無綠藻的微生物學(xué)特性和菌種鑒定

楊金 章強(qiáng)強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

無綠藻感染引起的無綠藻病是一種較罕見疾病，自1964年Davies[1]首次報(bào)道1例中型無綠藻 (Protothecazopfii)所致的皮膚無綠藻病以來，全球范圍內(nèi)已有190例文獻(xiàn)報(bào)道，其中近1/3的無綠藻病例在最近10年內(nèi)被報(bào)道，說明無綠藻病發(fā)病率有升高趨勢。雖然無綠藻作為病原體在人群中發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，然而發(fā)病率的升高可能和免疫功能低下人群的增多有關(guān)[2]。為提高對無綠藻這一條件致病真菌的認(rèn)識，以期對無綠藻病的診治有進(jìn)一步探索，本文對無綠藻的微生物學(xué)特性和鑒定方法進(jìn)行簡要綜述。

1 分類學(xué)

從1894年Kruger首次分離出無綠藻[3]以來，無綠藻的分類一直受到爭議。最初，根據(jù)在沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后的酵母樣外觀，無綠藻被歸為真菌，然而無綠藻既不能和酵母也無法和更低級別的藻類植物聯(lián)系起來。1913年Chodat[4]根據(jù)無綠藻和小球藻相同的無性繁殖生成內(nèi)孢子的繁殖方式，重新將其歸于藻類。1930年Asdforth等[5]從熱帶口炎性腹瀉的病例中分離出Protothecazopfii和P.portoricensisvar.trisporus，并確定這種生物可以在合成培養(yǎng)基上生長。Ciferri[6]在1957年將無綠藻重新歸為酵母菌。目前普遍認(rèn)為，無綠藻在進(jìn)化過程中一定程度上由小球藻發(fā)育而來，同時(shí)在細(xì)胞壁組成、生理學(xué)和抵抗外界環(huán)境壓力的能力有所不同[7-8]。無綠藻細(xì)胞壁含有的孢粉素是一種穩(wěn)定的生物高聚物，使其可以抵抗機(jī)械壓力、物理化學(xué)因素以及酶降解[9]?；诩?xì)胞壁的特征，目前無綠藻在生物學(xué)分類中處于真核生物 (Eukaryota)、綠色植物界 (Viridiplantae)、綠藻門 (Chlorophyta)、Trebouxlophyceae綱、綠藻目 (Chlorellales)、綠藻科 (Chlorellaceae)、無綠藻屬 (Prototheca)[2]。

在過去，只有3種無綠藻被識別：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)和小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)[10]。然而從人和動(dòng)物身上分離的幾株菌株測序核糖體RNA結(jié)果顯示，先前描述的中型無綠藻變種可能是不同的種類。中型無綠藻基因1型通常在牛糞中發(fā)現(xiàn)，然而大多數(shù)牛乳腺炎是由中型無綠藻基因2型導(dǎo)致。從豬糞而非牛糞中分離的中型無綠藻基因3型，被重新命名為Protothecablaschkeae。最近Kazuo等[11]在一位患者感染皮膚上得到的活檢標(biāo)本，通過組織病理和微生物培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)并分離出一種新的無綠藻。通過分子鑒定等技術(shù)確定該菌株和小型無綠藻和小球藻有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，是無綠藻屬的新種類，提出Protothecacutissp.nov。目前，普遍認(rèn)為無綠藻屬包括6個(gè)種：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)、小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)、Protothecaulmea、Protothecablaschkeae及Protothecacutis[12]。

2 流行病學(xué)

無綠藻廣泛存在于自然界，通常能從植物表面、土壤或者水源中分離出，也可能暫時(shí)以菌落的形式存在于人或動(dòng)物的消化道，有時(shí)定植在人體皮膚和甲床而無臨床表現(xiàn)。然而因?yàn)闊o綠藻的腐生性質(zhì)，它們更傾向于污水、牲畜糞液等潮濕環(huán)境來持續(xù)獲得可供降解的有機(jī)物[10]。

無綠藻導(dǎo)致的無綠藻病是一種罕見、散發(fā)疾病。人、犬、貓及非家養(yǎng)哺乳動(dòng)物均可能感染[13]。人類無綠藻的感染較多由小型無綠藻導(dǎo)致[14-15]，中型無綠藻感染的病例也有報(bào)道[15]，最近發(fā)現(xiàn)的P.cutis也能引起人感染造成皮膚損害[11]。其他幾種無綠藻主要導(dǎo)致動(dòng)物感染，如牛乳腺炎。具體菌種致病性及臨床表現(xiàn)見表1。

表1 無綠藻與疾病表現(xiàn)

注：C.皮膚,M.乳腺炎,O.鷹嘴滑膜炎,S.系統(tǒng)感染

3 真菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征

無綠藻與酵母菌外形相似，呈球形、橢圓形甚至腎型，是直徑3～30 μm不等的單細(xì)胞微生物。無綠藻不含細(xì)菌特有的胞壁酸及真菌特有的葡糖胺[16-17]，缺乏葉綠體，電鏡下觀察可見細(xì)胞壁僅兩層。無綠藻進(jìn)行無性繁殖，孢子囊是無綠藻屬的主要結(jié)構(gòu)，大約2～20個(gè)內(nèi)生孢子從一個(gè)孢子囊中逐漸發(fā)育長大并隨著孢子囊的破裂被動(dòng)釋放出來[18]。不同種類無綠藻的孢子囊直徑不同[19]，大型無綠藻孢子囊直徑7～14 μm，中型無綠藻7～30 μm，小型無綠藻3～10 μm。小型無綠藻的孢子囊為桑葚狀，有多分隔結(jié)構(gòu)，內(nèi)孢子呈對稱排列。其他類型無綠藻不形成多分隔結(jié)構(gòu)，而是表現(xiàn)為隨意的不規(guī)則分隔[2]。無綠藻培養(yǎng)適溫在25～30℃之間，需氧或微需氧[20]。一般菌落形態(tài)為潮濕、灰白色乳酪樣，鏡下結(jié)構(gòu)呈圓形或橢圓形孢子，壁厚、無菌絲及芽孢，內(nèi)含特征性內(nèi)孢子。

4 藥物敏感性

無綠藻體外藥敏實(shí)驗(yàn)，至今尚無美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控及MIC折點(diǎn)，因此只能從已經(jīng)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)中總結(jié)無綠藻菌對不同種類藥物的敏感性。

體外藥敏實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)無綠藻屬對兩性霉素B敏感[21-24]，這一結(jié)果也與臨床實(shí)際治療情況相符。Todd等[25]通過分析160例患者所接受的167種可評估治療方案，發(fā)現(xiàn)靜脈注射兩性霉素B臨床上最常用且效果最好，治療成功率為77%；章強(qiáng)強(qiáng)等[26]報(bào)道的1例小型無綠藻所致腦膜炎病例中，使用兩性霉素B治療也獲得了良好療效。兩性霉素B或其脂質(zhì)體成為現(xiàn)今國外一線治療無綠藻病方案之一。其次，體外藥敏實(shí)驗(yàn)顯示兩性霉素B和四環(huán)素對抑制無綠藻屬有協(xié)同作用[27]，臨床上兩藥聯(lián)合治療取得成功[28]。

無綠藻對不同唑類藥物敏感性不同，不同種無綠藻對同一唑類藥物敏感性也有差別。在近10年的49例藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道，對伊曲康唑敏感的有17例，其中中型無綠藻2例[29-30]，小型無綠藻15例；對酮康唑敏感的2例，均為小型無綠藻。Linare[15]測定了104株無綠藻，顯示其對伏立康唑均敏感，MIC≤0.5 μg/mL。中型無綠藻和小型無綠藻對咪康唑敏感，其他型無綠藻則未發(fā)現(xiàn)對咪康唑的敏感性。無綠藻對唑類藥物以及多烯類藥物的敏感性可能是因?yàn)槠浼?xì)胞膜中性脂質(zhì)部分存在麥角固醇[31]，特別是小型無綠藻，麥角固醇的含量達(dá)到4%。此外，無綠藻對咪唑類的藥物敏感型呈現(xiàn)出顯著差別，細(xì)胞膜中游離脂肪酸含量的不同可能是其根本原因[2]。

抗細(xì)菌藥物中，無綠藻對氨基糖苷類抗生素 (阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素)較敏感[32]。近年來國外研究者所做的藥敏實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)慶大霉素、卡那霉素對無綠藻的有效性[32-36]，其中慶大霉素的MIC在0.3～0.9 μg/mL之間。最近Morandi[32]報(bào)道奈替米星顯示出對無綠藻良好的抑制性，實(shí)驗(yàn)中奈替米星對無綠藻的MIC50為12 μg/mL，MIC90為24 μg/mL,且對于不同種無綠藻的MIC均相同。乳酸鏈球菌肽是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種具有廣譜抗菌作用的細(xì)菌素。Morandi等[32]通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分中型無綠藻菌對不同濃度的乳酸鏈球菌肽敏感。

雖然各種體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，但綜合所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，無綠藻屬對于5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、磺胺類藥物、β-內(nèi)酰胺類抗生素、萬古霉素、紅霉素、氯霉素等是耐藥的。

5 常用鑒定方法

無綠藻的分型鑒定主要通過直接鏡檢、真菌培養(yǎng)以及組織病理學(xué)，近年來隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定成為無綠藻分型鑒定的重要手段，下面分別敘述。

5.1 直接鏡檢

10%氫氧化鉀溶液制片直接鏡檢，可見大量圓形、卵圓形或橢圓形孢子，大小不一，菌體透明，壁厚、無菌絲、芽孢及芽生現(xiàn)象，內(nèi)含特征性內(nèi)孢子。吳紹熙等[37]報(bào)道的由中型無綠藻引起的皮膚無綠藻病，皮損直接KOH涂片可見成團(tuán)的圓形或卵圓形單壁發(fā)亮不出芽孢子，直徑1.3～11 μm，有時(shí)可見多個(gè)直徑為4～5 μm的內(nèi)孢子。在組織病理學(xué)顯示皮下結(jié)節(jié)內(nèi)有大量圓形或橢圓形孢子，壁厚，內(nèi)有1～8個(gè)分隔。真菌直接鏡檢不能區(qū)分具體種。

5.2 真菌培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)條件下，肉眼觀察菌落形態(tài)呈潮濕、灰白色乳酪樣。中型無綠藻菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶；小型無綠藻最適生長溫度為30℃，菌落呈半球形，邊緣光滑，細(xì)胞形態(tài)和中型無綠藻相似但是更?。淮笮蜔o綠藻因?yàn)楫a(chǎn)生莢膜，菌落呈黏液樣，表面平坦，邊緣光滑，和小型無綠藻及中型無綠藻不同，大型無綠藻在37℃不能較好生長只能在30℃生長[2]；P.blaschkeae菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶。此外，在章強(qiáng)強(qiáng)等[26]報(bào)道的1例小型無綠藻引起的腦部感染病例中，小型無綠藻在念珠菌顯色平皿 (CHROMagarCandida)上形成粉紅色菌落。

5.3 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)檢查常顯示不同的形態(tài)，可表現(xiàn)為嚴(yán)重的肉芽腫樣壞死或無任何炎癥改變。大部分為炎性肉芽腫伴壞死；各種炎性細(xì)胞、組織細(xì)胞混合浸潤；角化過度及假上皮瘤樣增生；局灶性角化不全；淋巴樣組織增生；可在表皮或真皮乳頭層中部及其他感染組織中發(fā)現(xiàn)孢子囊。在系統(tǒng)性無綠藻病中還可出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多癥及膽囊、十二指腸和肝門等感染部位的纖維性變[2]。PAS染色可清晰分辨病原菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，也可采用Gridley真菌染色法 (Gridley fungus stain)或Grocott-Gomori六胺銀改良法。無綠藻組織病理學(xué)特征為孢子囊形態(tài):圓形、卵圓形、橢圓形，內(nèi)含數(shù)個(gè)厚壁內(nèi)孢子，不出芽。HE染色不明顯，PAS染色明顯可見。小型無綠藻感染組織病理可見到桑葚樣、草莓樣孢子囊，當(dāng)孢子囊內(nèi)有許多分隔的母細(xì)胞 (內(nèi)孢子)就構(gòu)成車輪狀排列，而中型無綠藻無上述特點(diǎn)。除了常規(guī)染色，Pal等[38]通過對分離出的致病無綠藻屬應(yīng)用Narayan染色，成功顯示出其組織形態(tài)進(jìn)而鑒定。

5.4 生化特性

Arnold等[39]利用蔗糖、海藻糖、乳糖、肌糖、正丙醇、木糖等作為碳源進(jìn)行碳源同化實(shí)驗(yàn)對無綠藻屬進(jìn)行鑒定。這種生長譜法結(jié)果可靠但花費(fèi)時(shí)間，一般需要2周才能明確鑒別。對海藻糖的利用可以作為鑒別中型無綠藻及小型無綠藻的主要手段：小型無綠藻可利用海藻糖但不能利用正丙醇，而中型無綠藻相反。偶爾碳源來源、純度及培養(yǎng)基的成分可能會(huì)給鑒定結(jié)果帶來偏差。利用藥敏特性也能幫助進(jìn)行無綠藻鑒定：中型無綠藻對克霉唑 (50 μg)耐藥，而小型無綠藻對克霉唑 (50 μg)敏感[40]；對新霉素的不同敏感性可以將大型無綠藻與中型無綠藻、小型無綠藻鑒別[41]。API 20C AUX、API 50、Vitek-2酵母鑒定系統(tǒng)及Rapid ID Yeast Plus test等商業(yè)化酵母鑒定試劑板可幫助鑒定菌種，但近來有實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典的酵母鑒定試劑板API 20C AUX鑒定的結(jié)果與分子生物學(xué)測序結(jié)果不符，分析認(rèn)為API 20CAUX可能是早年建立的數(shù)據(jù)庫，覆蓋的菌種庫相對有限，特別是隨著新的菌種及其變種或亞型不斷增多，商業(yè)化酵母鑒定試劑板有一定局限性。另外利用熒光抗體技術(shù)可以檢驗(yàn)無綠藻屬的感染,但不能確定種。

5.5 分子生物學(xué)

近年來發(fā)展的分子生物學(xué)的鑒定方法可將菌株鑒定至亞種或變種[42]，且與傳統(tǒng)真菌學(xué)檢查方法相比，具有耗時(shí)短、客觀、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

基因序列同源性分析法 目前真菌DNA序列分析的研究幾乎都集中在核糖體DNA (rDNA)上，核糖體大亞基 (LSU)D1D2區(qū)、小亞基 (SSU)D12D2區(qū)以及核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列ITS區(qū)在真菌核酸序列分析中，常用于真菌種水平的鑒定。其中LSU、ITS序列大小適中,因此在分類及鑒定中更為常用。2013年Hirose等[43]首次成功對小型無綠藻的ITS序列完整擴(kuò)增，并發(fā)現(xiàn)ITS片段在不同菌種間差別較大，大小順序是小型無綠藻>P.blaschkeae>中型無綠藻>P.cutis。朱利平、章強(qiáng)強(qiáng)等[44]通過D1/D2序列對兩株無綠藻鑒定至種的水平，然而無法通過ITS序列進(jìn)行鑒定，這可能是由其低覆蓋率和或低相似度造成。2014年Marques等[12]優(yōu)化PCR條件，通過向PCR反應(yīng)中添加5%DMSO，實(shí)現(xiàn)了完整ITS區(qū)域的穩(wěn)定擴(kuò)增，對14株P(guān).blaschkeae和18株中型無綠藻2型成功鑒定，并發(fā)現(xiàn)中型無綠藻2型的ITS序列長度雖然相較P.blaschkeae更短，但是種內(nèi)多樣性更加顯著。

基于PCR的分子技術(shù) ①PCR-SSCP:聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCR-SSCP)是基于PCR 的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)?；具^程是:PCR擴(kuò)增靶DNA；將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。2012年Cremonesi等[45]利用此技術(shù)對50個(gè)臨床分離株成功進(jìn)行鑒定，對18S rDNA基因的兩個(gè)區(qū)域PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同種菌株遷移速率存在差別，由快到慢分別是中型無綠藻基因型2>中型無綠藻基因型1>P.ulmea>P.blaschkeae>大型無綠藻。雖然PCR-SSCP技術(shù)具有快速、簡單、高度重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，并可以鑒定出傳統(tǒng)PCR方法無法鑒定的P.ulmea和大型無綠藻，但此技術(shù)對于無綠藻的鑒定也有一定局限性，例如反應(yīng)對溫度和pH較敏感及DNA片段長度的限制。②PCR-RFLP:PCR-限制性片段長度多態(tài)性 (Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP) 技術(shù)的原理是PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。這種方法對DNA 的量和純度沒有很高的要求，可簡化圖譜的帶型，易于分析[46]。2008年，Aouay等[47]利用此技術(shù)對分離自患有乳腺炎奶牛的30株中型無綠藻菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果有27株為中型無綠藻基因型2，3株為中型無綠藻基因型3 (即P.blaschkeae)，結(jié)果與基因型特異性PCR鑒定結(jié)果一致。2010 年Tomasz Jagielski等[48]利用同樣技術(shù)成功對分離自患有乳腺炎奶牛的44個(gè)無綠藻菌株進(jìn)行分型。③兩步法熒光定量PCR技術(shù)/DNA分辨率溶解曲線分析 (two step Real Time PCR reaction followed by DNA Resolution Melting Analysis):Two-stepqPCR/RMA是一種快速、高通量的鑒定方法，相比于傳統(tǒng)的分子學(xué)鑒定更加準(zhǔn)確、穩(wěn)健、性價(jià)比高。2010年Ricchi等[49]運(yùn)用此種方法成功鑒定了中型無綠藻基因型1、中型無綠藻基因型2和P.blaschkeae。然而由于全世界范圍內(nèi)缺乏大型無綠藻、小型無綠藻及P.ulmea的保存培養(yǎng)株，第二步qPCR能否用于更多無綠藻種的鑒定有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。④RAPD-PCR:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)也是快速、經(jīng)濟(jì)、具有高分辨能力進(jìn)行無綠藻鑒定的手段之一。近期，Morandi等[32]運(yùn)用RAPD技術(shù)成功將意大利、巴西兩地分離出的49株無綠藻進(jìn)行種的分型。實(shí)驗(yàn)中，RAPD-PCR的重現(xiàn)性高于90%，使用的10個(gè)引物中，M13、OPA-4和OPA-18表現(xiàn)出清晰、可重復(fù)的擴(kuò)增能力較適合用于鑒定，這3個(gè)單引物的Simpson指數(shù)分別為0.94、0.92和0.85，三種引物聯(lián)合使用的Simpson指數(shù)為0.98。對于原核生物和真核生物，RAPD-PCR是十分實(shí)用的鑒定途徑[50]，和其他分子技術(shù)的聯(lián)合使用對于鑒定發(fā)現(xiàn)無綠藻新的基因型提供可能。⑤ISSR-PCR:ISSR (inter-simple sequence repeat)是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的新的標(biāo)記技術(shù)，簡便、穩(wěn)定，可以鑒定基因水平上更微小的差異。Morandi等[32]在RAPD-PCR基礎(chǔ)上，結(jié)合ISSR技術(shù)得到了42株中型無綠藻2型間的相似系數(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)同種間的分子水平差異。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無論是在理論上還是在設(shè)計(jì)上都十分簡單高效，很適合對蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子研究。1996年Holland等[51]首次報(bào)道運(yùn)用MALDI-TOF技術(shù)對微生物進(jìn)行鑒定。2012 年J.Murugaiyan等[52]應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)對290株臨床無綠藻菌株成功進(jìn)行鑒定，并發(fā)現(xiàn)中型無綠藻和P.blaschkeae在3-20kDa范圍內(nèi)顯示出特征性質(zhì)譜出現(xiàn)高峰。J.Murugaiyan等在傳統(tǒng)步驟上還使用了超聲處理以提高質(zhì)譜質(zhì)量，同時(shí)建立主要光譜庫 (main spectra library，MSP)將這種光譜圖的可重復(fù)性進(jìn)一步加強(qiáng)。

6 小 結(jié)

我國人口基數(shù)大、環(huán)境復(fù)雜，無綠藻病的實(shí)際發(fā)病率可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)，一方面是無綠藻病臨床癥狀缺乏特異性，另一方面對此菌的鑒定特征缺乏足夠認(rèn)識，導(dǎo)致目前無綠藻病的診斷率遠(yuǎn)低于實(shí)際感染率。隨著科技發(fā)展，技術(shù)提升，深入了解無綠藻的微生物學(xué)特性，全方位探索無綠藻的鑒定方法對于了解我國無綠藻得分布與感染在流行病學(xué)具有重要意義，也能提升我國在罕見真菌病中的診斷水平與國際地位。

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