PD-L1對細(xì)菌膿毒癥免疫抑制的影響及其機制*

王 方， 楊沐雨， 王 斌， 曲震理， 胡清茹

(1. 南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 南陽 473000； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 鄭州 450000)

膿毒癥是由宿主抗感染免疫失調(diào)引起的嚴(yán)重危及生命的多器官功能障礙[1]。雖然病理研究和臨床治療已取得重要進(jìn)步，但膿毒癥的發(fā)病率和死亡率依舊保持高位，究其原因在于其生理病理過程和機制的復(fù)雜性。對細(xì)菌膿毒癥的病原研究普遍認(rèn)為，細(xì)菌毒素所引起的免疫抑制是細(xì)菌膿毒癥發(fā)病率高和死亡率高的重要因素[2，3]。革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素成分脂多糖(lipopoiysaccharide, LPS)是細(xì)菌膿毒癥最重要的啟動因子，早期LPS誘發(fā)過度炎癥反應(yīng)引起免疫抑制甚至嚴(yán)重的預(yù)后不良。但有關(guān)LPS誘導(dǎo)細(xì)菌膿毒癥的關(guān)鍵分子和信號機制研究目前存在較大空白，因此細(xì)菌膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的免疫抑制機制研究，是急危重癥醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的緊要項目。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是機體能力最強的抗原提呈細(xì)胞，通過免疫共抑制分子特異性識別T淋巴細(xì)胞等參與免疫抑制反應(yīng)。程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)是樹突狀細(xì)胞表面最重要共抑制分子，能夠與T淋巴細(xì)胞表面受體程序性細(xì)胞死亡受體-1 (programmed cell death 1，PD1)結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡等發(fā)揮免疫抑制作用，是新近免疫學(xué)研究熱點。有研究報道DCs的抗原提呈能力和T淋巴細(xì)胞增殖活化與膿毒癥后期免疫抑制和臨床預(yù)后不良有關(guān)[4-6]。膿毒癥時PD-L1的表達(dá)水平與T細(xì)胞增殖抑制、凋亡或失能和器官功能障礙有相關(guān)性[7]。PD-L1表達(dá)上調(diào)與膿毒癥繼發(fā)院內(nèi)感染和高死亡率密切相關(guān)[8]。因此探究在細(xì)菌膿毒癥中DCs的功能及PD-L1的表達(dá)相關(guān)機制，發(fā)掘防治新靶點，對細(xì)菌膿毒癥的免疫抑制研究具有重要意義。

磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶B (phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要作用[9，10]。PI3K磷酸化激活后，直接活化下游靶蛋白AKT。AKT可激活NF-κB抑制蛋白IκB的激酶 (IKKα)導(dǎo)致IκB磷酸化降解，并激活釋放NF-κB核轉(zhuǎn)位，激活靶基因調(diào)控免疫分子的表達(dá)。PI3K/ AKT信號通路在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用，激活該信號通路后可促進(jìn)炎癥相關(guān)蛋白NF- κB的表達(dá)增加[11]。因此明確PI3K/AKT信號通路在細(xì)菌膿毒癥中的作用及調(diào)節(jié)機制，有助于精準(zhǔn)評估免疫狀態(tài)，具有重要臨床價值[12]。本研究以細(xì)菌內(nèi)毒素LPS刺激髓系DCs模擬細(xì)菌膿毒癥免疫抑制，探討LPS對DCs表面共抑制分子PD-L1表達(dá)和免疫功能的影響及其可能調(diào)控機制，為臨床細(xì)菌膿毒癥所致免疫抑制的治療提供理論依據(jù)和候選治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6(H-2Kb)近交系4-6周齡雌性小鼠購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心。重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白介素-4(rmIL-4)購自美國Peprotech公司。PI3K抑制劑LY294002、NF-κB抑制劑PDTC購自上海碧云天生物科技公司。PE-PD-L1單抗、PE-p-P65單抗、FITC-p-PI3K、FITC-p-AKT單抗及同型對照抗體購自美國eBioscience公司。BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒和小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒購自成都達(dá)科為公司。

1.2 樹突狀細(xì)胞的常規(guī)誘導(dǎo)和免疫抑制刺激方法

根據(jù)文獻(xiàn)報道[9,13，14]小鼠骨髓來源單核細(xì)胞密度約為1×106cells/ml，用含rmGM-CSF(10 ng/ml)和rmIL-4(1 ng/ml)的10%胎牛血清1640培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)4 d。以10 ng/ml LPS處理DCs靜置12 h獲得PD-L1高表達(dá)的DCs作為免疫抑制刺激細(xì)胞。實驗分組：Con組、LPS組、LY294002+LPS組、PDTC+LPS組和LPS+αPD-L1組。Con組加磷酸鹽緩沖液(PBS)，LPS組加LPS(10 ng/ml)作用12 h，LY294002 +LPS組、PDTC+LPS組分別先加抑制劑LY294002(10 μmol/L)、PDTC (20 μmol/L)作用1 h再加LPS作用12 h，LPS+αPD-L1組先加LPS作用12 h再加PD-L1封閉抗體作用30 min。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測樹突狀細(xì)胞PD-L1表達(dá)

按照1.2方法常規(guī)誘導(dǎo)，Con組加PBS，LPS組加LPS(10 ng/ml)作用12 h，LY294002+ LPS組、PDTC+LPS組分別先加抑制劑LY294002(10 μmol/L)、PDTC (20 μmol/L)作用1 h再加LPS作用12 h，觀察各組DCs形態(tài)。收集細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml，加入PE-PD-L1單抗4℃避光孵育30 min，洗滌重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測PD-L1陽性表達(dá)。每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 激光共聚焦成像檢測PD-L1表達(dá)和PI3K、AKT、P65磷酸化水平

取無菌玻片培養(yǎng)DCs并按照按照1.2方法處理各組細(xì)胞后，用預(yù)冷PBS洗去漂浮細(xì)胞，甲醇室溫固定Triton-100破膜，脫脂奶粉封閉，4℃避光孵育PE-PD-L1單抗或PE-p-P65單抗、FITC-p-PI3K、FITC-p-AKT單抗過夜，DAPI熒光染核封片，激光共聚焦顯微鏡拍照分析。每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 BrdU細(xì)胞增殖實驗檢測淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

用1.2所述方法誘導(dǎo)DCs。4 d后換液并加藥：Con組加PBS，LPS組、LY294002+LPS組、PDTC+LPS組和LPS+αPD-L1組分別加LPS、LY294002和LPS、PDTC和LPS、LPS作用12 h。將各組細(xì)胞負(fù)載雞卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)抗原4 h。收集各組細(xì)胞調(diào)整濃度為5×105cells/100 μl作為刺激細(xì)胞，其中LPS+αPD-L1組用PD-L1封閉抗體培養(yǎng)箱封閉30 min。取C57BL/6小鼠脾臟，研磨離心裂解紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cells/100 μl作為效應(yīng)細(xì)胞。以刺激細(xì)胞：效應(yīng)細(xì)胞=1∶10混合于96孔圓底板，培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4 d。按照BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書流程操作并讀取OD值。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點實驗檢測細(xì)胞毒性殺傷反應(yīng)

用1.2所述方法誘導(dǎo)DCs。4 d后換液并按照1.5方法加藥，將各組細(xì)胞負(fù)載OVA抗原4 h，調(diào)整各組濃度為5×107cells/ml，其中LPS+αPD-L1組用PD-L1封閉抗體培養(yǎng)箱封閉30 min。取100 μl體積腹腔注射輸入C57BL/6小鼠，每組3只并設(shè)空白對照。5 d后無菌取各組小鼠脾臟，裂解去除紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cells/ml接種至ELISPOT板，OVA再刺激并靜置孵育18 h。按照γ-IFN小鼠ELISPOT試劑盒流程操作處理并讀板，確定每孔ELISPOT斑點數(shù)，每一個斑點代表一個產(chǎn)生γ-IFN細(xì)胞，計數(shù)斑點形成細(xì)胞數(shù)(spot-forming cell，SFC)。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 脂多糖對樹突狀細(xì)胞PI3K-AKT和NF-κB信號的影響

為明確脂多糖對樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)通路PI3K-AKT和NF-κB信號的作用，我們采用激光共聚焦成像檢測LPS對DCs的PI3K、AKT和P65激酶磷酸化的影響。結(jié)果顯示，LPS刺激后15 min開始檢測到p-PI3K和p-AKT的綠色熒光，并主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，在30～60 min綠色熒光逐漸增強并開始入核(圖1A-B)。LPS刺激15 min開始到60 min持續(xù)檢測到p-P65的紅色熒光(圖1C)。脂多糖增強樹突狀細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和p-P65信號水平。表明，細(xì)菌脂多糖能夠顯著激活樹突狀細(xì)胞的PI3K-AKT/NF-κB信號。

Fig. 1 p-PI3K(A)、p-AKT(B) and p-P65(C) signal were assessed by laser confocal scanning microscopy assay at 0 min、15 min、30 min and 60 min

2.2 脂多糖對樹突狀細(xì)胞免疫共抑制分子PD-L1表達(dá)的影響

為明確脂多糖對樹突狀細(xì)胞共抑制分子PD-L1的作用，我們采用流式細(xì)胞分析、激光共聚焦成像分別檢測LPS對DCs免疫共抑制分子PD-L1表達(dá)水平和定位影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與對照組比較，LPS組DCs表面PD-L1陽性細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.01，圖2)。激光共聚焦成像結(jié)果顯示：與對照組比較，LPS刺激后DCs共抑制分子PD-L1特異性紅色熒光主要分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)，且熒光強度明顯增強(圖2)。表明細(xì)菌內(nèi)毒素LPS明顯增強DCs免疫共抑制分子PD-L1的表達(dá)水平，且PD-L1主要高表達(dá)在細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)。

Fig. 2 The PD-L1 expression on DCs was detected by flow cytometry (A) and laser confocal scanning microscopy (B) assay with bacterial lipopolysaccharide treatment

2.3 脂多糖上調(diào)PD-L1對樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響

為明確LPS上調(diào)PD-L1對抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的作用，BrdU細(xì)胞增殖實驗顯示，與對照組比較，高表達(dá)PD-L1的LPS組T細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.01，表1)。與LPS組比較，LPS+αPD-L1組T細(xì)胞增殖水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。γ-IFN酶聯(lián)免疫斑點實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高表達(dá)PD-L1的LPS組SFC水平明顯降低。與LPS組比較，LPS+αPD-L1組SFC水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。表明LPS引起PD-L1表達(dá)增高顯著抑制OVA特異性T淋巴細(xì)胞增殖和CTL反應(yīng)。阻斷PD-L1表達(dá)可改善T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制現(xiàn)象。

Tab. 1 The BrdU cell proliferation and γ-IFN CTL response of LPS induced DCs-dependent T cell response by PD-L1 blocking n=6)

2.4 PI3K-AKT和NF-κB通路對脂多糖誘導(dǎo)PD-L1介導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的影響

為明確PI3K-AKT和NF-κB信號通路對LPS上調(diào)PD-L1表達(dá)誘導(dǎo)免疫抑制的作用，激光共聚焦成像結(jié)果顯示：與對照組比較，LPS組顯著增強PD-L1特異性紅色熒光強度，且主要分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)。與LPS組比較，LY294002+LPS組和PDTC+LPS組DCs表面PD-L1紅色熒光強度降低(圖3)。BrdU細(xì)胞增殖實驗顯示，與對照組比較，LPS組T細(xì)胞增殖水平明顯降低。與LPS組比較，LY294002+LPS組和PDTC+LPS組T細(xì)胞增殖水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。γ-IFN酶聯(lián)免疫斑點實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組SFC水平明顯降低。與LPS組比較，LY294002+LPS組和PDTC+LPS組SFC水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。以上數(shù)據(jù)表明，阻斷PI3K-AKT或NF-κB信號通路可有效改善脂多糖誘導(dǎo)的PD-L1介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制現(xiàn)象。

Fig. 3 The PD-L1 expression on DCs were detected by laser confocal scanning microscopy assay with LY294002、PDTC treatment

Tab. 2 The BrdU cell proliferation and γ-IFN CTL response of LPS induced DCs-dependent T cell response by LY294002 and PDTC treatment n=6)

3 討論

脂多糖(LPS)是細(xì)菌膿毒癥最重要的啟動因子，臨床上任何血內(nèi)或腸道LPS存在均可誘發(fā)細(xì)菌膿毒癥的發(fā)生。在細(xì)菌膿毒癥的研究中，Schwandt[13]團隊發(fā)現(xiàn)革蘭陰性細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS可通過TLR4-TRIF信號麻痹DCs抑制細(xì)胞毒性CTL反應(yīng)導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)感染?；诖耍狙芯恳约?xì)菌成分LPS刺激抗原提呈細(xì)胞DCs復(fù)制細(xì)菌膿毒癥的免疫抑制反應(yīng)，結(jié)果顯示細(xì)菌內(nèi)毒素LPS顯著抑制DCs介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒殺傷作用，證實了細(xì)菌LPS確實在特定條件下具有誘導(dǎo)樹突細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫抑制作用。因此我們推測有效控制細(xì)菌感染及脂多糖的水平是改善細(xì)菌膿毒癥的免疫抑制，提高患者生存率的有力措施。

膿毒癥的臨床病理和動物實驗研究均發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量銳減及其表面免疫相關(guān)分子表達(dá)異常，是導(dǎo)致免疫紊亂和免疫反應(yīng)低下的主要原因[6,10,15]。臨床中通過體外阻斷PD-1/PD-L1信號通路可明顯改善膿毒癥患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞功能[16-18]。在脂多糖誘導(dǎo)免疫麻痹模型中，DCs上調(diào)PD-L1表達(dá)并與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合抑制免疫反應(yīng)導(dǎo)致“免疫麻痹”的發(fā)生[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS顯著提高DCs免疫共抑制分子PD-L1表達(dá)，并抑制T淋巴細(xì)胞增殖活化。此外我們采用封閉抗體阻斷PD-L1后顯著逆轉(zhuǎn)了上述免疫抑制現(xiàn)象，說明免疫細(xì)胞DCs表面PD-L1可能是引起此免疫抑制的關(guān)鍵分子，我們推測細(xì)菌膿毒癥臨床研究中封閉PD-L1/PD-1作用具有重要意義。但同時我們也發(fā)現(xiàn)阻斷PD-L1并沒有完全逆轉(zhuǎn)此免疫抑制，說明可能存在其他分子或機制介導(dǎo)此免疫抑制過程，有待探究?；谝陨衔覀兘ㄗhPD-L1可作為細(xì)菌膿毒癥所致免疫抑制的潛在靶點開展應(yīng)用研究。

PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。PI3K活化下游靶蛋白AKT進(jìn)而促進(jìn)IκB磷酸化降解，激活并釋放NF-κB核轉(zhuǎn)位，激活靶基因調(diào)控免疫分子表達(dá)[9-11,19]。本課題應(yīng)用通路抑制劑探究LPS誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC均顯著降低LPS誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞PD-L1表達(dá)，更重要的是抑制劑有效逆轉(zhuǎn)LPS所致DCs介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫抑制現(xiàn)象，提示PI3K/ AKT信號通路及NF-κB信號通路可能參與細(xì)菌內(nèi)毒素LPS所致DCs介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫抑制現(xiàn)象。據(jù)此我們推測在細(xì)菌膿毒癥中PI3K/AKT、NF-κB信號通路調(diào)控可發(fā)揮重要作用，阻斷PI3K/AKT、NF-κB信號可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的DC表面PD-L1表達(dá)，減輕T淋巴細(xì)胞免疫抑制。研究報道磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)PD-L1的蛋白序列分析具有類似Tyr-Xaa-Xaa-Met (YXXM)結(jié)構(gòu)域，而YXXM序列可與PI3K結(jié)合并活化p85亞基，在調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[19]，那么PI3K/AKT信號通路調(diào)控與PD-L1表達(dá)的詳細(xì)機制如何，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，細(xì)菌致病成分LPS早期接觸誘導(dǎo)DCs高表達(dá)共抑制分子PD-L1，引發(fā)T淋巴細(xì)胞免疫抑制。應(yīng)用PD-L1封閉抗體明顯逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞免疫低下，改善免疫麻痹。同時PI3K/AKT和NF-κB信號通路可調(diào)控LPS誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)降低T淋巴細(xì)胞免疫抑制。由此我們推測，利用PI3K/AKT或NF-κB通路抑制劑有望降低PD-L1表達(dá)改善細(xì)菌膿毒癥免疫抑制的候選治療策略。