二甲雙胍和西格列汀對(duì)胰島素抵抗糖尿病前期KKAy小鼠胰島β細(xì)胞功能的影響*

李 萍， 梁琳瑯， 王 宇， 侯 達(dá)， 楊 昕， 楊 博

(1. 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 2. 內(nèi)分泌科， 遼寧 沈陽(yáng) 110812)

糖尿病大血管病變的發(fā)生在糖尿病前期，甚至更早即已出現(xiàn)。因此，糖尿病的早期干預(yù)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該前移至糖尿病前期。雖然研究顯示單純生活方式干預(yù)可以使糖尿病前期的血糖下降[1]，發(fā)病率明顯降低[2]，但是難以堅(jiān)持。二甲雙胍作為一線降糖藥已經(jīng)應(yīng)用了60年，安全性很高，不但能夠降低胰島素抵抗，并能抑制肝糖輸出，研究顯示，它可使糖尿病的發(fā)病率減少45%[2]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病前期人群胰島β細(xì)胞容積較非糖尿病者已減少40%[3]。多項(xiàng)研究證實(shí)，DPP-4抑制劑有效控制血糖的同時(shí)，能夠增加糖尿病小鼠胰島容積并改善其胰島功能[4，5]，臨床數(shù)據(jù)表明西格列汀非常安全，但是目前用于糖尿病前期的研究報(bào)告少見(jiàn)[6，7]。

為了更好地模擬2型糖尿病前期的病理生理情況，本實(shí)驗(yàn)選擇公認(rèn)的自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠- KKAy小鼠為研究對(duì)象，試圖比較糖尿病前期胰島素抵抗KKAy小鼠給予二甲雙胍、西格列汀干預(yù)對(duì)體重、血糖、血脂、HOMA-IR、胰腺形態(tài)學(xué)和增值凋亡的影響，并從分子水平探討其可能機(jī)制。為糖尿病干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的前移提供充分的理論依據(jù)。

教研組對(duì)于教師開(kāi)展教學(xué)活動(dòng)來(lái)說(shuō)，是十分重要的，它是網(wǎng)絡(luò)教研活動(dòng)的基礎(chǔ)。教研活動(dòng)能夠?qū)⒔處熍c學(xué)生進(jìn)行緊密結(jié)合，加強(qiáng)兩者的聯(lián)系，從而為教研活動(dòng)掃清障礙。在教研組中，教師可以進(jìn)行備課，并與其他教師在線討論等。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

同一批號(hào)SPF級(jí)KKAy雄性小鼠30只，5周齡，體重(18±1)g，購(gòu)自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為室溫22～24℃，濕度40%～60%左右，自然晝夜節(jié)律，自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組:普通飼料組(C組，n=10)和高脂飼料組(HF組，n=20)。C組予以普通飼料(由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制)喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；HF組給予高脂飼料喂養(yǎng)(粗蛋白18%、粗脂肪20%，碳水化合物48%)。每周固定時(shí)間測(cè)小鼠血糖(尾靜脈)及體質(zhì)量，監(jiān)測(cè)血糖及體質(zhì)量變化。將空腹血糖>11.1 mmol/L者定為T2DM。

1.2 干預(yù)方式

8周齡時(shí)，將20只高脂飼料喂養(yǎng)KKAy小鼠改為普通飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)分為兩組: (1)二甲雙胍干預(yù)組(met，n=10)：鹽酸二甲雙胍(0.5 g，中美上海施貴寶制藥有限公司)溶于生理鹽水，按照0.2 g/(kg·d)灌胃[8]；(2)西格列汀干預(yù)組(SP組，n=10):鹽酸西格列汀(每片100 mg，默沙東公司)溶于 0.5%羥甲基纖維素鈉中，按照30 mg/(kg·d)灌胃[9]。正常對(duì)照組小鼠給予相同劑量蒸餾水灌胃。每日灌胃時(shí)間于早9點(diǎn)，持續(xù)8周。

灌胃8周后，與C組相比，Met組FBG、HOMO-IR、TC、LDL-c均顯著降低(P<0.05)；SP組FBG和TC顯著降低(P<0.05，P<0.05)，F(xiàn)INS和HOMO-β顯著增加 (P<0.05，P<0.05)。SP組FINS、HOMO-IR較Met組顯著增高(P<0.05)。Met組LDL-c較SP組顯著降低(P<0.05，表2)。

1.3 標(biāo)本收集與處理

2.6 香菇普通粉、超微粉持水性比較 由圖6可見(jiàn)，香菇普通粉和超微粉的持水性指數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)。這是因?yàn)殡S著粉體粒徑的減小，粉體分子變小，其對(duì)水分子的束縛力也變小，因而持水能力下降。此外，超微粉碎后粉末，由于破壁效應(yīng)，水溶性分子變多，也會(huì)使持水能力下降。

結(jié)果如表3所示，與C組比較，Met組和SP組KKAy小鼠的空腹血糖、口服葡萄糖后30、60及120 min的血糖顯著降低(P<0.01，P<0.01)，血糖時(shí)間曲線下面積(AUC)顯著降低(P<0.01,P<0.01)。與Met組比較，SP組口服葡萄糖后30及60 min的血糖無(wú)顯著差異，120 min時(shí)血糖顯著降低(P< 0.05)，但兩組AUC無(wú)顯著差異。

(3)胰島素耐量試驗(yàn)(ITT) ：給藥8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天動(dòng)物禁食3 h，皮下注射常規(guī)胰島素溶液(1 U/kg),于注射前 (0 min) 和注射后30及60、120 min采血樣, 測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血糖值, 并計(jì)算各點(diǎn)血糖與0 min血糖的比值，用ΔBG表示，比較各點(diǎn)下降幅度，應(yīng)用公式：AUG=1/2(1-Δ0’BG+1-Δ120’BG) +1-Δ30’BG +1-Δ60’BG。計(jì)算曲線下面積 (AUC)。

(1)6、8和16周齡時(shí)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天動(dòng)物禁食14 h, 經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血2 ml測(cè)血糖、胰島素、血脂。

1.4 儀器與試劑

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食2周即可顯著升高KKAy小鼠的FBG、FINS和血脂(TC、TG、LDL-c)水平。KKAy小鼠一般在15周齡時(shí)發(fā)生糖尿病[9，10]。OGTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究中16周齡KKAy小鼠，正常飲食對(duì)照組均發(fā)生了糖尿病，而高脂飲食喂養(yǎng)2周后應(yīng)用二甲雙胍、西格列汀干預(yù)8周，均未見(jiàn)糖尿病發(fā)生，提示了這兩種降糖藥均有良好預(yù)防糖尿病發(fā)生作用。與同周齡C組相比，Met組和SP組時(shí)間血糖曲線下面積顯著減少，與既往研究[9，10]也有報(bào)道一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與C組相比，Met組HOMO-IR顯著降低，SP組FINS和HOMO-β顯著增加，提示這是兩種藥物的作用機(jī)制不同。

1.5 胰腺病理形態(tài)及免疫熒光標(biāo)記胰島素和胰高血糖素

給藥8周后，所有小鼠禁食12 h，稱重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下解剖小鼠，腹主動(dòng)脈取血3 ml，血標(biāo)本靜止15 min后，離心10 min，留取血清置于-80℃冰箱保存。并在冰上操作取出胰腺，于冰生理鹽水中沖洗干凈，稱重并計(jì)算胰腺指數(shù);每組5只置于液氮罐中以備提取蛋白質(zhì)，5只置于4%甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋,5 μm切片,用免疫熒光染色標(biāo)記 KKAy 小鼠胰島中的胰島素(insulin)和胰高血糖素(glucagon)的變化。采用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)在分辨率、對(duì)比度、亮度等相同條件下觀察胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.6 胰島細(xì)胞增殖、凋亡情況

(1)ki67/insulin雙染色判斷細(xì)胞增殖情況：按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，鏡下觀察顯色結(jié)果。(2)Tunel凋亡檢測(cè)：按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作．染色結(jié)果采用OLYMPUSBX51顯微鏡進(jìn)行圖象采集，IPP6．0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。系統(tǒng)定標(biāo)，每張切片選3～5個(gè)胰島，每組至少選3～5張切片，隨機(jī)選擇10個(gè)胰島，計(jì)數(shù)每個(gè)胰島中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并計(jì)算與該胰島全部細(xì)胞核數(shù)的比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

文獻(xiàn)[5]中詳細(xì)分析推導(dǎo)證明了蓄電池回跳電壓Ut決定于開(kāi)路電壓的大小,而開(kāi)路電壓與蓄電池剩余容量存在著比較固定的關(guān)系[6]。由此,蓄電池的回跳電壓與剩余容量之間關(guān)系緊密。并且鑒于其易于檢測(cè)獲取,回跳電壓在SOC預(yù)測(cè)中顯示出的實(shí)效性顯而易見(jiàn)。而且在估測(cè)電池SOC中也需要考慮溫度、充放電倍率、循環(huán)壽命等這些因素的影響。

1.7 Western blot檢測(cè)KKAy小鼠胰腺組織中PDX-1及Mafa的蛋白表達(dá)水平

從-80℃冰箱中取出胰腺組織標(biāo)本約100 mg,加入400 μl含磷酸化酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液,超聲勻漿,充分裂解,冰浴放置35 min,期間適時(shí)混勻。12 000 r/min離心5 min。取上清液與上樣緩沖液混勻煮沸制備成蛋白電泳樣品,用Western blot檢測(cè)胰腺中PDX-1及Mafa蛋白表達(dá)水平變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Met和SP對(duì)KKAy小鼠體重和生化指標(biāo)的影響

6周時(shí)，高脂喂養(yǎng)前，三組KKAy小鼠的體重((20.30±1.34)，(20.38±1.47)，(20.33±1.56)g)、血糖((5.77±0.53)，(5.54±0.59)，(5.44±0.69)mmol/L)，均無(wú)顯著差異。與C組相比，高脂喂養(yǎng)兩周灌胃后，Met組與SP組KKAy小鼠的BW、FBG、FINS、TC、TG、LDL，均顯著增高(P<0.05)；而Met組與SP組比較，無(wú)顯著差異(表1)。

Tab. 1 Comparison of the general information among three groups in prediabetic KKAy rat models (before gavage) n=10)

2.2 干預(yù)后三組生化指標(biāo)的比較

鬼子的第一輪進(jìn)攻,沒(méi)有占到半點(diǎn)便宜，反而在山坡上扔下了幾十具尸體。而夏國(guó)忠這邊，除了被飛機(jī)轟炸造成的傷亡外，整個(gè)連隊(duì)在戰(zhàn)斗中無(wú)一傷亡。

2.3 Met和西格列汀對(duì)KKAy小鼠口服葡萄糖耐量的影響

(2)葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)：給藥6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天動(dòng)物禁食14 h，灌胃給予25%葡萄糖水2.0 g/kg負(fù)荷。于負(fù)荷前及負(fù)荷后30、60和120 min取血, 用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖值,應(yīng)用公式：AUG=1/2(0’BG+120’BG)+30’BG+60’BG，計(jì)算OGTT血糖曲線下面積(AUC)。

C組胰島中insulin表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域即為β細(xì)胞，亮度較低，邊緣散亂(圖1A),glucagon表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域即為α細(xì)胞，在胰島中分布無(wú)序,亮度較大(圖1B)。給予Met后,胰島中insulin表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域及亮度明顯增加(圖1C);給予Met治療后,glucagon表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域明顯減少及亮度降低, 且α細(xì)胞一定程度恢復(fù)向胰島邊緣的分布 (圖1D)。給予西格列汀治療后,胰島中insulin表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域及亮度顯著增加(圖1E),glucagon 表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域顯著減少及亮度降低, 且α細(xì)胞一定程度恢復(fù)向胰島邊緣的分布 (圖1F)。TUNEL染色未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡。

2.4 Met和西格列汀對(duì)KKAy小鼠胰島素耐量的影響

結(jié)果如表4所示，與C比較，16周齡Met和SP給藥組KKAy小鼠的空腹血糖(P<0.01，P<0.01)、注射胰島素后30、60及90 min血糖均顯著減低(P<0.01，P<0.01)，ITT血糖曲線下面積(AUC)均顯著升高(P<0.01，P<0.01)。Met組與西格列汀組各點(diǎn)血糖和AUC均無(wú)顯著差異。

2.5 Met和西格列汀對(duì)KKAy小鼠胰腺組織病理形態(tài)及胰島中胰島素和胰高血糖素蛋白表達(dá)的影響

我們對(duì)50種自費(fèi)加項(xiàng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,得到網(wǎng)狀圖,如圖3a。將3a的模式調(diào)到頻數(shù)較高區(qū)域,得到3b,使得各關(guān)聯(lián)關(guān)系更加清晰,且保留關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)的關(guān)系。網(wǎng)狀圖顯示,加項(xiàng)之間搭選的常見(jiàn)模式有:

Tab. 2 Comparison of the general information among three groups inprediabetic KKAy rat models (after gavage)

Tab. 3 Comparison of the oral glucose tolerance test among three groups in prediabetic KKAy rat models(after gavage) n=10)

Tab. 4 Comparison of the insulin tolerance test among three groups inprediabetic KKAy rat models(after feeding)

Fig. 1 Effects of Met and sitagliptin on pancreatic histopathological morphology and insulin and glucagon immunoreactivity in pancreatic islets in KKAy mice

2.6 Met和西格列汀對(duì)小鼠胰島MafA，PDX-1蛋白的表達(dá)情況

與C組比較，Met組和SP組KKAy小鼠MafA蛋白表達(dá)水平顯著升高，分別是C組的1.63倍、 1.58倍(P<0.01，P<0.01，圖2)，提示Met和SP均能上調(diào)MafA蛋白表達(dá)。各組間PDX-1蛋白表達(dá)情況無(wú)顯著差異。

Fig. 2 Effects ofmetformin and sitagliptin on the expressions of PDX-1 and MafA protein in the pancreas of KKAy mice

3 討論

全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)，穩(wěn)豪血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)，胰島素ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。胰島素、胰高血糖素抗體，Kir67抗體(上海仁捷生物科技有限公司)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(中杉金橋公司)，PDX-1抗體(上海仁捷生物科技有限公司)，Mafa抗體(上海仁捷生物科技有限公司)、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑(美國(guó) millipore公司)等。

Ki67是一種較特異的細(xì)胞核增殖抗原，廣泛表達(dá)于增殖期細(xì)胞，在糖尿病研究中廣泛用于評(píng)估β細(xì)胞增殖情況[11]。既往研究提示，二甲雙胍抑制高脂誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞增殖[12]，GLP-1主要通過(guò)反式激活蛋白酶B、負(fù)調(diào)控插頭狀轉(zhuǎn)錄因子，直接上調(diào)細(xì)胞周期蛋白等來(lái)促進(jìn)β細(xì)胞增殖[13]。本研究中熒光免疫組化標(biāo)記顯示，NC組16周齡KKAy小鼠，其胰島中β細(xì)胞亮度較低，邊緣散亂，α細(xì)胞在胰島中分布無(wú)序，亮度較大；Met干預(yù)組，β細(xì)胞區(qū)域及亮度較對(duì)照組增加，α細(xì)胞區(qū)域及亮度較對(duì)照組減少和降低，α細(xì)胞一定程度向胰島邊緣分布；SP干預(yù)組，β細(xì)胞區(qū)域及亮度顯著增加，α細(xì)胞區(qū)域顯著減少，亮度顯著降低，α細(xì)胞在胰島邊緣分布。提示二甲雙胍干預(yù)維持細(xì)胞的功能衰減，西格列汀促進(jìn)β細(xì)胞增殖，與既往研究類似[14]。TUNEL染色未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡，這可能與KKAy小鼠處于糖尿病早期，β細(xì)胞未發(fā)生明顯凋亡有關(guān)。

胰十二指腸同源盒1(pancreatic and duodena homeobox factor-1，PDX-1)是胰腺定向發(fā)育成熟過(guò)程中已知的第一個(gè)也是最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在成年機(jī)體內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)等基因來(lái)維持β細(xì)胞形態(tài)和功能正常，并對(duì)β細(xì)胞增殖和胰島素分泌功能起重要作用。本研究中Western blot分析發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍干預(yù)后PDX-1表達(dá)輕度下降，這與既往研究一致，并藉此機(jī)制發(fā)揮其抗癌作用[15]。Li等的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以葡萄糖依賴的方式促進(jìn)PDX-1基因及蛋白的表達(dá)[16]，PKB是連接GLP-1信號(hào)和調(diào)節(jié)β細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的重要介質(zhì)[17]。Reimer MK等研究[18]發(fā)現(xiàn)，在給予高脂誘導(dǎo)8周的C57BL/6J小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗和糖耐量減低，PDX-1僅是核轉(zhuǎn)位出現(xiàn)異常。本研究中，西格列汀干預(yù)后PDX-1表達(dá)輕度下降，這與既往研究不同。分析原因，可能在糖尿病早期PDX-1的水平并未發(fā)生明顯變化或僅發(fā)生了核轉(zhuǎn)位的異常；或者所給劑量的西格列汀帶來(lái)的GLP-1含量增加，不足以影響PDX-1的表達(dá)；也可能由于PDX-1在各種胰島細(xì)胞中都有所表達(dá)，西格列汀促進(jìn)β細(xì)胞增殖的能力，不足以抵抗其抑制a細(xì)胞帶來(lái)的對(duì)PDX-1的影響。其具體原因還有待進(jìn)一步深入研究。

MafA全稱為肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma-oncogene homologue A)。MafA蛋白是一種具有強(qiáng)烈胰島素表達(dá)激活特性的胰腺β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，屬于大Maf家族蛋白之一。作為一種特異的細(xì)胞核因子，MafA蛋白可結(jié)合至胰島素基因啟動(dòng)區(qū)域保守順式調(diào)控元件RIPE3b，強(qiáng)烈的反式調(diào)控胰島素的表達(dá)。它在β細(xì)胞分化的最后階段胰島素生成細(xì)胞成批發(fā)育時(shí)才有所表達(dá)，維持細(xì)胞的成熟和功能，對(duì)β細(xì)胞的生存、增殖有重要作用[19]。在糖尿病個(gè)體中，MafA的表達(dá)水平下降可導(dǎo)致β細(xì)胞功能衰退[20]。對(duì)db/db小鼠應(yīng)用阿格列汀可增加MafA的表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予二甲雙胍和西格列汀干預(yù)后，KKAy小鼠MafA蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均明顯上升，SP組水平略高于Met組。這提示二甲雙胍和DPP4抑制劑可能通過(guò)增加MafA的表達(dá)發(fā)揮對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

中小型企業(yè)的管理者由于人員素質(zhì)不夠高，對(duì)內(nèi)部控制的設(shè)計(jì)實(shí)施及必要性沒(méi)有充分的了解。國(guó)家應(yīng)當(dāng)對(duì)中小型企業(yè)的管理者進(jìn)行系統(tǒng)培訓(xùn)，第一，讓管理者意識(shí)到內(nèi)部控制制度的重要性，以及其有效運(yùn)行給公司帶來(lái)的好處；第二，讓其了解內(nèi)部控制制度的必要性。在充分了解成本與效益的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)中小企業(yè)管理者內(nèi)部控制的意識(shí)。[2]

胰島β細(xì)胞分泌和調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜。本研究還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和西格列汀干預(yù)后KKAy小鼠TC顯著降低對(duì)照組，二甲雙胍組LDL-c較對(duì)照組降低，提示這兩種藥物還有可能通過(guò)改善脂代謝紊亂的作用降低對(duì)胰島功能的損害。

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綜上所述，對(duì)胰島素抵抗糖尿病前期KKAy小鼠，給予二甲雙胍可以維持胰島的功能和形態(tài)，給與西格列汀可能促進(jìn)β細(xì)胞增殖，提高胰島素轉(zhuǎn)錄因子MafA的表達(dá)水平，改善脂代謝紊亂。因此，推薦對(duì)糖尿病前期積極干預(yù)，空腹血糖調(diào)節(jié)受損的應(yīng)用二甲雙胍，葡萄糖耐量減低的應(yīng)用西格列汀，有望實(shí)現(xiàn)控制糖尿病的發(fā)生發(fā)展。