辣木葉對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響*

孫 楊， 趙 燦， 劉媛媛， 隋月林， 朱建忠

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室， 河北 滄州 061000)

糖尿病是以高血糖為顯著特征的代謝性疾病，被認(rèn)為是較為普遍的一種慢性疾病[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，截止到2015年，全球糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到了4.15億，其中我國糖尿病患者為1.096億，居于世界首位，并且糖尿病患者正呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[2，3]。糖尿病患者普遍存在一定程度的認(rèn)知功能障礙，臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力下降，從植物中提取的有效成分如姜黃素、紅景天多糖、小檗堿等制備成制劑廣泛應(yīng)用于臨床用于改善糖尿病患者認(rèn)知功能障礙。因此，對(duì)于從植物中開發(fā)降糖類活性成分仍是目前研究的熱點(diǎn)。

辣木(MoringaoleiferaLam.)為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，原產(chǎn)于印度，廣泛分布于我國廣東、臺(tái)灣、云南等省份[4，5]。辣木的根、葉和嫩果均可食用，是我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為新型中國國家新資源食品[6]。其含有的多種化學(xué)成分如總黃酮類、多糖類、綠原酸和辣木蛋白類成分均顯示出了很好的降低血糖的作用[7]?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實(shí)，其降低血糖的作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、改善胰島功能、抗炎及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等相關(guān)[8]。由辣木單獨(dú)入藥制成膠囊用于降血糖、血脂，預(yù)防心腦血管疾病。辣木作為君藥與人參、陳皮和阿膠等組方制成辣木膠囊用于改善人體免疫力，提高機(jī)體體能?，F(xiàn)代研究還進(jìn)一步證實(shí)辣木在抗菌、抗腫瘤、保護(hù)肝腎功能、延緩老年癡呆癥等方面效果顯著[9，10]。多項(xiàng)研究證實(shí)辣木能改善大鼠認(rèn)知功能，有良好的神經(jīng)保護(hù)作用[11，12]。但是對(duì)于辣木在糖尿病大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力改善方面，以及糖尿病腦病防治中目前尚未有深入研究。本文以辣木葉治療經(jīng)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙，觀察其作用效果及探討可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為改善糖尿病認(rèn)知功能損傷提供參考。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物

健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(220±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證為醫(yī)動(dòng)字第04057號(hào)。飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校動(dòng)物科學(xué)學(xué)院。飼養(yǎng)條件：大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，保持室內(nèi)溫度20 ～ 24℃，相對(duì)濕度維持在40% ～ 50%，試驗(yàn)前將大鼠在動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

辣木粉，棕色粉末，主要成分為辣木多糖(約為98 mg/g)和總黃酮類(約為250 mg/g)。購自于成都辣木科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：20180311)，以原藥材量計(jì)1 g提取物相當(dāng)于3.2 g原生藥。辣木粉黃酮采用氯化鋁法進(jìn)行含量測定，將辣木粉用乙醇溶解，超聲法提取，超聲液經(jīng)離心，吸取上清液過濾。辣木粉多糖采用苯酚-濃硫酸法進(jìn)行含量測定，將辣木粉加水溶解，加入苯酚，濃硫酸顯色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品含量。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；Western blotting化學(xué)發(fā)光免疫印跡法細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白I抗及免疫組織化學(xué)I抗(Bax、Bcl-2和caspase-3)均購自Santa Cruz公司；IL-6及TNF-α檢測試劑盒購自ebioscience公司；牛血清白蛋白(BSA)購自康朗生物；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自sigma公司；HGM-111血糖儀(歐姆龍)；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Morris水迷宮及分析軟件(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所)；超聲勻漿機(jī)購自上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司。SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 糖尿病大鼠模型建立及分組

選取50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)選取10只大鼠作為對(duì)照組，40只造模組大鼠禁食不禁水16 h后，采用給予腹腔注射25 mg/kg STZ(以pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配成0.25%濃度)72 h后尾靜脈采血，以兩次隨機(jī)血糖均值≥16.67 mmol/L糖尿病造模成功。其余10只大鼠給予灌胃給藥同等劑量緩沖液。選取造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、辣木葉低劑量組、辣木葉中劑量組和辣木葉高劑量組，每組各10只。分別給予低、中、高劑量組每日灌胃給藥2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg辣木葉，對(duì)照組和模型組給予每日灌胃給藥等量生理鹽水。每日給藥1次，連續(xù)持續(xù)給藥8周。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

先將大鼠放入水池中(不放平臺(tái))自由游泳5 min以熟悉迷宮環(huán)境。水迷宮呈圓形，直徑為1.5 m，平臺(tái)直徑12 cm，水深30 cm。池水每天更換，水池溫度維持在21～24℃。訓(xùn)練或測定時(shí)大鼠頭朝池壁，根據(jù)標(biāo)記點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，選擇一個(gè)象限放置圓形平臺(tái)。記錄大鼠爬到平臺(tái)時(shí)間，若大鼠在120 s內(nèi)未能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)，放置30 s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。每只大鼠每天實(shí)驗(yàn)1次，共進(jìn)行5 d，數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄各大鼠的搜索到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間或稱潛伏期和搜索平臺(tái)的策略。

1.5 血糖及胰島素檢測

大鼠血糖含量采用HGM-111血糖儀進(jìn)行測定，放射免疫法測定血清中胰島素含量。

1.6 炎癥因子指標(biāo)檢測

采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)方法(ELISA)測定各組大鼠海馬組織中TNF-α及IL-6含量及蛋白表達(dá)水平。操作為：各組大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉，分離海馬組織迅速冷藏備用。檢測時(shí)將海馬組織裂解后，經(jīng)過4℃離心10 min，吸取上清液，采用ELISA測定各組大鼠海馬組織TNF-α及IL-6含量，酶標(biāo)儀在450 nm波長處測OD值。

1.7 免疫組化指標(biāo)檢測

分別取大鼠腦組織(對(duì)照組、模型組、辣木劑量組)，置于10%甲醛中固定，采用常規(guī)石蠟包埋，3%氧化氫甲醇溶液阻斷10 min，高壓修復(fù)2 min，用HE染色，以及免疫組化染色對(duì)切片進(jìn)行染色，分別在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)病理改變的情況，隨機(jī)選擇5～10個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞均數(shù)，作為凋亡神經(jīng)元的密度。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)

采用Western blot免疫印跡法檢測大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表達(dá)情況。取出大鼠海馬組織后，加入蛋白質(zhì)裂解液處理各組樣品，使用超聲破碎儀低溫裂解3次，每次30 s，4℃， 12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白含量。用10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分離蛋白，濃縮膠為5%，蛋白質(zhì)變性，SDS-聚丙酰胺電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(NC)上。取出膜后，封閉在3%牛血清白蛋白(BSA)-Tris-Hcl緩沖液(TBST)中，放在搖床上60 min。將NC膜與I抗結(jié)合(Bax，1∶400、Bcl-2，1∶250和caspase-3，1∶600)置于4℃冰箱過夜，棄掉一抗，洗膜3次，每次5 min。向膜上加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)5 min，膠片感光成像，凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶。用β-actin抗體作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照，計(jì)算相對(duì)灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 辣木葉對(duì)糖尿病大鼠血糖及胰島素的影響

對(duì)照組大鼠試驗(yàn)前后血糖水平維持正常，無顯著變化。造模組大鼠在經(jīng)過建模后血糖水平有顯著提升(P<0.01)，大鼠明顯表現(xiàn)為多飲、多尿、多食，毛色灰黃，精神萎靡，行動(dòng)緩慢，一般狀況差，表明糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功；造模后大鼠血胰島素明顯低于正常組大鼠(P<0.05)。給予不同劑量辣木治療8周后，與模型組相比較，辣木不同劑量組血糖顯著降低(P<0.05)，辣木中、高劑量組的血胰島素明顯升高(P<0.05，P<0.01)。不同劑量辣木組間比較，給藥后三組大鼠血糖及血胰島素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of horseradish on blood glucose and insulin in diabetic rats n=10)

2.2 辣木葉對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的第1～2日，各組間逃避潛伏期(逃逸時(shí)間)無顯著性差異(P>0.05)。從第3日開始，與對(duì)照組相比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；與模型組相比較，辣木組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；第4～5日，與模型組相比較，辣木組潛伏期均明顯縮短(P<0.05)；不同辣木劑量組組間進(jìn)行比較，無顯著性差異(P>0.05)。空間探索實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短(P<0.01)；與模型組相比較，辣木不同劑量組目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(P<0.05)，不同辣木劑量組組間進(jìn)行比較，無顯著性差異(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of escape latency and target quadrant stay time in Morris water maze experiment of each group n=10)

2.3 辣木葉對(duì)大鼠炎癥因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比較，模型組大鼠TNF-α、IL-6含量和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，辣木低、中、高劑量組TNF-α、IL-6含量及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。不同辣木劑量組組間進(jìn)行比較，無顯著性差異(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of TNF-α, IL-6 contents and protein expression levels in hippocampus of rats n=10)

2.4 辣木葉對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的影響

大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞中的Bax、caspase-3及Bcl-2經(jīng)過免疫組化染色后，陽性表達(dá)定位在神經(jīng)細(xì)胞漿，強(qiáng)陽性，呈現(xiàn)棕黃色，粗顆粒狀。中陽性及弱陽性顆粒依次變細(xì)，顏色由黃色向淺黃色轉(zhuǎn)變。三組Bcl-2顯示中陽性表達(dá)，呈現(xiàn)棕黃色，顆粒細(xì)。對(duì)照組弱陽性表達(dá)，呈現(xiàn)淺黃色，顆粒分布細(xì)。與對(duì)照組相比較，模型組強(qiáng)陽性表達(dá)，顏色棕黃色，顆粒粗；與模型組性比較，辣木中劑量組中陽性表達(dá)，呈棕黃色，細(xì)顆粒狀，見圖1。同時(shí)切片于鏡下計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)，與對(duì)照組相比(9.85±1.47)，模型組(86.92±11.23)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，辣木葉中劑量組(53.21± 7.19)能顯著減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)目(P< 0.01)，提示辣木葉能緩解大鼠海馬CA1區(qū)的損傷。

Fig. 1 Immunohistochemical results of Bax, caspase-3 and Bcl-2

2.5 辣木葉對(duì)大鼠海馬組織蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果，與對(duì)照組相比較，模型組與辣木組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)；模型組大鼠海馬組織中Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)，Bax/Bcl-2比例顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比較，辣木組中劑量組(4.0 g/kg)對(duì)大鼠海馬組織中Bax、caspase-3的蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2比例顯著降低(P<0.05，P< 0.05，P<0.01，表4，圖2)。

Tab. 4 Effect of Moringa oleifera leaves on protein expression in hippocampus of rats n=10)

Fig. 2 Expressions of hippocampal related proteins in each group

3 討論

糖尿病是一種常見的代謝紊亂疾病，以胰島素分泌或作用缺陷為主要特征，表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)和記憶能力減退，也是被認(rèn)為是誘導(dǎo)老年癡呆的危險(xiǎn)因素[13]。目前糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制研究尚未完全明確，臨床上認(rèn)為引起認(rèn)知功能障礙及癡呆的病理基礎(chǔ)與神經(jīng)細(xì)胞變性，凋亡導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，腦內(nèi)糖皮質(zhì)激素改變及腦血管遞質(zhì)改變等因素密切相關(guān)[14]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)STZ腹腔注射糖尿病模型大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙，與模型組相比，經(jīng)過給予不同劑量的辣木葉提取物發(fā)現(xiàn)治療的大鼠顯著縮短了尋找隱藏平臺(tái)的時(shí)間和路程，提示辣木葉能以有效地緩解糖尿病大鼠記憶能力損傷，改善糖尿病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬是構(gòu)成記憶回路中的重要結(jié)構(gòu)，承載機(jī)體認(rèn)知功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在學(xué)習(xí)、記憶和內(nèi)臟活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，海馬組織結(jié)構(gòu)和功能的異常會(huì)直接影響到糖尿病的認(rèn)知功能。另有研究表明，糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制可能與激活海馬神經(jīng)元凋亡體系，導(dǎo)致其自身病理性損傷，以及IGFIR、TRPC3等在內(nèi)多條信號(hào)通路調(diào)控等因素關(guān)系密切[15]。本研究進(jìn)一步觀察大鼠海馬區(qū)錐形神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬區(qū)錐形神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、體積變小、排列紊亂，且神經(jīng)元細(xì)胞密度明顯降低。經(jīng)辣木葉作用后其神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，提示辣木葉能緩解大鼠海馬CA1區(qū)的損傷。

糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及到一系列復(fù)雜的基因調(diào)控，它可以通過不同信號(hào)傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號(hào)，引起細(xì)胞凋亡[16]。調(diào)控凋亡基因主要是Bcl-2基因家族，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2基因按功能可分為兩類一類是Bcl-2具有抑制凋亡作用如Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1等，另一類是具有促進(jìn)凋亡作用如Bcl-Xs、Bax、Bid等。Bcl-2與Bax表達(dá)水平平衡是決定細(xì)胞存活的重要因素，Bcl-2可以抑制由多種細(xì)胞毒因素所引起的細(xì)胞死亡，Bax過多時(shí)促進(jìn)細(xì)胞死亡[17]。本研究檢測了大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax基因的表達(dá)，結(jié)果Bcl-2蛋白表達(dá)水平無明顯變化。與對(duì)照組相比，模型組中Bax基因顯著升高，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比例升高。結(jié)果提示，辣木葉通過調(diào)節(jié)Bax的表達(dá)，上調(diào)Bax/Bcl-2比例從而促使海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分，一旦被激活凋亡常常難以避免，該酶是否被激活是鑒別細(xì)胞凋亡與壞死的依據(jù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)辣木葉作用海馬組織中caspase-3的蛋白水平顯著降低，提示辣木葉調(diào)節(jié)糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙作用通路可能與降低caspase-3的蛋白水平相關(guān)。

炎癥反應(yīng)與癡呆、卒中后抑郁認(rèn)知功能障礙等許多神經(jīng)系統(tǒng)病變都存在著聯(lián)系，細(xì)胞因子炎癥特異性標(biāo)志物是已經(jīng)被證實(shí)為神經(jīng)退化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的重要介質(zhì)[19]。TNF-α為巨噬細(xì)胞分泌的小分子蛋白，是直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，其參與了細(xì)胞的死亡、激活、分化和增殖[20]。IL-6為一種細(xì)胞因子能刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能，也是胰島素抵抗和心腦血管疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，具有神經(jīng)變性和神經(jīng)保護(hù)雙重作用[21]。TNF-α和IL-6可通過抑制胰島素受體絡(luò)氨酸激酶活性，降低胰島素依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子Glut4的表達(dá)，引起外周組織中胰島素抵抗。本研究結(jié)果表明，辣木能夠顯著降低糖尿病大鼠海馬炎癥因子含量及蛋白質(zhì)表達(dá)，辣木具有明顯的抗炎作用。

綜上所述，辣木葉能明顯改善STZ所致糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙，降低糖尿病大鼠血糖水平，減少海馬組織炎癥因子TNF-α及IL-6含量及蛋白表達(dá)。辣木葉在改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙方面作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax/Bcl-2比例，充分激活caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。