基于核及葉綠體基因序列探討中國綠水螅共生單細(xì)胞綠藻系統(tǒng)發(fā)生地位

陳磊磊 劉俊紅 李全發(fā) 董文芳 張 行 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點實驗室, 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室, 蕪湖 241000)

基于核及葉綠體基因序列探討中國綠水螅共生單細(xì)胞綠藻系統(tǒng)發(fā)生地位

陳磊磊 劉俊紅 李全發(fā) 董文芳 張 行 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點實驗室, 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室, 蕪湖 241000)

研究對中國綠水螅共生綠藻的核18S rRNA基因全長序列及其葉綠體9個基因(atpA、chlB、chlN、petA、psaB、psbA、psbC、psbD及rbcL)片段序列進(jìn)行了克隆和測序, 并基于18S rRNA基因序列及葉綠體9個基因序列的整合數(shù)據(jù)分別通過最大似然法(Maximum-likelihood)和貝葉斯分析(Bayesian inference)對中國綠水螅(Hydra sinensis)共生單細(xì)胞綠藻的系統(tǒng)發(fā)生地位進(jìn)行了探討。系統(tǒng)發(fā)生表明: (1)中國綠水螅共生綠藻屬于共球藻綱(Trebouxiophyceae)小球藻目(Chlorellales), 但不屬于其中的小球藻屬(Chlorella); (2)來源于草履蟲、水螅、地衣及銀杏的共生綠藻均在共球藻綱支系, 而來源于蛙類和蠑螈的共生綠藻屬于綠藻綱(Chlorophyceae)支系。無論在共球藻綱支系還是在綠藻綱支系, 不同來源的共生藻并沒有排他性地聚為單系群而在系統(tǒng)樹中與其他自由生活的綠藻混雜排列, 來自不同宿主的共生綠藻沒有共同起源。

中國綠水螅; 共生單細(xì)胞綠藻; 系統(tǒng)發(fā)生; 核18S rRNA基因; 葉綠體基因

絕大多數(shù)動物通過攝食微生物、植物或其他動物而獲得能量, 但一些動物卻與單細(xì)胞真核綠藻建立共生關(guān)系而獲得能量補(bǔ)充[1—5], 即動物宿主細(xì)胞內(nèi)共生一定數(shù)量的綠藻個體, 宿主為藻類提供CO2、含氮物質(zhì)、礦物質(zhì)、水及庇護(hù)所, 而綠藻利用光合作用為宿主提供碳水化合物、氨基酸和其他有機(jī)物營養(yǎng)[6,7]。這種共生關(guān)系是相互制約(1個動物細(xì)胞內(nèi)的綠藻數(shù)量是有限度的, 同時宿主細(xì)胞又不傷害藻類)和互利互惠的, 其生物學(xué)意義非常明顯[8—10], 但該類共生體的起源誘因和進(jìn)化驅(qū)動、起源時間及進(jìn)化機(jī)制目前仍未闡明。

到目前為止已發(fā)現(xiàn)6個類群的動物與單細(xì)胞真核綠藻發(fā)生共生關(guān)系: 原生動物門纖毛綱中的草履蟲、小瓜子蟲及聚縮蟲等類群中均有與單細(xì)胞綠藻共生的物種[11—15]; 許多海綿動物體內(nèi)多種類型的細(xì)胞內(nèi)有綠藻共生[16,17]; 刺胞動物門的綠水螅體內(nèi)僅在內(nèi)胚層皮肌細(xì)胞中有綠藻共生[18,19], 而其他細(xì)胞內(nèi)均無共生綠藻分布; 扁形動物門的綠渦蟲(Castrada,Dalyelfia,Plwellocora和Typhloplana等屬)身體微小(體長小于3 mm), 共生綠藻在其各處組織細(xì)胞中均有分布[20]; 軟體動物門瓣鰓綱的一些物種的鰓組織和外套膜組織細(xì)胞內(nèi)有單細(xì)胞綠藻共生其中[21]; 脊索動物門兩棲綱的一些蠑螈和蛙類的卵膜和早期胚胎中分布有單細(xì)胞共生綠藻[22]。

在動物細(xì)胞和綠藻的共生關(guān)系中, 動物細(xì)胞為宿主, 共生綠藻在進(jìn)化上是后來進(jìn)入動物細(xì)胞的[11],因此共生綠藻起源和進(jìn)化機(jī)制的相關(guān)研究可能有助于動物-綠藻共生體起源機(jī)制的探討。鑒于自由生活的單細(xì)胞綠藻高度多樣性和傳統(tǒng)分類學(xué)上的復(fù)雜性和低區(qū)分度、GenBank上自由生活的單細(xì)胞綠藻分子數(shù)據(jù)豐富以及共生綠藻最早來源于自由生活的單細(xì)胞綠藻這3個前提, 基于分子數(shù)據(jù)研究共生綠藻的起源和進(jìn)化在當(dāng)前可能不失為一種較為實際和行之有效的選擇。中國綠水螅(Hydra sine-nsis)體內(nèi)共生的單細(xì)胞綠藻尚未鑒定和定種[19,23],因此本研究通過核及葉綠體基因標(biāo)記對中國綠水螅共生綠藻的系統(tǒng)發(fā)生地位進(jìn)行了探討, 為中國綠水螅共生綠藻的確切定種提供線索和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料中國綠水螅(Hydra sinensis)(圖1)采集于廣東省惠州市東江流域, 從野外采集的水?；铙w標(biāo)本中選取3只個體單獨培養(yǎng), 據(jù)此建立3個中國綠水螅單克隆無性繁殖系(分別命名為DJR1、DJR2及DJR3, 原種采集地經(jīng)緯度分別為113°9′E,23°09′N; 114°45′E, 23°13′N; 115°25′E, 24°11′N)。每天用豐年蟲(Artemiasp.)幼蟲喂食水螅1次, 喂食后及時更換培養(yǎng)液。水螅培養(yǎng)液由冷卻后充氧的一蒸水配制(配方為: 1 mmol/L NaCl, 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgSO4, 1 mmol/L Tris, pH 7.4)。中國綠水螅單克隆無性繁殖系長期保持在培養(yǎng)條件穩(wěn)定的光照培養(yǎng)箱內(nèi)[溫度(25±0.5)℃, 光照度2000 lx, 光周期亮暗比12h∶12h]。

1.2 共生綠藻的分離和純化

圖1 中國綠水螅及其共生綠藻Fig. 1 Hydra sinensis and its symbiotic green algae

在Mcauley方法[24]基礎(chǔ)上稍作修改從中國綠水螅中分離和純化共生綠藻。具體步驟如下: (1)活體水螅用去離子水洗3遍后, 在1 mL去離子水中勻漿,500 r/min速度離心5min; (2)丟棄上清, 沉淀用0.5%SDS重懸, 500 r/min速度離心5min; (3)丟棄上清, 沉淀用0.5% SDS重懸, 2500 r/min速度離心5min;(4)丟棄上清, 沉淀用去離子水重懸, 2500 r/min速度離心5min; (5)收集綠藻沉淀備用。

1.3 共生綠藻總DNA的抽提

把適量的綠藻移入1.5 mL Eppendorf管中,加入800 μL在65℃水浴預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol/L EDTA-2Na, 1.4 mol/L NaCl, 2% CTAB, 使用前加入0.1%(v/v)的β-巰基乙醇)并混勻, 每隔5min輕輕震蕩幾次, 20min后12000 r/min室溫離心15min; 小心吸取上清液, 加入800 μL酚: 氯仿(體積比1∶1)溶液, 混勻; 12000 r/min 4℃離心10min; 小心吸取上清液,加入800 μL氯仿, 混勻, 12000 r/min 4℃離心10min;取上清, –20℃沉淀1h后, 12000 r/min 4℃離心10min; 棄去上清液, 用70%乙醇洗滌沉淀2次。沉淀用冷凍干燥機(jī)干燥后溶于50 μL去離子水中,–40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 共生綠藻核18S rRNA基因及葉綠體基因的克隆和測序

通過對單細(xì)胞綠藻核18S rRNA基因及葉綠體基因相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 篩選這些基因的序列保守性區(qū)段, 據(jù)此設(shè)計了一系列引物用于中國綠水螅共生綠藻核18S rRNA基因及葉綠體基因的PCR擴(kuò)增及測序(表1)。本實驗所有PCR反應(yīng)的總反應(yīng)體積均為50 μL, 其中含10×buffer 5.0 μL,25 mmol/L MgCl26.0 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,TaqDNA聚合酶1.2 μL(TaKaRa, 5 U/μL), DNA模板6 ng, 使用滅菌去離子水將反應(yīng)總體積補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)體系在94℃預(yù)變性5min, 然后進(jìn)入如下循環(huán): 94℃變性30s, 45℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)次數(shù)為35, 循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測。PCR產(chǎn)物首先經(jīng)切膠純化后與pMD18-T克隆載體連接, 連接液轉(zhuǎn)化E.coliJM109菌株。菌落PCR方法篩選陽性克隆, 陽性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

將測序得到的中國綠水螅共生綠藻核18S rRNA基因及葉綠體基因核酸序列在NCBI網(wǎng)站分別進(jìn)行核酸序列BLAST在線分析, 獲得相應(yīng)的同源序列;再將共生綠藻核18S rRNA基因及葉綠體基因核酸序列分別與其同源核酸序列數(shù)據(jù)通過Clustal 1.8軟件進(jìn)行比對。

表1 本文所用引物序列Tab. 1 Sequences of primers used in the present study

基于核18S rRNA基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析時, 內(nèi)群包括不同來源的共生綠藻的26個同源序列、共球藻綱(Trebouxiophyceae)的12個同源序列及綠藻綱(Chlorophyceae)的15個同源序列,外群為來自石莼綱(Ulvophyceae)的1個同源序列。使用Modeltest 3.7檢驗序列數(shù)據(jù)并選擇合適的建樹參數(shù)模型[25]。通過PAUP 4.0b10軟件[26], 基于HKY+G模型用最大似然法(Maximum-likelihood, ML)重建分子系統(tǒng)發(fā)生樹。ML系統(tǒng)發(fā)生樹中各節(jié)點的置信度由全部運(yùn)算1000次自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗。另外,使用MrBayes 3.2.3軟件[27], 基于HKY+G模型并同時啟動4條馬爾可夫鏈(包括冷鏈1條, 熱鏈3條)。以隨機(jī)樹為起始樹, 運(yùn)行3×106代, 每100代對系統(tǒng)樹進(jìn)行重新取樣構(gòu)建貝葉斯樹(Bayesian inference tree, BI), 系統(tǒng)發(fā)生樹各節(jié)點的置信度通過后驗概率(Posterior probability, PP)檢測。

把9個葉綠體基因核酸序列串聯(lián)成整合數(shù)據(jù)用于分子系統(tǒng)發(fā)生分析, 串聯(lián)順序為:atpA-chlB-chlN-petA-psaB-psbA-psbC-psbD-rbcL?；?個葉綠體基因核酸序列整合數(shù)據(jù)進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析時, 內(nèi)群為3個中國綠水螅單克隆無性繁殖系共生綠藻各自的葉綠體9個基因核酸序列整合數(shù)據(jù)及共球藻綱33個物種葉綠體的同源序列, 外群為銀杏(Ginkgo biloba)葉綠體的同源序列。在基于9個葉綠體基因核酸序列整合數(shù)據(jù)重建系統(tǒng)發(fā)生樹前,首先采用modeltest 3.7計算出每個基因的最適模型[25]。通過PAUP 4.0b10軟件[26], 分別設(shè)置每個基因的最適模型后重建ML樹。使用MrBayes 3.2.3軟件[27], 亦分別設(shè)置每個基因的最適模型后重建BI樹,運(yùn)算時馬爾可夫鏈運(yùn)行了5×106代。

2 結(jié)果

2.1 共生綠藻核18S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)生分析

中國綠水螅3個單克隆無性繁殖系的共生綠藻核18S rRNA基因序列數(shù)據(jù)已提交GenBank(表2),把它們與其他51個同源序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對后共有2076個堿基位點, 其中891個變異位點和585個簡約信息位點(Parsimony informative site)?；?8S rRNA基因序列重建的ML樹和BI樹(圖2)表明,共球藻綱自由生活的綠藻物種與來源于草履蟲、水螅、地衣及銀杏的共生綠藻聚成一單系群, 而綠藻綱自由生活的綠藻物種與來源于蛙類和蠑螈的共生綠藻聚成另外一個單系群。中國綠水螅共生綠藻的3個18S rRNA基因序列位于共球藻綱單系群內(nèi)部, 并且在共球藻綱單系群中水螅共生綠藻、草履蟲共生綠藻、銀杏共生綠藻及地衣共生綠藻與自由生活的綠藻物種混雜排列, 即這些來源不同的共生綠藻并沒有聚成一單系支。其中, 來自不同地區(qū)的綠水螅共生綠藻分為4個小支系, 而這4個小支系分別位于共球藻綱支系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同位置, 被自由生活的綠藻物種隔開而沒有聚成單系支(圖2)。另外, 綠藻綱支系中來自兩棲綱動物的共生藻也沒有聚成單獨一支, 而是與綠藻綱的一些自由生活的綠藻物種混雜排列(圖2)。

2.2 共生綠藻葉綠體9個蛋白質(zhì)編碼基因序列及系統(tǒng)發(fā)生分析

中國綠水螅3個單克隆無性繁殖系的共生綠藻葉綠體9個蛋白質(zhì)編碼基因序列數(shù)據(jù)已提交Gen-Bank(表2)。中國綠水螅共生綠藻葉綠體9個基因核酸序列串聯(lián)整合數(shù)據(jù)與其他34個物種葉綠體同源序列比對后序列總長度為10106個核苷酸位點,其中有5449個變異位點和4533個信息簡約位點?；谌~綠體9個基因核酸序列串聯(lián)整合數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明(圖3), 中國綠水螅3個單克隆無性繁殖系的共生綠藻位于共球藻綱的小球藻目(Chlorellales)單系群內(nèi)部。中國綠水螅共生綠藻與類小球藻屬(Parachlorella)及雙月藻屬(Dicloster)組成的單系群聚為一支, 而沒有直接與小球藻屬(Chlorella)相聚(圖3)。

表2 本文測定的基因序列Tab. 2 Gene sequences determinated in the present study

3 討論

目前把在真核生物細(xì)胞內(nèi)共生的單細(xì)胞綠藻暫歸類于球狀綠藻類群(Coccoid green algae)[28,29]。而目前許多證據(jù)表明球狀綠藻類群可能僅是一個龐雜的形態(tài)學(xué)類群(Morphological group), 而非有共同起源的自然類群(Natural group)[30]。這首先源于球狀綠藻類群中的絕大多數(shù)物種進(jìn)行無性繁殖、而未見有性生殖, 因而在這個類群通過雜交實驗利用生殖隔離原理區(qū)分其中不同的生物學(xué)物種難以實現(xiàn); 其次球狀綠藻類群形態(tài)學(xué)特征在不同物種之間的低區(qū)分度更增加了該類群基于形態(tài)學(xué)特征分類實踐的難度[30]。幸好分子數(shù)據(jù)的介入在一定程度上為厘清球狀綠藻類群分類體系起到了至關(guān)重要的作用, 基于分子數(shù)據(jù)的分析表明球狀綠藻類群除了主要涉及綠藻門共球藻綱、綠藻綱及蔥綠藻綱(Prasinophyceae)中的部分物種外, 還涉及輪藻門(Charophyta)綠疊球藻綱(Chlorokybophyceae)和雙星藻綱(Zygnemophyceae)中的少數(shù)物種[31—33]。

為探討中國綠水螅共生綠藻系統(tǒng)發(fā)生地位, 我們搜集了GenBank中所有不同來源的共生單細(xì)胞綠藻的18S rRNA基因序列, 對這些序列進(jìn)行初步分析后發(fā)現(xiàn)它們與綠藻門共球藻綱或綠藻綱物種同源序列的相似性較高?；诖? 本研究在共球藻綱和綠藻綱中分別選擇了一些自由生活的單細(xì)胞綠藻的18S rRNA基因序列與中國綠水螅共生綠藻及不同來源的共生單細(xì)胞綠藻的同源基因序列一起進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析(圖2)。結(jié)果表明, 共球藻綱自由生活的綠藻物種與來源于草履蟲、水螅、地衣及銀杏的共生綠藻聚成一單系群, 而綠藻綱自由生活的綠藻物種與來源于蛙類和蠑螈的共生綠藻聚成另外一個單系群。無論在共球藻綱支系還是在綠藻綱支系, 不同來源的共生藻并沒有排他性地聚為單系群、而在系統(tǒng)樹中與其他自由生活的綠藻混雜排列, 來自不同宿主的共生綠藻沒有共同起源(圖2)。

這個特殊的進(jìn)化現(xiàn)象可能源于以下2種假設(shè)的其中之一: 第一種假設(shè)是單細(xì)胞綠藻一開始可能全部為自由生活的種類, 而這個類群的進(jìn)化和演變肯定遵循普遍的進(jìn)化規(guī)律?？赡苁撬拗?稱潛在宿主最為合適)以單細(xì)胞綠藻為食、或在攝食時綠藻經(jīng)?；烊胧澄?、或綠藻在潛在宿主體表長期外共生、或綠藻與潛在宿主長期共棲等諸多特殊因素最終導(dǎo)致了綠藻與宿主的內(nèi)共生關(guān)系。而內(nèi)共生關(guān)系建立前綠藻和潛在宿主的關(guān)系是非常隨機(jī)的,源于綠藻的多樣性以及潛在宿主的多樣性; 而內(nèi)共生關(guān)系一旦建立, 共生綠藻和宿主的關(guān)系又是高度專一的, 因為某個宿主體內(nèi)的共生綠藻自然轉(zhuǎn)移到其他宿主體內(nèi)的可能性非常低。簡言之, 好比單細(xì)胞綠藻進(jìn)化路線網(wǎng)是一棵盤根錯節(jié)的大樹, 綠藻-宿主共生關(guān)系是在不同的末端樹葉上發(fā)生的。也就是說, 在一定意義上講探尋不同的綠藻-宿主共生體共生綠藻的共同起源相關(guān)命題的本身就是不可能有結(jié)果的悖論。第二種假設(shè)是同一類型宿主的共生綠藻可能有一個共同起源, 但共生綠藻可能從宿主細(xì)胞“逃逸”出來重新回到自然界發(fā)展為自由生活的單細(xì)胞綠藻[34,35]。上述2個假設(shè)無論哪個是真的, 結(jié)果都一樣, 就是共生單細(xì)胞綠藻和自由生活的單細(xì)胞綠藻在系統(tǒng)發(fā)生樹上混雜排列。

圖3 基于9個葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因聯(lián)合序列數(shù)據(jù)重建的共球藻綱ML樹及BI樹Fig. 3 Maximum likelihood tree and Bayesian inference tree of Class Trebouxiophyceae based on the combined sequences of nine chloroplast protein-coding genes

以往的研究把一些無脊椎動物體內(nèi)的共生綠藻放在小球藻屬(Chlorella)[36,37]。本研究基于葉綠體9個基因核酸序列串聯(lián)整合數(shù)據(jù)重建的共球藻綱系統(tǒng)樹顯示中國綠水螅共生綠藻位于小球藻目支系(圖3), 但中國綠水螅共生綠藻與該目的小球藻屬物種沒有直接相聚。無獨有偶, 基于18S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹也表明中國綠水螅共生綠藻與小球藻屬也沒有直接相聚(圖2)?？磥? 中國綠水螅共生綠藻的確切定種還有待綜合分子系統(tǒng)學(xué)、形態(tài)學(xué)及生理生態(tài)學(xué)等多方面證據(jù)綜合考慮。

致謝:

感謝深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院汪安泰先生協(xié)助采集實驗材料。

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THE SIGNIFICANCE OF PHYLOGENETIC OF UNICELLULAR GREEN ALGAE ENDOSYMBIOTIC IN HYDRA SINENSIS INFERRED FROM NUCLEAR AND CHLOROPLAST GENE SEQUENCES

CHEN Lei-Lei, LIU Jun-Hong, LI Quan-Fa, DONG Wen-Fang, ZHANG Hang and PAN Hong-Chun
(Provincial Key Laboratory of the Conservation and Exploitation of Biological Resources in Anhui, Provincial Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

In the fields of evolutionary ecology, evolutionary biology and cell biology, symbiosis betweenHydra sinensisand single-celled green algae is a special biological phenomenon with high scientific value. Although the biological significance of hydra-algea has been understood, its origin and evolutionary mechanism are still unclear by now. In the hydra-algae symbiosis status, free living algae goes into its host cell during evolution, so the study on the origin of symbiotic algae can help understand the mechanism of hydra-algae symbiosis. In this study, 18S rRNA gene sequences in nucleolus and nine protein-coding genes (atpA,chlB,chlN,petA,psaB,psbA,psbC,psbD andrbcL) in chloroplast were cloned and sequenced from the symbiotic green algae inH. sinensis. With the application of Maximum Likelihood (ML) and Bayesian analysis methods, the significance of phylogenetic of the unicellular green algae endosymbiotic inH. sinensiswas examined. The results show that the endosymbiotic green alga are belong to Chlorellales, Trebouxiophyceae, instead of Chlorellal; the green alga in paramecium, hydra, lichen and ginkgo are belong to Trebouxiophyceae, whereas others from frog and salamander are in Chlorophyceae. However, these two groups of endosymbiotic alga could live in the same host without forming a monophyletic group. In addition, endosymbiotic alga from different host cells have different origins.

Hydra sinensis; Symbiotic unicellular green algae; Phylogeny; Nuclear 18S rRNA gene; Chloroplast gene

Q959.131; Q949.2

A

1000-3207(2017)06-1265-08

2016-09-05;

2017-04-10

國家自然科學(xué)基金(31370406和31671529)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370406,31671529)]

陳磊磊(1991—), 男, 安徽蚌埠人; 碩士研究生; 主要研究方向為動物分子生物學(xué)。E-mail: chenleileiwjc@sina.com

潘紅春(1969—), 男, 教授; 主要研究方向為水螅發(fā)育與共生的細(xì)胞及分子機(jī)理。E-mail: panhongchun@126.com

10.7541/2016.157