白念珠菌ORF19.6012-MYC融合菌株的構建及鑒定

魯仁義 張曉龍 閻瀾 姜遠英

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

白念珠菌是最常見的機會致病真菌，當機體免疫功能正常時，與機體共生，而當機體免疫功能低下時，則會侵襲機體致病[1-2]。白念珠菌對機體的侵襲與其自身的生物學性質及多種毒力因子密切相關，例如菌絲形成、生物被膜形成以及粘附蛋白的合成及蛋白酶的分泌等[3-5]，這涉及到細胞內蛋白質功能的正常發(fā)揮以及復雜的信號轉導通路，大量的分子機制有待進一步研究闡明。其中，蛋白質水平的研究能夠直接闡明細胞內分子作用機制，因此也尤為重要。然而由于沒有抗白念珠菌蛋白質的成熟商業(yè)化抗體，若要進行蛋白質水平的研究，必須添加蛋白質標簽。因此，本研究構建蛋白質標簽融合菌株將為后續(xù)蛋白質水平研究奠定基礎。蛋白質標簽技術作為蛋白質功能研究的有力輔助手段，已經(jīng)被廣泛使用，本研究在前期研究基礎上選擇白念珠菌ORF19.6012為目標蛋白質，為進一步研究該蛋白的作用，利用同源重組的策略將MYC標簽添加于目標蛋白質C末端，構建ORF19.6012-MYC菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株和質粒 白念珠菌SN152 (基因型為arg4Δ/arg4Δleu2Δ/leu2Δhis1Δ/his1ΔURA3/ura3Δ::imm434IRO1/iro1Δ::imm434)，由Suzanne Nobel教授惠贈；含有13×MYC標簽和諾爾斯菌素 (nourseothricin, NAT)篩選標記的質粒pSR316-Myc由中國科學院巴斯德研究所陳昌斌教授惠贈；用于構建插入片段的質粒是pFA-Arg4，由Jurgen Wendland教授惠贈。

培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，三蒸水定容至1 L，高溫高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆?。RPMI 1640培養(yǎng)基：RPMI 1640 10 g，NaHCO32 g，嗎啉丙磺酸 (MOPS)34.5 g，調節(jié)pH至7.0，三蒸水定容至1 L，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩pider培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯10 g，甘露醇10 g，磷酸氫二鉀2 g，調節(jié)pH至7.2，三蒸水定容至1 L，高溫高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，調節(jié)pH至7.0，三蒸水定容至1 L，高溫高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑 限制性內切酶BamH I及SacI購自Thermo Fisher；In-Fusion試劑盒、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL10000購自Takara，YeaStar Genomic DNA kit購自Zymo research，氨芐西林、質粒小量抽提試劑盒購自生工生物，KOD-Plus購自東洋紡，Yeast Transformation System 2購于Clontech，諾爾斯菌素購自北京中誠瑾念，PVDF膜、Anti-Myc Tag Antibody (05-724)購自Millipore，Goat Anti-Mouse IgG (H&L) IRDye 800CW Conjugated Antibody購自Rockland。

儀器 ABI Veriti 96孔梯度PCR儀，震蕩破碎儀，多功能酶標儀，EOVS倒置顯微鏡，Oddessey近紅外成像系統(tǒng)。

1.2 方法

白念珠菌ORF19.6012-MYC融合菌的構建及鑒定 插入片段的構建。pFA-Arg4 (見圖1a)用BamH I及SacI雙酶切后，得到帶有Ampicillin抗性長度為2 466 bp的片段作為連接的載體 (Vector)；以SN152基因組DNA為模板，用引物1-F、1-R和3-F、3-R進行PCR得到ORF19.6012基因C末端片段1 (354 bp)及基因下游片段3 (323 bp)；以pSR316-Myc為模板，用引物2-F、2-R進行PCR得到帶有MYC標簽及NAT篩選標記片段2 (4 748 bp)。按照In-Fusion試劑盒操作說明，將三個片段 (1，2，3)及載體 (Vector)與In-Fusion HD Enzyme混合后于50℃孵育15 min，酶連完成后 (見圖1b)轉染至大腸桿菌中，涂布于Ampicillin平板上，待長出克隆后挑取單克隆提取質粒進行PCR驗證，并對陽性克隆進行測序驗證。

目的片段同源重組至基因組中。以驗證連接正確的質粒為模板，用引物In-Fusion-F、In-Fusion-R進行PCR得到大量含有MYC標簽和NAT篩選標記的目的片段。采用醋酸鋰轉染法將目的片段同源重組到白念珠菌SN152基因組中，使得MYC標簽序列添加于ORF19.6012基因ORF的C末端，涂布于諾爾斯菌素 (200 μg/mL)選擇性培養(yǎng)基，待長出克隆后挑取單克隆抽提基因組進行PCR驗證。

用于菌株構建及鑒定的引物序列見表1。

表1 本研究使用的引物及其序列

提取PCR驗證為陽性的單克隆蛋白質進行Western blotting (WB)驗證。提取白念珠菌總蛋白后，BCA定量法測定蛋白濃度，取100 μg總蛋白進行SDS-PAGE (80 V，30 min；120 V，1 h)，電泳結束后用半干法 (250 mA，1 h)將蛋白質轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗滌3次，4℃孵育Anti-Myc (1∶1 000)抗體過夜，在一抗孵育結束后，PBST洗滌3次，加入Anti-Mouse IgG (1∶10 000)二抗，室溫避光孵育2 h，PBST洗滌3次，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃膜拍照。

生長曲線 活化菌株，使真菌處于指數(shù)生長期后期，用PBS洗滌3次后以YPD培養(yǎng)液稀釋并調整菌液濃度至OD630=0.01各5 mL。30℃，200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30和36 h時間點取樣100 μL，用酶標儀測定OD630值，繪制菌株生長曲線。

菌絲誘導實驗 活化菌株，使真菌處于指數(shù)生長期后期，用PBS洗滌3次后以液體菌絲誘導培養(yǎng)基 (spider、RPMI 1640和YPD+10%FBS)重懸，以1∶1 000稀釋至1 mL相應的新鮮培養(yǎng)基中，置于12孔細胞培養(yǎng)板中37℃靜置培養(yǎng)3 h，培養(yǎng)結束后用顯微鏡觀察拍照。

2 結 果

2.1 白念珠菌ORF19.6012-MYC融合菌的構建及鑒定

三個PCR片段用In-Fusion試劑盒連接后轉化至感受態(tài)大腸桿菌，再以LB+Ampicillin (100 μg/mL)選擇培養(yǎng)基進行篩選，挑取單克隆菌落提取質粒作為模板，進行PCR驗證，結果顯示三個片段成功連接至載體質粒中 (見圖1c)。

將PCR獲得的融合目的片段轉染至白念珠菌SN152后 (見圖2a)，挑取諾爾斯菌素篩選平板上的單克隆，用試劑盒提取基因組DNA進行PCR驗證，結果顯示目的片段成功轉染至白念珠菌基因組內 (見圖2b)。

提取PCR驗證為陽性的白念珠菌的總蛋白，進行WB驗證，結果顯示： MYC蛋白標簽成功添加至白念珠菌內并穩(wěn)定表達，ORF19.6012蛋白大小為146 KD，添加于其C末端的13×MYC標簽大小為21 KD，所以融合蛋白的大小約為167 KD (見圖2c)。

2.2 生長曲線

圖1插入片段構建示意圖及PCR驗證結果:a.作為載體 (Vector)使用的pFA-Arg4質粒圖譜;b.In-Fusion策略連接三個插入片段示意圖;c.PCR驗證結果 (1是ORF19.6012基因C末端片段，3是ORF19.6012基因下游片段，2是含MYC標簽及SAT1篩選標記片段)圖2白念珠菌ORF19.6012-MYC菌株構建示意圖及驗證結果:a.ORF19.6012-MYC菌株構建及驗證引物設計示意圖;B.PCR驗證結果;C.Western blotting驗證結果

Fig.1The construction of the inserted fragment and PCR verification results:a.Map of pFA-Arg4 plasmid;b.Ligation of the three fragments by In-Fusion Kit;c.PCR verification results of the three fragments in the positiveE.colicolony (1 is the C-terminal fragment ofORF19.6012, 3 is the downstream fragment ofORF19.6012, 2 is the fragment containing MYC tag and SAT1 marker)Fig.2ORF19.6012-MYC strain construction and validation results:a.Schematic illustration of ORF19.6012-MYC strain construction and verification primers;b.PCR verification of the positiveC.albicansstrain;c.Western blotting verification result of the positiveC.albicansstrain

親本菌SN152以及ORF19.6012-MYC菌株時間生長曲線如圖3所示：ORF19.6012-MYC與親本菌SN152生長速度一致，說明添加MYC標簽后不會影響菌株正常的生長增殖能力。

2.3 菌絲誘導

親本菌SN152以及ORF19.6012-MYC菌株液體菌絲誘導的結果如圖4所示：SN152及ORF19.6012-MYC在spider、RPMI 1640以及YPD+10%FBS中均能正常形成菌絲，菌絲形成長度適中，且ORF19.6012-MYC菌絲生長情況與SN152相比并無差異，說明添加MYC標簽后不會影響菌株的液體菌絲形成能力。

圖3添加MYC標簽后不影響融合菌株的生長增殖圖4添加MYC標簽后不影響融合菌株液體菌絲形成能力

Fig.3Addition of MYC tag did not affect growth and proliferation of the strainFig.4Addition of MYC tag did not affect the hyphal formation ability of the strain

3 討 論

蛋白質標簽技術已廣泛應用于分子生物學領域，應用范圍包括蛋白質的純化和檢測、改變蛋白質溶解性、蛋白質細胞內定位等，常用的蛋白質標簽有MYC、HA、His×6、GST以及GFP等[6-7]；在此基礎上，可以利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀或者親和層析技術進一步進行蛋白質相互作用以及分子通路的研究[8]。

本研究中首先利用In-Fusion克隆方法將三個目的片段首尾相連并且連接于載體上，然后以連接正確的質粒為模板，PCR擴增得到大量插入片段，之后用醋酸鋰轉染法根據(jù)同源重組的原理將插入片段導入白念珠菌SN152中，使得MYC標簽添加于ORF19.6012的C末端，經(jīng)過諾爾斯菌素選擇性培養(yǎng)基的篩選后，最后經(jīng)過PCR以及Western blotting驗證確定得到蛋白質標簽插入正確的菌株。以親本菌SN152為對照，測定ORF19.6012-MYC融合菌株的生長曲線以及進行液體菌絲誘導實驗，考察MYC標簽的添加是否會影響菌株基本的生長繁殖以及形態(tài)轉換能力，結果顯示兩者之間無明顯差異。綜上所述，MYC標簽添加后，能夠連接于目的蛋白的C末端正常表達，并且不改變菌株的基本性質，所構建的菌株可以用于后續(xù)蛋白質功能的研究，能夠成為分子生物學功能研究的重要技術工具。

本研究利用In-Fusion策略構建標簽融合片段，成功構建了蛋白質標簽融合菌株，并提供了一種新的穩(wěn)定的構建標簽融合菌株的方法，可為類似研究提供參考和借鑒。

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