低氧聯(lián)合LPS刺激對星形膠質(zhì)細胞中炎性因子和BNIP3表達的影響*

丁利平， 韓 瑩， 成 祥， 趙 彤， 朱玲玲,3△， 廖 紅△

(1. 中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院， 南京 210009; 2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認知與腦科學(xué)研究所， 北京 100850; 3. 江蘇省神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心， 南京 210009)

高原環(huán)境由于缺氧可導(dǎo)致平原人進入高原地區(qū)，不能適應(yīng)高原環(huán)境，發(fā)生高原地區(qū)的特有疾病，即急性高原病[1]。急性高原病嚴重時可進一步發(fā)展成急性腦水腫，進而威脅生命。近年來越來越多的研究顯示炎癥在加重高原低氧腦水腫和肺水腫中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理，隨后進行高原低氧暴露，可導(dǎo)致小鼠發(fā)生腦水腫[2]。通常，急進海拔 4 000 m以上地區(qū)高原腦水腫發(fā)生率明顯增加，在海拔4 000 m至5 000 m地區(qū)的發(fā)生率是0.5%～ 1.0%[3]。而據(jù)報道發(fā)生胃腸道或呼吸道感染后進入高原地區(qū)的人群更易患急性高山病[4]。血腦屏障的破壞被認為是引起腦水腫的重要因素。星形膠質(zhì)細胞的終足結(jié)構(gòu)是血腦屏障的組成成分。LPS是多數(shù)革蘭氏陰性菌細胞壁的成分，由類脂A,核心寡糖和O-抗原組成[5]。LPS可以刺激星形膠質(zhì)細胞，通過細胞膜上的Toll樣受體，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。然而，低氧調(diào)節(jié)腦炎癥反應(yīng)的分子機制尚待闡明。

當(dāng)機體處于低氧環(huán)境時，通過上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的表達，對低氧做出適應(yīng)性反應(yīng)。BNIP3(Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3)屬于Bcl-2家族中BH3-only蛋白，主要位于線粒體外膜上，是低氧誘導(dǎo)因子-1ɑ(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的靶基因之一。低氧時，HIF-1α誘導(dǎo)BNIP3的表達。BNIP3參與許多疾病的病理過程，如癌癥和缺血性疾病[7]。低氧能調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]。但是，目前關(guān)于BNIP3在星型膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)中的表達和作用的研究還未見報道。本研究利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，觀察在低氧聯(lián)合LPS刺激時，星形膠質(zhì)細胞中BNIP3和炎性因子的表達規(guī)律。旨在為高原腦損傷的病理機制提供一些新的認識。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰酶(Hyclone公司)，胎牛血清(Ausbian公司)，BNIP3抗體(Abcam公司)，Hif-1α抗體(Gentex公司)，β-actin抗體和LPS (Sigma公司),小鼠ELISA炎癥細胞因子檢測試劑盒(欣博盛公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)，SYBR Green試劑(Roche公司)，ECL發(fā)光液(Bio-Rad公司)，熒光實時定量PCR儀(Roche公司)。

1.2 原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)

用75%乙醇消毒出生24 h內(nèi)的C57乳鼠(由斯貝福公司提供)，斷頭，分離腦組織，在顯微鏡下去除腦膜和血管，分離出皮層，剪碎至約1 mm大小，加入0.25%胰酶消化，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，重懸，濾網(wǎng)過濾后，接種到T25細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液。以后每隔 3 d 換 1 次液，培養(yǎng)7 d，觀察到大多數(shù)的細胞融合成片，細胞折光性較差。將培養(yǎng)瓶置于搖床上，180 r/min，12 h，除去小膠質(zhì)細胞。0.25%胰酶消化，離心，重懸，接種，將細胞分組，進行實驗。

1.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)

取孕期 18 d C57小鼠(由斯貝福公司提供)，麻醉后，打開腹腔，分離胚胎置于分離解剖液中。分離皮層，加入0.25%胰酶消化。用10%含胎牛血清的DMEM /F12培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)，按 1×106cells/cm2細胞接種到多聚賴氨酸預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換 Neurobasal /B27 培養(yǎng)基，每隔3 d 換1/2液。培養(yǎng)7 d后，觀察細胞形態(tài)，用于實驗。

1.4 實驗分組

實驗分為：常氧組，LPS組，低氧組和LPS+低氧組。LPS處理后，低氧組和LPS+低氧組放入低壓低氧細胞孵箱， LPS組和常氧組放入正常的細胞孵箱。LPS濃度：100 ng/ml，氧氣濃度為0.3%。處理時間如表2、3、4和5注釋所示。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5 Western blot法檢測原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞BNIP3蛋白表達

用PBS漂洗細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解，離心2 700 r/min,4 min，提取總蛋白質(zhì)。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白。120 V，90 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶和相應(yīng)的一抗放在抗體盒中，4℃孵育過夜。使用的抗體有抗BNIP3 抗體(1∶1 000)，抗HIF-1α抗體(1∶1 000)和抗β-actin 抗體 (1∶10 000)。過夜孵育后，用TBST洗滌3次，每次10 min。用相應(yīng)的二抗(1∶10 000) 室溫孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min。ECL 法進行顯色,β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 RT-PCR檢測原代星形膠質(zhì)細胞炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA表達

收集上述各組處理后的細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，其OD260/280在1.8～2.2。根據(jù)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。TNF-α，IL-1β和IL-6的引物序列(由上海生工生物工程公司合成)見表1。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃15 s、56℃ 20 s、72℃ 30 s共循環(huán)39次。以β-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT法計算TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA相對表達水平。

Tab. 1 Gene primer sequences of TNF-α, IL-1β, IL-6 and β-actin

1.7 ELISA檢測原代星形膠質(zhì)細胞炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA分泌變化

收集上述各組細胞上清液，用ELISA法檢測上清中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的水平。具體方法參照試劑盒操作說明。使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧或聯(lián)合LPS處理對星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子表達的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對星形膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA的表達均影響顯著(P<0.01)；低氧處理對星形膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子TNF-α的表達影響不顯著(P>0.05)，對IL-1β和IL-6mRNA的表達影響顯著(P<0.01)。在對IL-1β和IL-6mRNA的表達方面，LPS刺激和低氧處理兩個因素交互作用明顯(P<0.05，P<0.01)。組間兩兩分析結(jié)果如表2所示：與常氧組比較，LPS組和LPS+低氧組的炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+低氧組炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA水平進一步升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明低氧能夠增強LPS刺激后星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)。

Tab. 2 The expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA in primary astrocytes n=3)

2.2 低氧或聯(lián)合LPS對星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子分泌的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對星形膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子TNF-α，和IL-6的分泌變化影響顯著(P<0.01)；對IL-1β的分泌變化影響不顯著(P>0.05)低氧處理對星形膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的分泌變化影響均不顯著(P>0.05)。在對TNF-α，IL-1β和IL-6分泌變化方面，LPS刺激和低氧處理兩個因素交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表3所示：在星形膠質(zhì)細胞中，與常氧組比較，LPS組和LPS+低氧組的炎癥因子TNF-α和IL-6分泌水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IL-1β分泌沒有變化，低氧組TNF-α，IL-1β和IL-6分泌水平均沒有變化，與LPS組比較，LPS+低氧組炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6分泌水平均沒有明顯變化。實驗結(jié)果提示LPS刺激能使星形膠質(zhì)細胞分泌的TNF-α和IL-6增加，但LPS和低氧聯(lián)合作用未能使其增加更明顯。

Tab. 3 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 inthe medium of primary cultured astrocytes (pg/ml, n=3)

2.3 低氧或聯(lián)合LPS對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中BNIP3表達的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中BNIP3的表達影響不顯著(P> 0.05)。低氧處理對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中BNIP3的表達均影響顯著(P<0.01)；兩個因素間的交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表4所示：在星形膠質(zhì)細胞中，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達沒有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達明顯增加(P<0.01)；在神經(jīng)元中，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達沒有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與神經(jīng)元的低氧組比較，星形膠質(zhì)細胞的低氧組BNIP3的表達顯著增加(P<0.01，圖1，表4)。結(jié)果說明星形膠質(zhì)細胞中BNIP3對低氧反應(yīng)更敏感。

Fig. 1 Expressions of BNIP3 in primary astrocytes and neurons

Tab. 4 Relative expression of BNIP3 in primary astrocytes and neurons n=3)

2.4 低氧或聯(lián)合LPS對星形膠質(zhì)細胞中BNIP3表達的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對6 h和12 h時間點星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達影響顯著(P<0.01)，對24 h時間點星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達影響不顯著(P>0.05)；低氧處理對3個時間點星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達影響均顯著(P<0.01)；兩個因素對6 h和12 h時間點星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達影響的交互作用明顯(P< 0.01)，對24 h時間點星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表5所示：在相同時間點，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達沒有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與低氧組比較，6 h和12 h時間點LPS+低氧組BNIP3的表達顯著增加(P<0.01，圖2，表5)。上述結(jié)果說明炎癥能促進低氧條件下原代星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達，提示BNIP3在星形膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

Fig. 2 Dynamic change of BNIP3 expression in primary astrocytes

3 討論

目前關(guān)于高原腦水腫的具體病理機制尚待闡明。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射 LPS聯(lián)合高原低氧暴露能夠加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和細胞的損傷，加重腦水腫的發(fā)生和發(fā)展[2]。據(jù)報道腦組織缺血缺氧后星形膠質(zhì)細胞被活化[9]。大鼠進行低氧暴露(8 000 m,8 h)后，星形膠質(zhì)足突出現(xiàn)腫脹，腦組織出現(xiàn)水腫[10]。上述研究表明星形膠質(zhì)細胞在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。當(dāng)下關(guān)于低氧下星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制并不清楚。白瑜珊等研究發(fā)現(xiàn)低氧增強巨噬細胞中脂多糖誘導(dǎo)的IL-1β表達[11]。Gessi S等發(fā)現(xiàn)LPS刺激聯(lián)合低氧(1%)作用后，星形膠質(zhì)細胞中HIF-1α的蛋白表達增加，其下游的基因iNOS和AB2受體在復(fù)合作用下增加明顯[12]。與本文的研究結(jié)果相符，LPS和低氧聯(lián)合作用使星形膠質(zhì)細胞的炎癥因子IL-1β和IL-6表達明顯增加。當(dāng)機體處于低氧環(huán)境時，低氧誘導(dǎo)因子-1(hif-1)的降解被抑制，hif-1與BNIP3啟動子上的低氧反應(yīng)原件(hypoxic responsive element，HRE)結(jié)合，激活BNIP3的轉(zhuǎn)錄。BNIP3作為Bcl-2家族的一員，主要包含以下幾個功能結(jié)構(gòu)域：(1)PEST結(jié)構(gòu)域，參與BNIP3的降解；(2)BH3結(jié)構(gòu)域，參與BNIP3介導(dǎo)的caspase凋亡途徑和自噬；(3)跨膜結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐NIP3定位至線粒體外膜和發(fā)揮促凋亡作用是必不可少的，跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失不能誘導(dǎo)細胞死亡[13]。BNIP3 有著雙重作用，既可以促進細胞凋亡或壞死，也可以介導(dǎo)線粒體自噬，促進細胞存活。

Tab. 5 Relative expression of BNIP3 in primary astrocytes at different time n=3)

目前關(guān)于低氧下星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達的研究報道較少。TorronterasR等研究發(fā)現(xiàn)在1%O2處理6 h后，人的星形膠質(zhì)細胞中HIF-1ɑ穩(wěn)定表達，從而其下游靶基因BNIP3表達增加，促進細胞存活和發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但具體的作用機制不明[14]。而何芳等實驗表明在氧糖剝奪/復(fù)氧模型中，膠質(zhì)細胞系C6細胞的BNIP3表達增加，介導(dǎo)細胞凋亡[15]。本研究通過體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)BNIP3在這兩種細胞中都有表達，且低氧后細胞中BNIP3表達均增加，與文獻報道一致。黃廣海等實驗發(fā)現(xiàn)在腦缺血3 h和9 h時，BNIP3表達升高，線粒體自噬被激活，隨著缺血時間延長至24 h，BNIP3表達降低，線粒體自噬被抑制，腦梗死體積增大，說明在腦缺血早期，BNIP3可能通過線粒體自噬起到保護作用[16]。BNIP3可以通caspase凋亡途徑，線粒體膜電位的丟失，線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的開放，細胞色素C的釋放等方式介導(dǎo)細胞死亡[13]。線粒體自噬是指以自噬的方式清除細胞內(nèi)損傷的或不需要的線粒體，維持線粒體的動態(tài)平衡。借助結(jié)構(gòu)中LC3 相互作用結(jié)構(gòu)域(LC3-interaction region，LIR)，BNIP3與自噬體外膜上的微管相關(guān)蛋白 1-輕鏈 3(microtubule- associated protein1 light chain 3，LC3)結(jié)合，組成線粒體和自噬體的復(fù)合物，再與溶酶體結(jié)合，線粒體被降解[17]。BNIP3也可以與 Bcl-2 競爭性結(jié)合，釋放出Beclin-1，引起線粒體自噬。 Hong等研究發(fā)現(xiàn)黃體酮通過提高星形膠質(zhì)細胞自噬水平抑制Aβ誘導(dǎo)的炎癥[18]。而Periyasamy P等研究表明可卡因通過誘導(dǎo)自噬，激活人星形膠質(zhì)細胞[19]。LPS刺激(1 μg/ml)24 h也能引起星形膠質(zhì)細胞過度自噬，介導(dǎo)細胞死亡[20]。上述結(jié)果提示在缺血缺氧或氧糖剝奪模型中， BNIP3表達的升高可以直接誘導(dǎo)細胞凋亡，也可以激活自噬，介導(dǎo)細胞存活或死亡作用。而在不同的處理條件下，星形膠質(zhì)細胞的自噬對細胞的作用也不盡相同。該研究發(fā)現(xiàn)低氧后BNIP3的表達在星形膠質(zhì)細胞中增加更加明顯；LPS聯(lián)合低氧刺激后星形膠質(zhì)細胞中BNIP3的表達較單純低氧組明顯增加。該結(jié)果提示BNIP3在星形膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激聯(lián)合低氧作用較單一處理使星形膠質(zhì)細胞的BNIP3表達進一步增加，說明LPS可能參與調(diào)控低氧下BNIP3的表達。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)低氧聯(lián)合LPS刺激聯(lián)合低氧增強星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)。該結(jié)果表明BNIP3可能參與星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控。接下來我們將研究BNIP3的表達變化對星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)的作用及其可能機制。通過敲低或過表達星形膠質(zhì)細胞中的BNIP3，觀察在低氧聯(lián)合LPS刺激條件下星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，存活和線粒體自噬變化，發(fā)現(xiàn)BNIP3調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)可能的機制,為星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制，提供一些新的認識。