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    柵藻作為生物指示劑的生物延遲發(fā)光研究*

    2018-10-18 06:33:20張玉風楊美娜龐靖祥周寶宸韓金祥
    生物醫(yī)學工程研究 2018年1期
    關(guān)鍵詞:柵藻吳茱萸光子

    張玉風,楊美娜,龐靖祥,周寶宸,韓金祥△

    (1.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院,山東 濟南 250020; 2.山東省醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心,山東 濟南 250062)

    1 引 言

    生物光子輻射又稱超微弱發(fā)光,是生命系統(tǒng)的本質(zhì)現(xiàn)象,存在于各種動物、植物、藻類及微生物系統(tǒng)中,是生命新陳代謝的產(chǎn)物,來自生物分子從高能態(tài)向低能態(tài)的躍遷[1],是一個典型的量子效應。大量實驗結(jié)果表明,生物光子輻射可以反映生物系統(tǒng)內(nèi)部的微觀信息及外界環(huán)境的微弱變化,且具有很高的靈敏度[2]。生物光子輻射包括自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光,延遲發(fā)光是指一個生物系統(tǒng)被光照射后的長時間遲豫現(xiàn)象,其遲豫動力學過程不可用指數(shù)函數(shù)描述[3],延遲發(fā)光作為一種特殊的生物光子輻射,被認為是反映生物系統(tǒng)內(nèi)部狀態(tài)的一個指標[4-5]。

    有報道稱[6],通過檢測加入生物指示劑(一種標準的生物發(fā)光樣品)的水的延遲發(fā)光行為可以獲得關(guān)于水質(zhì)量與水污染的信息。柵藻是一種極喜在營養(yǎng)豐富的靜水中繁殖的淡水單細胞綠藻,對除草劑等農(nóng)藥十分敏感[7],常用于重金屬對藻類的毒性研究中[8-11],可敏感感知不同液體環(huán)境,快速、高效區(qū)分多種水質(zhì)污染,常用作水質(zhì)評價的指示生物?;诖?,本研究選用柵藻作為生物指示劑,探索其最優(yōu)使用條件,并探討加入不同中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光動力學行為演化,為用柵藻作為生物指示劑來研究中藥藥性奠定基礎(chǔ)。

    2 材料和方法

    2.1 材料

    生物指示劑:柵藻(Scenedesmus sp.) 購自中國科學院武漢水生生物研究所 (編號FACHB-933),使用BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

    主要儀器設(shè)備:YPMS-2生物光子測量儀,UV-2802型紫外可見分光光度計,GXZ智能光照培養(yǎng)箱,超凈工作臺,MLS-3780高壓滅菌鍋,尚朋堂電陶爐,康舒砂鍋,石英比色皿,ACCULAB電子天平,錐形瓶,燒杯,量筒,離心管,移液槍。

    2.2 方法

    2.2.1柵藻濃度的優(yōu)化 本研究選用光密度法測定柵藻濃度。測量波長為680 nm,柵藻的吸光度A與細胞濃度C的線性回歸方程為C=(A×11.995+0.1502)×106個/ml (R2=0.9766)[12-13],根據(jù)測得的柵藻吸光度,計算出柵藻的濃度。

    選取生長狀態(tài)良好的柵藻,搖勻,分別取適量藻液置于16個15 mL離心管中,加入適量BG11培養(yǎng)基稀釋,得到吸光度為1~3的藻液。分別取3 mL藻液置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色皿中,放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi),測其自然延遲(點間隔0.1 s,測量時間5 min)及激發(fā)延遲(點間隔0.1 s,測量時間5 min,激發(fā)光源為White-LED,激發(fā)時間為10 s,重復測量7次,兩次測量間隔20 min)。

    2.2.2柵藻生長階段的優(yōu)化 分別選取生長至16、21、30、40、51、60、70 d的生長狀態(tài)良好的柵藻,均調(diào)節(jié)至柵藻液的吸光度為2.5,取3 mL置于4×1×1 cm的石英比色皿中,放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi),測其自然延遲及激發(fā)延遲,每個生長階段的柵藻平行測定3次以減少測量誤差。

    自然延遲參數(shù)設(shè)置:點間隔0.1 s,測量時間15 min;激發(fā)延遲參數(shù)設(shè)置:點間隔0.1 s,測量時間5 min,激發(fā)光源為White-LED,激發(fā)時間10 s,重復測量7次,兩次測量間隔20 min。

    2.2.3加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測量 本研究選用黃連和吳茱萸2味中藥進行初步研究。

    (1)中藥煎煮液的制備[14]

    用電子天平秤取中藥材10 g,置于砂鍋中,加入200 mL水浸泡30 min,用電陶爐加熱,功率調(diào)至2000 W,煮沸后調(diào)至800 W,共煎煮15 min,用6層紗布過濾藥液,藥渣重復上述煎煮流程,將2次煎煮的藥液合并濃縮,放涼至室溫,最終得中藥煎煮液50 mL。

    (2)中藥煎煮液的延遲發(fā)光測量

    選取生長40 d的狀態(tài)良好的柵藻,調(diào)至吸光度為2.5,取3 mL置于4 ×1×1 cm的石英比色皿中,分別加入中藥煎煮液20、40、60、80、100 μL,迅速放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi),5 min后測其激發(fā)延遲。

    激發(fā)延遲參數(shù)設(shè)置:點間隔0.1 s,測量時間5 min,激發(fā)光源為White-LED,激發(fā)時間10 s,重復測量7次,兩次測量間隔20 min。

    2.2.4數(shù)據(jù)處理分析 本研究采用“顧參數(shù)”模型對數(shù)據(jù)進行分析處理?!邦檯?shù)”模型運用了量子光學理論和非平衡統(tǒng)計物理的概念,可以對延遲發(fā)光數(shù)據(jù)進行很好的擬合。目前已被發(fā)現(xiàn)其能夠刻畫許多不同生物樣品延遲發(fā)光的實驗結(jié)果,如動物組織、種子、食品、水藻、微生物系統(tǒng)、甚至化妝品等[15]。

    將測得的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)導入Statistica 10.0軟件,擬合公式編輯為顧參數(shù)公式

    I(t)=Acsch2(t/B+C)

    (1)

    得到3個擬合參數(shù),即“顧參數(shù)”A、B、C,然后帶入平均強度的計算公式

    IW=AB/W[coth C-coth(W/B+C)]

    (2)

    得到每次延遲發(fā)光的輻射強度在總的測量時間W內(nèi)的平均值即平均強度,然后將7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度IW與時間t進行線性擬合得到線性擬合方程IW=kt+b,其中斜率k扮演了刻畫樣品性質(zhì)的可靠參數(shù)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 柵藻濃度的優(yōu)化

    將理論結(jié)果式(1)與柵藻的實際延遲發(fā)光數(shù)據(jù)相比較,見圖1、圖2,自然延遲發(fā)光和激發(fā)延遲發(fā)光的理論值與觀察值均有相當好的擬合,相關(guān)系數(shù)分別為0.9982和0.9863,說明 “顧參數(shù)”模型是處理延遲發(fā)光數(shù)據(jù)的可靠模型,具有相當高的精確性。

    圖1柵藻自然延遲的理論值與觀察值的線性相關(guān)(A=2.483)

    Fig1Linearcorrelationbetweenthescenedesmusnaturaldelaytheoreticalandobservedvalue(A=2.483)

    圖2柵藻激發(fā)延遲的理論值與觀察值的線性相關(guān)(A=2.483)

    Fig2Linearcorrelationbetweenthescenedesmusexcitationdelaytheoreticalandobservedvalue(A=2.483)

    表1給出了不同濃度柵藻的自然延遲發(fā)光平均強度及7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對時間的線性擬合斜率k及擬合度R2。我們發(fā)現(xiàn),自然延遲發(fā)光的平均強度基本上隨柵藻濃度的增大而增大(見圖3),激發(fā)延遲發(fā)光的斜率k和擬合度R2在柵藻濃度低于2.5×107個/mL時波動較大,在2.5~3.5×107個/mL濃度范圍內(nèi)較穩(wěn)定(見圖4),因此,我們選定柵藻使用的濃度范圍為2.5~3.5×107個/mL??紤]到柵藻的培養(yǎng)周期及使用量,實驗中我們選用的柵藻濃度為3.0×107個/mL,即調(diào)節(jié)柵藻的吸光度為2.5。

    表1不同濃度柵藻延遲發(fā)光的參數(shù)對比

    Table1Thecontrastofdelayedluminescenceparametersofdifferentconcentrationsofscenedesmus

    編號柵藻吸光度柵藻濃度(107個/ml)自然延遲平均強度激發(fā)延遲線性擬合k線性擬合R210.9591.165645.0582.2640.95521.0751.3051272.8894.9140.98031.2881.5601033.4120.9020.79541.3831.6741310.6071.0070.74051.4911.8041079.6313.8690.96161.6061.9411820.9650.3740.24371.7052.0601607.0268.2310.98581.8782.2681360.8629.7050.99892.0292.4492125.9462.3640.799102.1012.5351798.5856.0770.989112.2232.6821764.3815.8290.944122.3092.7851828.3316.6850.976132.4832.9931700.7466.3780.953142.6793.2292057.6846.1890.916152.8853.4761929.1736.0100.986163.0143.6302201.4387.7010.952

    圖3柵藻自然延遲平均強度隨柵藻濃度的變化

    Fig3Scenedesmusnaturaldelayaverageintensityalongwiththechangeofalgalcellsconcentration

    圖4柵藻激發(fā)延遲斜率及擬合度隨柵藻濃度的變化

    Fig4Scenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreealongwiththechangeofalgalcellsconcentration

    3.2 柵藻生長階段的優(yōu)化

    本研究測定了7個生長階段的柵藻的自然延遲發(fā)光,并計算了其平均強度。見圖5,生長70 d的柵藻自然延遲發(fā)光的平均強度較其他幾組較低,且與生長21、30、51、60 d的柵藻自然延遲發(fā)光平均強度相比有統(tǒng)計學差異。除生長70 d的柵藻,其余各組兩兩比較均無顯著性差異。

    圖5不同生長階段柵藻自然延遲平均強度對比

    Fig5Thecontrastofscenedesmusnaturaldelayaverageintensityindifferentgrowthstages

    圖6給出了7個生長階段的柵藻7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線性擬合斜率k,可以看出,生長16~30 d的柵藻k值較高,且組間無顯著性差異,生長40~70 d的柵藻k值較低,組間無顯著性差異,生長16、21、30 d的任意一組柵藻與生長40、51、60、70 d的任意一組柵藻兩兩比較均有顯著性差異。

    圖6不同生長階段柵藻激發(fā)延遲k值對比

    Fig6Thecontrastofscenedesmusexcitationdelaykvalueindifferentgrowthstages

    生物光子輻射能夠反映系統(tǒng)內(nèi)部新陳代謝的狀態(tài),隨著柵藻培養(yǎng)時間的延長,細胞的生命力減弱,表現(xiàn)為k值的降低。但考慮到柵藻的使用濃度較高時k值較為穩(wěn)定,生長70 d的柵藻自然延遲平均強度較低,第七次激發(fā)延遲初始強度較高,故本研究選用柵藻使用的最佳生長階段為40~60 d。

    3.3 加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測量

    本研究選擇了黃連、吳茱萸進行中藥煎煮液延遲發(fā)光的初步研究。圖7、圖8分別給出了加入不同體積黃連、吳茱萸煎煮液的柵藻7次激發(fā)延遲發(fā)光平均強度對時間的線性擬合斜率k和擬合度R2,從圖中可以看出,加藥體積為20 μL時擬合度最高,加入黃連煎煮液的柵藻k值低于加入?yún)擒镙羌逯笠旱臇旁錵值,加入20 μL的吳茱萸煎煮液的柵藻k值約為加入20 μL的黃連煎煮液的柵藻k值的3倍。本實驗結(jié)果說明檢測加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光時,中藥煎煮液加入的最適體積為20 μL;柵藻對其所處的液體環(huán)境非常敏感,k值可反映柵藻所處液體環(huán)境的差異。

    圖7加入不同體積黃連煎煮液的柵藻激發(fā)延遲斜率和擬合度對比

    Fig7ThecontrastofscenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreeafteraddingdifferentvolumeofCoptidisrhizomadecoctionfluid

    圖8加入不同體積吳茱萸煎煮液的柵藻激發(fā)延遲斜率和擬合度對比

    Fig8ThecontrastofscenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreeafteraddingdifferentvolumeofEuodiaefructusdecoctionfluid

    4 結(jié)論

    本研究主要研究了柵藻的延遲發(fā)光,并對其使用條件進行優(yōu)化,主要得到如下結(jié)論:

    (1)通過檢測不同濃度柵藻的延遲發(fā)光,我們發(fā)現(xiàn),柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的k值在2.5~3.5×107個/mL濃度范圍內(nèi)較穩(wěn)定,為了減少誤差,實驗中我們選用同等濃度的柵藻,其濃度為3.0×107個/mL,即調(diào)節(jié)柵藻的吸光度為2.5。

    (2)柵藻在不同的生長階段,延遲發(fā)光會有所不同。通過對不同生長階段柵藻自然延遲發(fā)光平均強度、第7次激發(fā)延遲發(fā)光的初始強度、7次激發(fā)延遲發(fā)光k值的綜合分析,實驗選用生長40~60 d柵藻。

    (3)通過檢測不同中藥煎煮液對柵藻延遲發(fā)光的影響,我們選定中藥煎煮液加入的最適體積為20 μL;同時,我們發(fā)現(xiàn)加入不同中藥煎煮液的柵藻k值有較大差異。

    韓金祥等[16-17]基于生物光子相干理論提出中藥藥性量子假說,提出機體電磁輻射(量子)可以表征中醫(yī)之氣,四氣是調(diào)節(jié)機體電磁輻射量子疊加態(tài)的度量,通過檢測不同藥性中藥生物光子輻射行為的差異,可從整體上獲得表征中藥藥性的生物光子量化指標。本研究在優(yōu)化柵藻使用條件的基礎(chǔ)上,檢測了加入不同中藥煎煮液的柵藻激發(fā)延遲發(fā)光行為,發(fā)現(xiàn)其k值有較大差異。黃連和吳茱萸的寒熱藥性不同,加入柵藻中后,改變了柵藻所處的液體環(huán)境,從而改變了柵藻的生命狀態(tài),表現(xiàn)為其動力學行為的變化,而這種變化可由k值刻畫。由此我們構(gòu)想,用柵藻作為生物指示劑,檢測其加入不同藥性中藥煎煮液后的延遲發(fā)光行為,其k值用于表征不同藥性中藥的差異。當然,這只是我們基于實驗結(jié)果的猜想,還需要大量數(shù)據(jù)的驗證,但這為中藥藥性的研究提供了新的方向。

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