，并設(shè)置只添加初始濃度為5×105cells·mL-1的空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.2 去除試驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生四鏈藻轉(zhuǎn)接入含有4.0 mg·L-1四環(huán)素的BG11培養(yǎng)基中，通過控制轉(zhuǎn)接后的三角錐形瓶中初始的OD690為 0.15來初步確定斜生四鏈藻初始添加量基本一致，并設(shè)置只添加4.0 mg·L-1四環(huán)素的BG11培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)起始點(diǎn)記為第0小時(shí)，然后分別在第6、12、24、36和第48小時(shí)取樣，通過超高效液相色譜儀對(duì)培養(yǎng)基中四環(huán)素剩余濃度進(jìn)行測(cè)定，利用分光光度計(jì)記錄藻液的吸光度值變化。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 斜生四鏈藻的藻細(xì)胞密度測(cè)定 采用光密度法[19]。取不同密度的藻液分別測(cè)定690 nm波長(zhǎng)下藻液的吸光度值，然后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)相應(yīng)的藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。以吸光度值為橫坐標(biāo)、藻細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

藻細(xì)胞密度（106個(gè)·mL-1）= 14.105690﹣0.067 7（1）

考慮到不同濃度的四環(huán)素在BG11培養(yǎng)基中的濁度對(duì)吸光度值測(cè)定的影響，故在計(jì)算中分別去除含有不同濃度四環(huán)素的培養(yǎng)基的吸光度值。其中，藻細(xì)胞密度增長(zhǎng)抑制率可通過下式計(jì)算：

= (1-C/C)× 100% （2）

式中：C為處理組藻細(xì)胞密度；C為對(duì)照組藻細(xì)胞密度。

1.3.2 光合色素測(cè)定 收集暴露48 h和96 h后的藻細(xì)胞，采用熱乙醇法提取[20]，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的計(jì)算公式如下：

葉綠素a/(mg·L-1)= 16.82665+9.28652

葉綠b/(mg·L-1)= 36.92652+16.54665

類胡蘿卜素/(mg·L-1)=(1 000470–1.91C–

95.15C)/225 （3）

式中：C為葉綠素a的濃度（mg·L-1）； C為葉綠素b的濃度（mg·L-1）。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 收集暴露48 h和96 h后的藻細(xì)胞，將樣品避光暗處理30 min以后檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)。葉綠素?zé)晒鈪?shù)使用Imaging-PAMM系列葉綠素?zé)晒庀到y(tǒng)測(cè)量。光合量子產(chǎn)率值通過下式計(jì)算得到[21]：

=V/m=(m﹣0)/m（4）

式中：m為在暗適應(yīng)狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖后產(chǎn)生的最大熒光值；v為在暗適應(yīng)狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖前產(chǎn)生的熒光值。0為暗適應(yīng)后的最小熒光值。

1.3.4 抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的測(cè)定 收集暴露48 h和96 h后的藻細(xì)胞，在冰水浴條件下，采用超聲波細(xì)胞粉碎儀超聲3 s，間隔3 s，破碎20 min（150 W），10 000 r·min-1低溫離心10 min，取上清液即為粗酶液，分別采用試劑盒（南京建成生物科技有限公司）測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量，以蛋白質(zhì)含量為基準(zhǔn)對(duì)MDA、SOD和GSH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3.5 超高效液相色譜檢測(cè)條件 四環(huán)素的濃度采用超高效液相色譜（UPLC）（Waters, USA）法測(cè)定，配有PDA檢測(cè)器和ACQUITY UPLC BEH C18反相柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。其中，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈（色譜級(jí)），流速為 0.15 mL·min-1。四環(huán)素檢測(cè)波長(zhǎng)λ設(shè)置為358 nm，進(jìn)樣量和柱溫分別設(shè)置為10 μL和40 ℃，超高效液相色譜的梯度洗脫程序如表1所示。

表1 超高效液相色譜儀洗脫梯度

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（= 3），使用Origin 2021作圖，利用SPSS 19.0 Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析，不同小寫字母表示差異顯著，< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻生長(zhǎng)的影響

藻細(xì)胞密度是一種外源化合物對(duì)藻細(xì)胞代謝產(chǎn)生抑制作用的綜合參數(shù)，通常被用來評(píng)估外源化合物對(duì)藻類的毒性[22]。由圖1(a)可知，在暴露96 h以后，0.5 mg·L-1四環(huán)素處理組中，斜生四鏈藻細(xì)胞密度與對(duì)照組相比減少了2%。6.0 mg·L-1四環(huán)素處理組中，斜生四鏈藻細(xì)胞密度與對(duì)照組相比減少了73%。由圖1(b)可知，0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素均對(duì)斜生四鏈藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，抑制率隨著四環(huán)素濃度的增大而逐漸增加，處理第48 小時(shí)，斜生四鏈藻的生長(zhǎng)隨四環(huán)素濃度的增加分別被抑制26.32%、37.87%、43.65%、50.06%、57.45%和59.05%；處理第96 小時(shí)，抑制率分別為1.62%、23.21%、49.06%、54.29%、59.28 %和72.99 %。經(jīng)SPSS軟件擬合可知，四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度（96 h-EC50）和抑制效應(yīng)為80%質(zhì)量濃度（96 h-EC80）分別為2.46和6.9 mg·L-1。

生長(zhǎng)抑制率通常用作確定污染物對(duì)藻類的毒性的替代指標(biāo)[23-24]。在暴露48 h以后，研究發(fā)現(xiàn)低濃度0.5～1.0 mg·L-1四環(huán)素處理對(duì)斜生四鏈藻的抑制率開始降低，這可能是因?yàn)樵陂L(zhǎng)期暴露后，微藻對(duì)低濃度四環(huán)素具有更強(qiáng)的抗性和耐受機(jī)制。其次，可能是由于斜生四鏈藻對(duì)低濃度四環(huán)素的去除作用。這兩個(gè)因素共同導(dǎo)致低濃度四環(huán)素對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所降低。隨著四環(huán)素添加濃度的增大，斜生四鏈藻的生長(zhǎng)抑制率逐漸增大，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。徐冬梅等[11]在四環(huán)素類抗生素對(duì)淡水綠藻的毒性作用研究中也報(bào)道了四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻的96 h-EC50和96 h-EC80值分別為3.27和12.87 mg·L-1，均高于本研究中的96 h-EC50和96 h-EC80值，這些差異可能是由于培養(yǎng)條件及測(cè)定指標(biāo)方法的不同而導(dǎo)致的。

圖1 不同濃度四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻細(xì)胞密度（a）和抑制率（b）的影響

Figure 1 Effects of different concentrations of tetracycline on the cell density (a) and inhibition rate (b) of

圖2 不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h（a）和96 h（b）光合色素含量

Figure 2 Photosynthetic pigment contents inunder different concentrations of tetracycline at 48 h (a) and 96 h (b)

2.2 四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻光合色素的影響

葉綠素作為一種光合色素，對(duì)于光捕獲、能量轉(zhuǎn)移和光轉(zhuǎn)化為化學(xué)能至關(guān)重要，而類胡蘿卜素則可防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)生成，在有毒化合物的作用下，藻類的生長(zhǎng)抑制往往與葉綠素生物合成的變化有關(guān)[20]。如圖2所示，在0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素暴露48 h和96 h后，與對(duì)照組相比，斜生四鏈藻的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量顯著降低（< 0.05）。Li等[14]也報(bào)道了類似的結(jié)果，即隨著四環(huán)素添加濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量顯著下降。由圖2可知，與對(duì)照組相比，6.0 mg·L-1四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的抑制作用達(dá)到最大，48 h時(shí)，分別是63.12%、55.19%和60.96%；96 h時(shí)，分別是87.32%、66.91%和87.58%。光合色素含量的減少可能是由于葉綠體超微結(jié)構(gòu)和膜脂過氧化的變化所致[25-26]。據(jù)研究報(bào)道，有毒污染物可以抑制藻細(xì)胞中用于合成膽色素原的氨基乙酰丙酸脫水酶和用于合成葉綠素的原葉綠素還原酶的活性，其在葉綠素合成中起重要作用[27]。在0.5～4.0 mg·L-1四環(huán)素脅迫下，48 h斜生四鏈藻光合色素含量較96 h有所上升，這可能是由于藻類細(xì)胞具有去除葉綠體中積累的活性氧（ROS）的自我保護(hù)機(jī)制[28]。

2.3 四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

vm值代表光合活性生物體的葉綠素?zé)晒獍l(fā)射參數(shù)，它主要來源于PSⅡ的葉綠素a分子，通常被用作反映環(huán)境脅迫的指標(biāo)[22]。0.5～6.0 mg·L-1四環(huán)素暴露培養(yǎng)48和96 h時(shí)，斜生四鏈藻的vm值（圖3）顯示，處理組與對(duì)照組有顯著性差異（< 0.05）。6.0 mg·L-1四環(huán)素處理組，48 h時(shí)斜生四鏈藻的vm值為0.079，相比對(duì)照組0.604，降幅達(dá)到了86.87%；96 h時(shí)vm值為0.149，相比對(duì)照組0.661，降幅達(dá)到了77.4%。

圖3 不同濃度四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻Fv/Fm參數(shù)的影響

Figure 3 Effects of different concentrations of tetracycline onv/mparameters of

圖4 不同濃度四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻MDA含量（a）、SOD活性（b）和GSH含量（c）的影響

Figure 4 Effects of different concentrations of tetracycline on MDA content (a), SOD activity (b) and GSH content (c) of

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化能反映植物光合作用生理過程受到脅迫作出的反應(yīng)，量化了光合作用的過程，使研究植物光合作用特征對(duì)毒性脅迫的表征得到深入[29]。已有研究表明，莫西沙星、加替沙星等抗生素脅迫會(huì)引起微囊藻細(xì)胞光化學(xué)量子產(chǎn)量降低[30]。本研究發(fā)現(xiàn)0.5～10.0 mg·L-1四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h和96 h時(shí)，其vm值均隨著四環(huán)素脅迫濃度的增大而顯著降低（< 0.05），表明四環(huán)素引起斜生四鏈藻細(xì)胞光合活性的損傷，損傷程度與四環(huán)素濃度呈正相關(guān)關(guān)系，這與四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻生長(zhǎng)的影響結(jié)果一致。vm的下降是由于PSII反應(yīng)中心失活所致，說明四環(huán)素可以作用于斜生四鏈藻細(xì)胞的PSII反應(yīng)中心，并通過抑制其光合作用從而對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生脅迫作用。96 h時(shí)不同濃度四環(huán)素處理組斜生四鏈藻的v/m值較48 h時(shí)均顯著上升（< 0.05），說明四環(huán)素造成的斜生四鏈藻細(xì)胞最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的可逆性損傷，在培養(yǎng)后期有恢復(fù)趨勢(shì)。Yang等[8]的研究也觀察到了類似的現(xiàn)象，銅綠微囊藻在暴露于低濃度四環(huán)素一段時(shí)間后，其vm值可以恢復(fù)，表明銅綠微囊藻細(xì)胞的PSII反應(yīng)中心對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性

2.4 四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻抗氧化系統(tǒng)的影響

活性氧具有很強(qiáng)的氧化性能，可以通過氧化多不飽和脂肪酸（PUFA）對(duì)細(xì)胞器造成致命的破壞。 PUFA過氧化作用會(huì)降低膜的流動(dòng)性，增加滲漏并引起膜蛋白的二次損傷[31]。丙二醛（MDA）是醛類化合物，是PUFA的代表性產(chǎn)物。由圖4（a）可見，不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h時(shí)，斜生四鏈藻MDA含量顯著高于對(duì)照組（0.05），在6.5～8.0 nmol·mg-1范圍內(nèi)波動(dòng)。四環(huán)素持續(xù)脅迫斜生四鏈藻96 h時(shí)，其MDA含量較48 h均有所增加，分別為48 h的1.88、1.48、1.16和1.36倍。藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高表明在四環(huán)素脅迫下藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的形成具有時(shí)間依賴性。Liu等[32]也報(bào)道了類似的結(jié)果，即在阿莫西林和螺旋霉素暴露的前24 h內(nèi)未觀察到銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加 ，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。當(dāng)暴露于土霉素時(shí)，也觀察到斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高[33]。MDA含量的增加表明四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻細(xì)胞造成了結(jié)構(gòu)和功能損傷。隨著四環(huán)素濃度的增加，可以觀察到藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，同時(shí)在藻細(xì)胞內(nèi)的SOD活性和GSH含量較對(duì)照組均顯著上升（< 0.05），說明斜生四鏈藻具有提高抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量來降低藻細(xì)胞膜脂過氧化的能力。但在姜蕾等[12]的研究中，四環(huán)素暴露下銅綠微囊藻的SOD活性和POD活性均呈下降趨勢(shì)，說明銅綠微囊藻不能有效清除藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧。這可能是因?yàn)椴煌⒃宓难趸瘧?yīng)激機(jī)制對(duì)四環(huán)素的響應(yīng)方式之間存在著差異。

光合生物通過增加其抗氧化防御機(jī)制來抵消由細(xì)胞中積累的活性氧（ROS）誘導(dǎo)的抗生素的毒性。例如，超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，提供了對(duì)抗活性氧毒性和清除自由基的第一道防線。它能將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2從而阻止超氧陰離子自由基的產(chǎn)生[34]。由圖4（b）可知，0.5 mg·L-1四環(huán)素脅迫下，48 h時(shí)斜生四鏈藻的SOD活性與對(duì)照組相比，無顯著性差異（> 0.05）；1.5和6.0 mg·L-1處理組與對(duì)照組相比，有顯著性差異（< 0.05），分別是對(duì)照組的1.06和1.01倍。96 h時(shí)，斜生四鏈藻的SOD活性表現(xiàn)為應(yīng)激性上升，與對(duì)照組相比，0.5～6.0 mg·L-1處理組均呈現(xiàn)出顯著性差異（< 0.05），分別是對(duì)照組的1.17、1.06和1.25倍。這些結(jié)果與先前報(bào)道的關(guān)于暴露于四環(huán)素的普通小球藻抗氧化酶活性的觀察結(jié)果一致[35]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)暴露于金霉素時(shí)，鈍頂螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的SOD活性也顯著增加，這可能是由于藻細(xì)胞通過提高SOD活性增強(qiáng)消除O2和 H2O2自由基的能力[36]。有研究報(bào)道微藻細(xì)胞內(nèi)SOD催化反應(yīng)產(chǎn)生過量的H2O2可能會(huì)在藻細(xì)胞中積累，從而導(dǎo)致藻類生長(zhǎng)抑制[32]。

圖5 斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除率（a）和OD690值變化（b）

Figure 5 Removal rate (a) and OD690value (b) of tetracycline by

谷胱甘肽（GSH）是微藻細(xì)胞中一種重要的非酶抗氧化劑，它的主要作用是避免細(xì)胞中的重要酶被氧化，以維持細(xì)胞中正常的能量代謝[37]。由圖4(c)可知，不同濃度四環(huán)素脅迫斜生四鏈藻48 h時(shí)，0.5 mg·L-1處理組與對(duì)照組相比，無顯著性差異（> 0.05）；1.5、6.0 mg·L-1處理組與對(duì)照組相比，有顯著性差異（< 0.05），分別是對(duì)照組的1.17、1.19倍。96 h時(shí)，0.5～6.0 mg·L-1處理組藻細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著高于對(duì)照組（0.05），在522.3～614.52 μmol·g-1范圍內(nèi)波動(dòng)。結(jié)果說明斜生四鏈藻可以通過提高GSH含量消除微藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS并抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)微藻受到污染物的毒害時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)會(huì)變得活躍起來，GSH含量對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原系統(tǒng)的平衡以及清除細(xì)胞內(nèi)過量的ROS具有重要的作用[38]。類似研究表明，銅綠微囊藻在10和20 mg·L-1的頭孢拉定作用下，細(xì)胞中GSH含量顯著增加，這可能是為了消除藻體內(nèi)ROS和抵抗氧化應(yīng)激的策略[39]。

2.5 斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除作用

圖5為48 h內(nèi)斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除率及OD690值變化。從四環(huán)素去除率來看，在36 h內(nèi)，斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除率較高，在36 h以后逐漸變緩。在培養(yǎng)48 h以后，斜生四鏈藻對(duì)于四環(huán)素的去除率達(dá)到了90%，對(duì)照組的去除率為19%。通過OD690值變化可以看出斜生四鏈藻在36 h時(shí)生長(zhǎng)值達(dá)到最大值0.24，48 h時(shí)開始下降至0.22。這些結(jié)果表明，四環(huán)素對(duì)斜生四鏈藻不僅具有脅迫作用，斜生四鏈藻還具有快速、高效的去除四環(huán)素的能力。這種去除能力對(duì)于發(fā)展微藻生物技術(shù)去除抗生素類藥物具有重要意義。已有研究報(bào)道小球藻處理的合成廢水中四環(huán)素去除的主要機(jī)制是光降解和生物吸附（43 h后為92%～98%）[40]。在基于微藻和細(xì)菌的池塘中，通過間接光降解對(duì)四環(huán)素的去除率超過93%[41]。Xie等[42]在利用衣藻Tai-03去除PPCPs的研究中發(fā)現(xiàn)其可以完全去除四環(huán)素和雙酚A，其中四環(huán)素的主要去除途徑是光解和水解。Pan等[43]在利用藍(lán)藻減輕抗生素污染的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻（2 d內(nèi)去除36.7%～93.9%）和銅綠微囊藻（2 d內(nèi)去除超過98%）均具有去除四環(huán)素的潛力，且生物降解在銅綠微囊藻去除四環(huán)素的過程中占主導(dǎo)地位（71.6%），而蛋白核小球藻僅占20.5%。說明利用微藻去除四環(huán)素能力的差異很大程度上取決于微藻種類，但有關(guān)斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

以斜生四鏈藻為研究對(duì)象，研究了四環(huán)素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)、光合色素含量、葉綠素?zé)晒饧翱寡趸到y(tǒng)的影響以及斜生四鏈藻對(duì)四環(huán)素的去除作用。從所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論：1）不同濃度的四環(huán)素脅迫均會(huì)抑制斜生四鏈藻的光合色素含量并引起其光合活性的損傷，并抑制其生長(zhǎng)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。四環(huán)素暴露96 h時(shí)，光合色素含量以及v/m值較48 h均有所上升。2）四環(huán)素脅迫導(dǎo)致斜生四鏈藻細(xì)胞MDA含量顯著增加，斜生四鏈藻可以通過誘導(dǎo)其SOD活性上升及GSH含量升高應(yīng)對(duì)四環(huán)素脅迫。3）斜生四鏈藻具有快速、高效的去除四環(huán)素的能力。

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Response and remove ofto tetracycline in water

YANG Jun1, CHEN Zhengjie1, WANG Haifeng1, XIE Zhengxin1,2, TANG Jun1,2

(1. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. Hefei Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment, Ministry of Agriculture, Hefei 230036)

Tetracycline persists in the water environment due to its low biodegradability and water solubility, posing a high potential risk to ecological environment. In order to explore the toxic effect of tetracycline residual in water environment on algae, the stress response and removal effect ofto different concentrations of tetracycline (0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 4.0 and 6.0 mg·L-1) in water were investigated. The results showed that the growth ofwas inhibited at each concentration of tetracycline treatment group, with the highest inhibition rate reaching 72.99%, and the half effect mass concentration (96 h-EC50) and inhibitory effect 80% mass concentration (96 h-EC80) of tetracycline onwere 2.46 and 6.9 mg·L-1, respectively. Under the stress of the same concentration of tetracycline, the photosynthetic pigment content andv/mvalue ofshowed the same trend as the cell density of. Compared with the control group, the inhibition rates of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid content in 6.0 mg·L-1concentration group at 96 h were 87.32%, 66.91% and 87.58% respectively , and thev/mvalue decreased by 77.4%. Under the stress of low, medium and high concentrations of tetracycline (0.5, 1.5, 6.0 mg·L-1) for 96 h, the malondialdehyde (MDA) content ofshowed a trend of increasing first and then decreasing; the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of glutathione (GSH) were induced in different degrees. After exposure for 96 h, the activity of SOD and the content of GSH in the 6.0 mg·L-1group were 1.25 and 1.53 times higher than those in the control group. When the initial OD690value ofwas 0.15 and the concentration of tetracycline was 4.0 mg·L-1, the removal rate of tetracycline byreached 90% within 48 h, while that of the control group was 19%. These studies provide some new information on the ecotoxicity of tetracycline to primary producers in water, and also provide a new direction for the ecological remediation of residual tetracycline in water.

tetracycline;; acute toxicity; removal effect

X171.5; X52

A

1672-352X (2023)02-0289-08

2022-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（51609001，51709002）資助。

楊 俊，碩士研究生。E-mail：anhuinongye@163.com

通信作者:唐 俊，博士，副教授。E-mail：tangjun@ahau.edu.cn

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.019

2023-05-12 10:26:03

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20230511.1337.038.html