改良法分離培養(yǎng)SD新生乳鼠原代心肌細(xì)胞*

孟香紅， 曾 斌， 陳慧玲， 李偉東， 李 娜， 徐小勇

(1. 寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 浙江 寧波 315104; 2. 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心血管科， 浙江 寧波 315040)

原代心肌細(xì)胞由于不受機(jī)體神經(jīng)體液因素干擾，同時保持著眾多在體心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特點，是心血管疾病臨床和基礎(chǔ)研究無可替代的體外實驗?zāi)Ｐ?。?0世紀(jì)60年代，Harary等[1]成功分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞以來，關(guān)于原代心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)的方法不斷改進(jìn)和完善[2-4]，但仍舊存在操作繁瑣、耗時較長、存活率不高、結(jié)構(gòu)破壞等諸多缺陷[5]，且心肌細(xì)胞近乎是終末分化細(xì)胞無法傳代培養(yǎng)，實驗時必須每次從頭分離純化。因此，如何實現(xiàn)原代心肌細(xì)胞的簡單快捷、高純度、高活力分離培養(yǎng)，仍是心血管研究領(lǐng)域的亟待解決的瓶頸問題。本文利用Percoll梯度離心+5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)化學(xué)抑制法，將純化的原代心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)于含5%馬血清的改良DMEM/F12中，在較短時間內(nèi)成功獲得了生長狀態(tài)穩(wěn)定、活力和純度較高的原代新生大鼠心肌細(xì)胞，為心臟疾病機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供了理想的體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新生SD 乳鼠(出生1～2 d)，雌雄不限，由羅格斯大學(xué)新澤西醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要實驗試劑及設(shè)備

DMEM/F12或高糖DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)；丙酮酸鈉(Thermo Fisher)； 維生素C(Gibco)；亞油酸(Sigma)；Ⅱ型膠原酶(Worthington Biochemical)；Percoll密度梯度離心液(GE Healthcare)；HEPES(Amresco)；馬血清、胎牛血清(Gibco)；5-溴脫氧尿嘧啶、臺盼藍(lán)、0.1%Triton-X100、4% 多聚甲醛、PBS、DAPI(Sigma)；青鏈霉素、cTNT 鼠單克隆抗體(Invitrogen)；Alexa Fluor 568驢抗鼠熒光二抗(Thermo Fisher)；熒光相差顯微鏡(Olympus)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；倒置光學(xué)顯微鏡(Leica)。

1.3 改良法分離純化新生大鼠原代心肌細(xì)胞

1窩SD新生乳鼠(約10 只，出生不超過 2 d)，乙醚麻醉后，碘伏消毒胸壁，開胸取出心臟，置于冰上預(yù)冷的PBS中清洗殘存血液。棄心房，將心室部分移到手術(shù)玻璃板的凹槽中剪成 1 mm3碎塊(冰上操作)。將心臟碎塊移入滅菌的燒瓶中，加入 0.12% II型膠原酶(每個心臟約1 ml II 型膠原酶)37 ℃恒溫水浴搖床中消化15 min，轉(zhuǎn)速 220 r/min。將上清液轉(zhuǎn)移到冰上裝有2 ml馬血清的EP管中終止消化，再次將膠原酶加至燒瓶中消化剩余心臟組織，重復(fù)3次以上直至所有組織被消化完全。將消化好的細(xì)胞懸液于4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 ml重懸緩沖液并合并細(xì)胞懸液，用于分離純化。

配制高密度(1.086 g/ml)和低密度(1.060 g/ml)Percoll液，在15 ml Falcon管中加入4 ml高密度分離液，后緩慢、輕柔地加入3 ml低密度分離液，便可在頂部和底部梯度之間出現(xiàn)清晰的中間相。將2 ml細(xì)胞懸液緩慢加到Percoll 液上面，4℃、3 000 r/min離心30 min，自然減速無剎車，即可獲得 2層分界清楚的細(xì)胞帶(圖1)。上層細(xì)胞帶(低密度Percoll液上面)主要是成纖維細(xì)胞，少量內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞；下層細(xì)胞帶(低密度與高密度Percoll液之間)即主要為原代心肌細(xì)胞。吸棄下層細(xì)胞帶以上部分，將下層細(xì)胞帶中漂浮的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入重懸緩沖液，2 000 r/min離心5 min洗滌細(xì)胞，棄上清，重復(fù)1次。用37℃預(yù)熱的10 ml含5%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞沉淀并行細(xì)胞計數(shù)(避免氣泡，反復(fù)輕柔吹打30 次以上)。調(diào)整心肌細(xì)胞的濃度為1×106cells/ml，將心肌細(xì)胞接種到經(jīng)0.3%明膠包被，含5%馬血清、100 μmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)并添加各種營養(yǎng)因子的改良DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中(表1)，次日更換為普通無 5-BrdU含 10%胎牛血清(FBS)的高糖 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行相應(yīng)處理和觀察。

3 ml of low-density Percoll separation solution was slowly added to 4 ml of high-density Percoll solution to form a discontinuous gradient. Then 2ml of cell suspension was slowly added to Percoll solution and centrifuged at 4℃ at 3 000 r/min for 30 min to obtain 2 layers of well-defined cell bands. The upper cell band (above the low-density Percoll solution) was mainly fibroblasts, with a small amount of endothelial cells and cardiomyocytes. The bottom cell band (between low and high-density Percoll solution) was mainly primary cardiomyocytes

Tab. 1 Comparison of medium and components used in both methods

1.4 傳統(tǒng)差速貼壁法純化原代心肌細(xì)胞

同前述取心、消化完全后，4℃、1 000 r/min離心5 min并棄上清，細(xì)胞沉淀用含10% FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)液重懸并制成單細(xì)胞懸液，接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。待貼壁 90 min 以去除成纖維細(xì)胞后，收集未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞至適宜密度，培養(yǎng)于 0.3% 明膠包被，含 10% FBS、 100 μmol/L 5-BrdU 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中。 次日更換為無5-BrdU、含 10% FBS 的普通高糖 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)操作。

1.5 心肌細(xì)胞得率和存活率檢測

接種前，取10 μl心肌細(xì)胞懸液與等體積 0.4% 臺盼藍(lán)混勻后移至血球計數(shù)板。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野計數(shù)并判斷細(xì)胞活力。未染色的為活細(xì)胞，藍(lán)色的為死細(xì)胞。心肌細(xì)胞得率/心=細(xì)胞密度 × 細(xì)胞懸液總體積/新生乳鼠心臟個數(shù)，并統(tǒng)計三次實驗的原代心肌細(xì)胞得率，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；細(xì)胞存活率 (%) = 活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) × 100%。

1.6 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和搏動情況觀察

倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞，分別于接種后的24 h、48 h和72 h，逐日持續(xù)觀察7 d。記錄心肌細(xì)胞形態(tài)變化、生長狀況和自發(fā)搏動頻率。

1.7 心肌細(xì)胞純度鑒定

原代心肌細(xì)胞接種于爬片小室內(nèi)，次日更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞爬片，PBS沖洗兩次，用4%多聚甲醛固定20 min，后用0.25% TritonX-100通透破膜20 min，PBS洗3次，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min。1∶500加入鼠抗心肌肌鈣蛋白T抗體，濕盒4℃過夜。次日加入Alexa Fluor 568驢抗鼠熒光二抗，室溫孵育1 h。用含 DAPI 抗熒光淬滅的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下拍照記錄。心肌細(xì)胞純度 (%) = 陽性細(xì)胞數(shù) /DAPI 核染細(xì)胞總數(shù) ×100% 。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 改良法獲得新生乳鼠原代心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和搏動情況觀察

顯微鏡觀察顯示，改良方法獲得的心肌細(xì)胞生長良好，24 h 后幾乎全部貼壁生長，細(xì)胞呈三角形、梭形或不規(guī)則形，個別細(xì)胞出現(xiàn)自主搏動，頻率為10～30 beats/min不等。48 h后心肌細(xì)胞變長伸出偽足，部分細(xì)胞呈現(xiàn)同步搏動, 頻率接近50～80 beats/min。72 h后心肌細(xì)胞成菊花樣交織成網(wǎng)，自發(fā)搏動趨于同步，頻率加快至80～100 beats/min；96 h后細(xì)胞聚集成簇，呈島嶼樣，同步搏動頻率在100～120 beats/min左右(圖2)。一周內(nèi)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，此后變長狀態(tài)開始趨差，搏動次數(shù)減少。

2.2 兩種方法獲得新生乳鼠原代心肌細(xì)胞的得率和存活率的比較

比較傳統(tǒng)差速貼壁法和改良法3次分離獲得新生乳鼠原代心肌細(xì)胞的得率和存活率，結(jié)果顯示：兩種方法純化原代心肌細(xì)胞的獲得率相當(dāng)((1.17±0.15)×106vs(1.21±0.22)×106，P>0.05)；相比傳統(tǒng)差速貼壁法，改良法獲得的原代心肌細(xì)胞存活力較佳，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異(93.3%±1.4%vs92.2%±0.7%，P>0.05)。

2.3 兩種方法獲得原代心肌細(xì)胞的純度的比較

傳統(tǒng)差速貼壁法和改良法獲得的原代心肌細(xì)胞懸液，分別接種于細(xì)胞爬片小室，次日更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞爬片，用心肌特異性表達(dá)的心肌肌鈣蛋白T(cTnT)抗體標(biāo)記，Alexa Fluor 568 驢抗鼠熒光二抗染色，熒光顯相差微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，cTnT 被紅染定位于胞漿(圖3)。隨機(jī)選取10個視野計數(shù)cTnT 陽性細(xì)胞數(shù)量(紅色熒光標(biāo)記)和總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)染 DAPI 細(xì)胞核數(shù)量)，統(tǒng)計cTnT 陽性細(xì)胞比率，即新生乳鼠原代心肌細(xì)胞的純度。結(jié)果顯示，改良法和差速貼壁法獲得的心肌細(xì)胞純度都較佳，但是改良法分離培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞純度明顯更高(P<0.05，圖3)。

(left)Improved method attachment (right)Traditional differential method

Fig. 1 Schematic diagram of primary cardiomyocytes isolated using Percoll density gradient centrifugation from neonatal rats

Fig. 2 Morphological images of neonatal rat primary cardiomyocytes at various culture time (Scale bar =50 μm)

2.4 兩種方法獲得新生乳鼠原代心肌細(xì)胞耗時的比較

傳統(tǒng)差速貼壁法和改良法在獲得原代心肌細(xì)胞的耗時比較，結(jié)果表明，從取心開始計時至獲得可接種的心肌細(xì)胞懸液止，相比統(tǒng)差速貼壁法，改良法能在更短的時間內(nèi)獲得原代心肌細(xì)胞((3.1±0.4)hvs(4.3±0.3)h,P<0.01)。

3 討論

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是在分子水平研究心血管疾病發(fā)病機(jī)制和治療手段的主要體外細(xì)胞模型，如何快速便捷分離得到存活率高、純度好、結(jié)構(gòu)功能保持完整的原代心肌細(xì)胞直接關(guān)系到實驗進(jìn)程和數(shù)據(jù)的可靠性。本課題組通過對以往培養(yǎng)方法的總結(jié)，探索了一種利用Percoll密度梯度離心結(jié)合5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)化學(xué)抑制+培養(yǎng)基優(yōu)化分離純化原代心肌細(xì)胞的改良方法。此法與Yang等[6]用超順磁氧化鐵粒子法(SIOP)純化原代心肌細(xì)胞的獲得率及純度相當(dāng)；其細(xì)胞得率和存活率與傳統(tǒng)差速貼壁法相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但較之純度更高，用時較短，且實驗重復(fù)和穩(wěn)定性好，是一種值得推廣應(yīng)用的原代心肌細(xì)胞分離方法，現(xiàn)將關(guān)鍵因素總結(jié)如下：

原代心肌細(xì)胞非常脆弱而且對壞境pH值相當(dāng)敏感[7]，最適pH在7.2～7.4之間，過酸或過堿都可能影響細(xì)胞的活力和生長狀態(tài)，因此，保證合適的緩沖液和培養(yǎng)基pH顯得尤為重要。目前實驗室用于培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基主要有高糖DMEM[8, 9]、M199[10]配合10%～20%的胎牛血清，而本實驗中采用了DMEM/F-12完全培養(yǎng)基+5%的馬血清，因為DMEM/F-12培養(yǎng)基中含有緩沖能力極強(qiáng)的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，可較長時間內(nèi)緩沖維持體外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。而馬血清可刺激細(xì)胞產(chǎn)生血清反應(yīng)因子，誘導(dǎo)心肌前體細(xì)胞分化并促進(jìn)肌小管形成，從而改善細(xì)胞形態(tài)提高細(xì)胞活力。本研究顯示，相比傳統(tǒng)差速貼壁法，改良法三次分離獲得的心肌細(xì)胞活力更好，雖然結(jié)果并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與胎牛血清培養(yǎng)相比，馬血清組的原代心肌純度更高，這可能也與成纖維細(xì)胞在馬血清培養(yǎng)基中需要更長的倍增和融合時間有關(guān)[12]。

另外，在本次實驗的培養(yǎng)基中添加了維生素C、丙酮酸鈉和亞油酸。維生素C作為抗氧化劑，可保護(hù)心肌細(xì)胞分離過程中缺血缺氧帶來的氧化損傷，并為原代心肌細(xì)胞的生長提供必需的營養(yǎng)支持。缺血期間無氧酵解的增加使乳酸及末端糖基化代謝終產(chǎn)物等有害物質(zhì)大量堆積，添加丙酮酸鈉可激活丙酮酸脫氫酶使糖代謝向有氧氧化方向進(jìn)展[13]。而亞油酸是心磷脂的主要成分，可顯著改善缺血乏氧對心肌細(xì)胞線粒體氧化磷酸化的損傷[14]。

消化酶的選擇和消化時間控制是影響原代心肌細(xì)胞存活率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的消化分離多采用胰蛋白酶，作用極強(qiáng)，其不僅可分解組織間蛋白亦對細(xì)胞膜蛋白甚至胞內(nèi)的微管微絲均有很強(qiáng)的破壞作用，容易造成心肌細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞活力和自主搏動[15]；而 II 型膠原酶特異性水解心肌細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維，作用緩和，對心肌細(xì)胞幾乎沒有損傷。因此，在本實驗中采用了0.12%的 II 型膠原酶而非胰蛋白酶作為消化液，盡可能減少對心肌細(xì)胞的損害。在消化過程中采取37℃搖床控時多次消化模式，搖床可使織塊與消化液充分接觸，時間到達(dá)15 min后將已消化下來的細(xì)胞懸液先吸出終止消化，防止酶的過度消化對細(xì)胞的損傷；通過控時及多次消化以獲得數(shù)量足夠且保證活力的原代心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，此方法獲得的原代心肌細(xì)胞存活率為(93.3±1.4)%。同時，24 h便可見到部分細(xì)胞自發(fā)搏動，此后幾天，細(xì)胞自發(fā)搏動頻率增加且趨于同步化，說明細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷小，“合胞體”特性保存完整。

純化多采用差速貼壁，即利用成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更早更易貼壁而將兩者分離開來。但是成纖維細(xì)胞的貼壁速度和時間比較難掌握，受組織消化程度影響大，有時甚至需要二次貼壁來提高心肌細(xì)胞純度[16]，耗時費力。本研究亦顯示，從取心開始計算至獲得可接種的原代心肌細(xì)胞止，傳統(tǒng)差速貼壁法較改良法所需時間明顯增加。而若有過多成纖維細(xì)胞殘存，因其增殖旺盛將對心肌細(xì)胞產(chǎn)生密度抑制，更不益于后者生長。改良法利用心肌細(xì)胞比非心肌細(xì)胞(主要為成纖維、平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞等)比重大，密度梯度離心后各類細(xì)胞出現(xiàn)在不同的細(xì)胞層帶將之分離。Percoll 是一種擴(kuò)散系數(shù)低、密度梯度穩(wěn)定、直徑在15～30 nm的乙烯吡咯烷酮硅膠顆?；鞈乙?，對細(xì)胞無毒害，已被廣泛用于中性粒細(xì)胞[17]、衛(wèi)星細(xì)胞[18]、神經(jīng)突觸小體[19]等的分離制備。在本實驗中，Percoll密度梯度離心得到的上層細(xì)胞帶(低密度Percoll液上面)主要是成纖維細(xì)胞，少量內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞；低密度Percoll液部分主要含有各種干細(xì)胞、不成熟的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞；下層細(xì)胞帶(低密度與高密度Percoll液之間)即主要為原代心肌細(xì)胞。為進(jìn)一步減少成纖維細(xì)胞比例保證心肌細(xì)胞純度，在Percoll 密度梯度離心純化到心肌細(xì)胞后，將其培養(yǎng)在含100 μmol/L 5-BrdU的培養(yǎng)基中，利用BrdU替代胸腺嘧啶核苷酸摻入DNA中，阻止成纖維細(xì)胞增殖生長而進(jìn)一步純化心肌細(xì)胞的。結(jié)果顯示，較之傳統(tǒng)差速貼壁法，Percoll 密度梯度離心結(jié)合化學(xué)抑制分離純化得到的原代心肌細(xì)胞純度明顯增高(P<0.05)。

原代心肌細(xì)胞在分離純化過程中極易受到各種理化因素的損傷，但自我修復(fù)能力有限，無疑增加了貼壁難度。因此，不少研究者嘗試在鋪板前用纖連蛋白、層粘連蛋白或明膠等[20]包被培養(yǎng)皿促進(jìn)心肌細(xì)胞貼壁。本實驗中采用豬皮膠原纖維來源的 0.3%的明膠預(yù)處理培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁良好。

綜上，相比傳統(tǒng)差速貼壁法， Percoll 密度梯度離心+5-BrdU化學(xué)抑制結(jié)合培養(yǎng)基改良，分離培養(yǎng)新生大鼠原代心肌細(xì)胞的方法簡便、省時，心肌細(xì)胞純度高、活力好，結(jié)構(gòu)和功能保存完整，完全可滿足實驗的需求，是一種快速、便捷、重復(fù)性好的原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，為今后心血管疾病基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提供了理想的體外模型。