實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌病組織樣本中菌載量的研究

鄭艷青 史娜娜 曹存巍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021;2.南寧市第四人民醫(yī)院，南寧 530023;3.廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021)

馬爾尼菲籃狀菌病 (talaromycosis marneffei，TSM)在東南亞、我國南方，尤其是廣西、廣東具有區(qū)域性流行[1]，TSM好發(fā)于免疫受損患者[2]，尤其是AIDS患者，據(jù)統(tǒng)計(jì)廣西19%的AIDS患者合并T.marneffei感染，是僅次于結(jié)核的第二大機(jī)會(huì)性感染[3]。值得注意的是，近年來TSM在未合并基礎(chǔ)疾病，細(xì)胞免疫功能未見異常的人群中發(fā)病數(shù)逐漸增多[4]。TSM病情隱匿，臨床表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜，缺乏特征性，容易誤診和漏診，若不早期診斷和及時(shí)治療死亡率高 (超過80%)[5]。本研究組前期應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)出具有高度特異性的T.marneffei引物和Taqman探針，建立了穩(wěn)定、高度特異、敏感、快速的檢測(cè)體系。在初步臨床檢測(cè)中，55例首次采集的血清樣本首次qPCR檢測(cè)呈陽性，與真菌培養(yǎng)結(jié)果一致性高達(dá)100%，耗時(shí)比真菌培養(yǎng)確診提前5～14 d，此方法有助于快速、特異性診斷TSM[6]。本研究基于前期研究結(jié)果，將臨床樣本擴(kuò)展到病理切片、活檢組織，期望從不同的臨床樣本中收集T.marneffei感染證據(jù)，為TSM的快速確診提供堅(jiān)實(shí)、可靠的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2017年1～6月期間，收集首次就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的5名HIV陰性TSM患者樣本，包括肩部、臀部、前額、手背病理切片樣本共5例，淋巴結(jié)活檢組織樣本1例?；颊呋厩闆r見表1。

1.2 方法

表1 TSM患者基本信息和臨床表現(xiàn)

注：/.無合并癥

1.2 方法

病理組織切片總DNA提取 將石蠟包埋的病理組織，切3～5薄片放入2 mL離心管中。加入1 200 μL二甲苯，渦旋震蕩，20 000 g離心5 min，移去上清。往沉淀加1 200 μL無水乙醇，輕柔地震蕩。20 000 g離心5 min，移去上清。重復(fù)用無水乙醇清洗1次。37℃開蓋孵育10～15 min，直到酒精蒸發(fā)干凈。加入180 μL的ATL緩沖液。按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒說明書提取組織總DNA。

淋巴結(jié)組織總DNA提取 取疑似TSM患者病變淋巴結(jié)，于生物安全柜中研磨破碎組織，用200 μL Buffer ATL重懸，將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒說明書提取組織總DNA。

qPCR擴(kuò)增[6]引物和Taqman探針序列：見表2。

Real-time PCR反應(yīng)體系：2×Taqman universal PCR master mix 10 μL、5 μmol/L上下游引物和探針各1 μL，模板1～5 μL，無菌三蒸水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增體系：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 1 min運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。設(shè)置已知濃度T.marneffeiDNA做陽性對(duì)照，白念珠菌DNA為陰性對(duì)照，反應(yīng)終點(diǎn)讀取達(dá)閾值熒光量的循環(huán)數(shù)

表2 qPCR 引物和探針序列

(Cq)。

2 結(jié) 果

上述實(shí)驗(yàn)操作至讀取結(jié)果所需時(shí)間為3～4 h。如表3所示，皮膚病理切片、淋巴結(jié)活檢組織qPCR檢測(cè)結(jié)果陽性。淋巴結(jié)活檢組織馬爾尼菲籃狀菌載量4.68×105copies，病理石蠟切片平均菌載量3.01×104copies (1.07×104～7.26×104copies)。

3 討 論

T.marneffei主要侵犯人體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，可引起局限性感染和全身播散性感染，不同器官受累出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)，主要以發(fā)熱，貧血，淺表及深部淋巴結(jié)腫大，肝臟和脾臟腫大，皮膚黏膜損害、溶骨性損害、呼吸道癥狀等為主，缺乏特異性[7]，導(dǎo)致TSM患者難以確診，耽誤早期治療。鄧卓霖等[8]報(bào)道TSM的病理改變與患者免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫力強(qiáng)的患者病變局限，T.marneffei較少，表現(xiàn)為慢性肉芽腫炎；具有一定免疫力的患者，表現(xiàn)為化膿性炎；而免疫功能低下的患者，病變組織中無或極少淋巴細(xì)胞存在，布滿大量T.marneffei，表現(xiàn)為無反應(yīng)性壞死性炎癥，TSM患者臨床表現(xiàn)個(gè)體差異大，尤其是免疫功能未見異常的患者，其臨床表現(xiàn)不明顯，容易漏診、誤診。

表3TSM不同組織樣本中T.marneffei菌載量

Tab.3Loads ofTalaromycesmarneffeiin different samples of TSM cases

編號(hào)標(biāo)本來源Cq值總菌載量(copies)1左肩病理切片37．351．15×104右臂病理切片35．384．48×1042右上臀病理切片34．687．26×1043前額病理切片37．411．09×1044手背病理切片37．431．07×1045淋巴結(jié)活檢組織31．964．68×105

目前，臨床上診斷TSM以血標(biāo)本、骨髓、痰液、活檢組織等無菌樣本的真菌涂片和培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測(cè)作為輔助診斷。TSM臨床特點(diǎn)和病理學(xué)特征與結(jié)核分枝桿菌、莢膜組織胞漿菌感染非常相似，難于辨別[8-9]，T.marneffei與莢膜組織胞漿菌在感染組織中的大小、形態(tài)相似，染色相同，需要進(jìn)行真菌培養(yǎng)才能鑒別。但是，真菌培養(yǎng)耗時(shí)長 (4～7 d)，不能滿足臨床快速診斷、早期治療的迫切需求[10]。

血清半乳甘露聚糖 (GM)試驗(yàn)作為TSM病廣泛的輔助診斷，具有便捷、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，GM試驗(yàn)對(duì)PSM患者總體敏感度為78.38%，特異度為82.98%，但多種影響因素均可導(dǎo)致GM試驗(yàn)出現(xiàn)假陽性[11]。而T.marneffei未釋放入血或釋放入血后被迅速清除則會(huì)使GM試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏診、誤診的情況。本研究旨在運(yùn)用多種檢測(cè)手段，從不同臨床樣本中收集T.marneffei感染證據(jù)，為臨床診斷提供依據(jù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為病原分子生物學(xué)研究的重要工具，qPCR已經(jīng)有效地運(yùn)用在結(jié)核分枝桿、HCV、HIV、曲霉菌等病原微生物的診斷[12]。實(shí)驗(yàn)組前期首次建立了qPCR診斷TSM的方法體系，該方法特異性為100%，靈敏度高，最低檢測(cè)限 (LOD)達(dá)到5～10拷貝數(shù)/反應(yīng)。并在前期初步運(yùn)用于臨床血清標(biāo)本的檢測(cè)，患者首次采集的血清檢測(cè)結(jié)果比真菌培養(yǎng)確診提前了5～14 d，并且能夠同時(shí)檢測(cè)活菌或者死菌，甚至是游離在在血清中T.marneffei的基因組DNA[6]。

Tsunemi等[13]首次在1例患者皮膚活檢組織中擴(kuò)增出T.marneffei。Hanxiang Zeng等[14]運(yùn)用巢式PCR成功檢測(cè)出患者皮膚、肺組織石蠟切片中的T.marneffei。本實(shí)驗(yàn)收集TSM患者皮損病理切片或病變淋巴結(jié)組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，準(zhǔn)確地檢測(cè)出皮損切片和淋巴結(jié)活檢組織中T.marneffei載量，本實(shí)驗(yàn)方法具有快速、精確、定量、操作密閉性好的特點(diǎn)，直接檢測(cè)樣本中原始的菌載量，可直觀反應(yīng)病變組織遭受侵襲的嚴(yán)重程度。

有研究表明，TSM患者組織T.marneffei培養(yǎng)陽性率依次為：骨髓和淋巴結(jié) (100%)、皮疹組織 (90%)、血液 (76%)。并且皮疹組織及皮疹分泌物培養(yǎng)出T.marneffei的時(shí)間比血液、骨髓、痰液時(shí)間更短[15。由此可見，皮疹在診斷T.marneffei感染方面有陽性率高、用時(shí)短的特點(diǎn)。病變組織是病原菌集中的地方，相比血液更容易檢測(cè)到病原菌，適合用于早期分子診斷，為臨床診斷提供強(qiáng)有力的證據(jù)。本研究成功運(yùn)用qPCR檢測(cè)到皮損切片中的T.marneffei載量，但是制作病理切片耗時(shí)長，工序復(fù)雜，不能滿足臨床快速診斷的迫切需求。繼而本研究收集1例TSM患者淋巴結(jié)，直接提取組織DNA，qPCR檢測(cè)呈陽性，T.marneffei載量高達(dá)4.68×105copies。結(jié)合國內(nèi)外研究，qPCR直接測(cè)定活檢組織中的菌載量可作為快速診斷TSM的重要方法。課題組將進(jìn)一步對(duì)患者皮膚、淋巴、肺等活檢組織進(jìn)行研究，為臨床診斷TSM提供更多、更可靠的證據(jù)，為早期治療TSM爭取時(shí)間。

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