• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究

    2019-10-16 02:40:46鄧霞鐘惠蘭
    中國美容醫(yī)學(xué) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:改良法

    鄧霞 鐘惠蘭

    [摘要]目的:研究經(jīng)改良法處理后的人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性。方法:分別使用傳統(tǒng)方法與改良方法脫去健康人皮膚的細(xì)胞成分,觀察兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的外觀、HE染色結(jié)果、脫細(xì)胞效率、膠原纖維的完整度、體外降解時(shí)間、孔隙率、孔腔直徑、細(xì)胞毒性及體外細(xì)胞相容性,并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果:改良法制備的脫細(xì)胞真皮柔韌度更好,塑形性更高;經(jīng)HE染色后,改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維較傳統(tǒng)方法更為纖細(xì);改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性。經(jīng)改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層,且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,而傳統(tǒng)方法制備的脫細(xì)胞真皮無明顯浸潤現(xiàn)象。結(jié)論:改良方法不僅操作簡單,且制備的脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果較好,無細(xì)胞毒性,體外相容性更佳。

    [關(guān)鍵詞]脫細(xì)胞真皮;相容性;改良法;體外細(xì)胞;孔隙率

    [中圖分類號(hào)]R329.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455(2019)10-0102-03

    Abstract: Objective? To study the acellular effect of human acellular dermis treated by modified method and its compatibility with cells in vitro. Methods The appearance, HE staining results, acellular efficiency, integrity of collagen fibers, degradation time in vitro, porosity, pore diameter, cytotoxicity and cytocompatibility of acellular dermis prepared by the two methods were observed and compared. Results? The modified acellular dermis had better flexibility and higher plasticity. After HE staining, the improved acellular dermis had uniform pore, loose structure and finer collagen fibers than the traditional method. The porosity and pore diameter of the acellular dermis prepared by the improved method were better than the traditional method, and the difference between the two groups was significant (P<0.05). There was no significant difference in basal pore diameter and degradation time in vitro (P>0.05). The acellular dermis prepared by the improved method showed no cytotoxicity within 8 days. Stem cells infiltrated the basal layer of the acellular dermis prepared by the improved method, and the infiltration range increased with time, and the number of cells increased significantly. However, the acellular dermis prepared by the traditional method had no obvious infiltration. Conclusion? The modified method is not only simple in operation, but also has better acellular effect, no cytotoxicity and better compatibility in vitro.

    Key words: acellular dermis; compatibility; improved method; in vitro cell; porosity

    無論是天然牙還是種植牙,牙齦缺損、過窄或過薄,都對(duì)美觀性產(chǎn)生影響,且不利于牙周健康。而脫細(xì)胞真皮是一種很好的牙齦替代物,能夠修復(fù)或重建天然牙、種植牙及義齒周圍牙齦的寬度及厚度[1],幫助患者重新恢復(fù)功能及美觀性。脫細(xì)胞真皮是一種僅具有真皮基質(zhì),且完整保留了細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及形態(tài)、成分及基底膜等,為種子細(xì)胞的生長與分化提供所需環(huán)境的理想的支架材料[2]。脫細(xì)胞真皮能夠?qū)⒐w皮膚中易引起排斥反應(yīng)的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等成分脫出,僅保存完整的低抗原性細(xì)胞外基質(zhì)成分,且其獨(dú)有的三維結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了一個(gè)生長代謝的立體框架,使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白能促進(jìn)表皮細(xì)胞的附著與增生,促進(jìn)細(xì)胞相容性,使組織的生理性修復(fù)得到完成[3]。研究顯示,脫細(xì)胞真皮具有良好的生物相容性、極低的抗原性、快速血管化及較高穩(wěn)定性的特點(diǎn)[4],能夠促進(jìn)機(jī)體表皮的再生及修復(fù)[5]。生物相容性是生物材料貫穿始終的主題,對(duì)生物醫(yī)用材料而言,脫細(xì)胞真皮的生物相容性直接決定了材料的應(yīng)用效果。脂肪干細(xì)胞是組織工程中廣泛應(yīng)用的一種種子細(xì)胞[6]。Ribeiro等使用異種脫細(xì)胞真皮對(duì)拔牙后的軟組織創(chuàng)面進(jìn)行修補(bǔ),取得良好效果[7]。Basegmez等研究結(jié)果顯示,脫細(xì)胞真皮不僅不影響種植體與骨的結(jié)合,且手術(shù)創(chuàng)傷小、修復(fù)效果及美觀性良好[8]。但現(xiàn)有的脫細(xì)胞真皮方法復(fù)雜,且盡管去除了毛發(fā)、腺體、血管后,殘留有部分腔隙,但是孔隙率仍較低,細(xì)胞滲透性差,影響宿主細(xì)胞及血管的生長。本次實(shí)驗(yàn)采用改良方法進(jìn)行脫細(xì)胞真皮的制備,并將傳統(tǒng)方法與改良方法制備的脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及體外細(xì)胞相容性進(jìn)行對(duì)比,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

    1? 材料和方法

    1.1 材料:選取本院整形外科行常規(guī)皮膚移植術(shù)后多余的臀部皮膚組織作為皮膚樣本,入選者年齡24~44歲,均無傳染性疾病及皮膚病變等。本次研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 方法

    1.2.1 脫細(xì)胞真皮的制備[9]:①傳統(tǒng)法:無菌狀態(tài)下將所選皮膚組織的皮下脂肪減除,放入1mol/L的氯化鈉溶液(上海玉博生物科技有限公司)中37℃作用24h,然后除去表皮,放入2%的氫氧化鈉溶液中37℃進(jìn)行搖床處理16h,使用鏈霉素磷酸鹽緩沖液(PBS,上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)將溶液沖洗至中性。將所得皮片按照-80℃冷凍、37℃水浴箱復(fù)溫、洗滌,反復(fù)凍融4次,每次4h。完成后使用冷凍干燥機(jī)凍干,將所得脫細(xì)胞真皮4℃密封備用;②改良法:將所選皮膚組織的皮下脂肪組織在無菌狀態(tài)下剪除,放入1mol/L的氯化鈉溶液中37℃作用24h將表皮去除,然后放入2%的氫氧化鈉溶液中45℃進(jìn)行搖床處理4h,使用PBS將溶液沖洗至中性。進(jìn)行冷凍干燥后4℃密封備用。

    1.2.2 染色:兩種方法均先使用4%的多聚甲醛固定24h,再用石蠟包埋,然后進(jìn)行切片、HE染色,用樹脂進(jìn)行封片,在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

    1.2.3 性狀檢測:①孔隙率:將脫細(xì)胞真皮冷凍干燥后,進(jìn)行稱重(W1);加入50ml 75%的乙醇離心管,抽真空至不再有氣泡溢出,連同含有乙醇及支架材料的離心管一起進(jìn)行稱重(W2);將含有乙醇支架材料取出,對(duì)剩余的乙醇及離心管稱重(W3);所有稱重結(jié)果均精確至0.001g??紫叮≒)率:P(%)=(W2-W3-W1)/(W2-W3)×100%;②體外降解時(shí)間:稱取冷凍干燥后的脫細(xì)胞真皮0.02g,使用1.0ml膠原酶37℃滴入,記錄消化至液體完全澄清所用時(shí)間;③孔腔直徑:使用3%的戊二醛將脫細(xì)胞真皮固定4℃過夜,然后使用PBS進(jìn)行沖洗,每次10min,連續(xù)3次,使用梯度乙醇+六甲基二硅氨烷脫乙醇進(jìn)行脫水后,進(jìn)行冷凍、干燥、噴金,拍照記錄,使用Image J測量孔隙直徑;④細(xì)胞毒性:參照《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分:體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)》中的方法提取脫細(xì)胞真皮浸潤液。3cm2表面積(雙面)加入1ml RPMI1640+10% FBS培養(yǎng)基,加入二氧化碳培養(yǎng)箱孵育24h后收集浸潤液;體積比0.64%苯酚作為陽性對(duì)照,聚乙烯浸潤液作為陰性對(duì)照,RPMI1640+10% FBS則作為空白對(duì)照;將5×104/ml的P3脂肪干細(xì)胞以100μl接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24h后再以陽性、陰性及空白三組浸潤液以100μl/孔進(jìn)行培養(yǎng),并連續(xù)8d使用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測,每日檢測4孔/組。

    1.3 細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)《非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料生物性能測試標(biāo)準(zhǔn)》中的6級(jí)毒性分級(jí)法進(jìn)行評(píng)定:0級(jí),細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)≥100%;1級(jí),RGR為75%~99%;2級(jí),RGR為50%~74%;3級(jí),RGR為25%~49%;4級(jí),RGR為1%~24%;5級(jí),RGR為0%。評(píng)分在2級(jí)及2級(jí)以上者,說明材料存在細(xì)胞毒性[10]。

    1.4 細(xì)胞相容性:以每孔2×104個(gè)細(xì)胞將P4脂肪干細(xì)胞接種于浸泡過完全培養(yǎng)基48h的脫細(xì)胞真皮中,孵育8d后用甲醛進(jìn)行固定,使用HE染色后觀察兩種脫細(xì)胞真皮上脂肪干細(xì)胞生長及浸潤程度。

    1.5 觀察與評(píng)價(jià)指標(biāo):觀察兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的外觀、染色結(jié)果、孔隙率、孔腔直徑、體外降解時(shí)間及細(xì)胞毒性,并進(jìn)行對(duì)比分析;對(duì)比兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮的體外相容性。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用(x?±s)表示,使用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,使用χ2檢驗(yàn);不同濃度脫細(xì)胞真皮浸潤液及空白對(duì)照吸光度間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2? 結(jié)果

    2.1 外觀比較:兩種方法制備的脫細(xì)胞真皮經(jīng)肉眼觀察顏色無差異,均呈乳白略帶微黃色;但改良法制備的真皮表面可見孔隙,柔韌度更好,塑形性更高,更利于手術(shù)操作。

    2.2 染色結(jié)果比較:經(jīng)HE染色后,兩種脫細(xì)胞真皮細(xì)胞成分均被完全脫去,均未見藍(lán)染細(xì)胞核及殘留,膠原纖維均完整,且較傳統(tǒng)方法,改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維更為纖細(xì)。

    2.3 兩種脫細(xì)胞真皮的孔隙率、孔腔直徑及體外降解時(shí)間比較:改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但改良法脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間與傳統(tǒng)法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    2.4 改良法脫細(xì)胞真皮的細(xì)胞毒性:改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的脫細(xì)胞真皮的連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性。見表2。

    2.5 體外細(xì)胞相容性:將P4脂肪干細(xì)胞接種于經(jīng)兩種不同方法制備后的脫細(xì)胞真皮上,8d后傳統(tǒng)法制備的脫細(xì)胞真皮的基底膜面呈現(xiàn)單層-復(fù)層生長,無明顯浸潤現(xiàn)象;8d后改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層,且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大,細(xì)胞數(shù)量明顯增加。

    3? 討論

    脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是一種經(jīng)過特殊方式去除皮膚組織內(nèi)細(xì)胞及抗原而保留細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料[11]。研究證實(shí),脫細(xì)胞真皮夠?yàn)榧?xì)胞的生長及細(xì)胞外基質(zhì)的重建提供良好的環(huán)境,提高移植的成活率,降低創(chuàng)面收縮率,減輕瘢痕攣縮[12]。目前脫細(xì)胞真皮已廣泛應(yīng)用于整形外科、眼科、口腔科及燒傷科等臨床學(xué)科[13]。邵小均等[14]研究結(jié)果證實(shí),脫細(xì)胞真皮在口腔頜面部各類創(chuàng)面的修復(fù)中起到創(chuàng)面覆蓋、引導(dǎo)組織再生和支架的作用。時(shí)長江等[15]研究證實(shí),在治療各種創(chuàng)面的修復(fù)過程中,將脫細(xì)胞真皮作為載體,聯(lián)合種子細(xì)胞治療各種創(chuàng)面的修復(fù)及組織重建,亦取得良好效果。陳武等[16]研究證實(shí),牙周膜細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮表面黏附及增殖情況良好。組織相容性是衡量生物材料的重要指標(biāo)之一,而制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率、通透性等均會(huì)對(duì)細(xì)胞的浸潤生長產(chǎn)生影響。因此制備脫細(xì)胞真皮的各種方法的重點(diǎn)均是盡量去除皮膚組織的細(xì)胞成分,提高脫細(xì)胞真皮的相容性。另外據(jù)報(bào)道,脫細(xì)胞真皮的孔隙率、孔腔大小及各種細(xì)胞因子等都會(huì)對(duì)脫細(xì)胞真皮的血管化產(chǎn)生影響[13]。

    張愛君等[17]研究證實(shí),通過調(diào)節(jié)制備過程中堿液的濃度能夠有效調(diào)節(jié)脫細(xì)胞真皮的微結(jié)構(gòu),使其孔腔直徑與孔隙率增大,而冷凍處理則可以使細(xì)胞外基質(zhì)更加疏松。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,傳統(tǒng)方法與改良方法制備的脫細(xì)胞真皮經(jīng)肉眼觀察顏色無差異,均呈乳白略帶微黃色,但經(jīng)改良法制備的真皮表面可見孔隙,柔韌度更好,塑形性更高,更利于手術(shù)操作;而經(jīng)HE染色后,兩種脫細(xì)胞真皮細(xì)胞成分均被完全脫去,均未見藍(lán)染細(xì)胞核及殘留,膠原纖維均完整,且較傳統(tǒng)方法,改良法制備的真皮孔隙均勻、結(jié)構(gòu)疏松、膠原纖維更為纖細(xì);且改良法制備的脫細(xì)胞真皮的孔隙率及真皮網(wǎng)狀面孔隙直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明相對(duì)傳統(tǒng)法而言,改良法制備的脫細(xì)胞真皮更利于細(xì)胞的浸潤生長。兩組脫細(xì)胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;改良方法制備的脫細(xì)胞真皮8d內(nèi)連續(xù)檢測結(jié)果均顯示無細(xì)胞毒性,說明經(jīng)改良法制備的真皮安全可靠。筆者將P4脂肪干細(xì)胞接種于經(jīng)兩種不同方法制備后的脫細(xì)胞真皮上,8d后傳統(tǒng)法制備的脫細(xì)胞真皮的基底膜面呈現(xiàn)單層-復(fù)層生長,無明顯浸潤現(xiàn)象;而改良法制備的脫細(xì)胞真皮上的干細(xì)胞浸潤基底層,且浸潤范圍隨時(shí)間增加而擴(kuò)大,細(xì)胞數(shù)量明顯增加。結(jié)果與姜濤等[18]研究一致,說明改良方法去除細(xì)胞更徹底,制備的脫細(xì)胞真皮的體外相容性及臨床使用效果更好。

    綜上所述,應(yīng)用改良方法制備的脫細(xì)胞真皮,不僅方法簡單,且制備出的脫細(xì)胞真皮質(zhì)地更利于手術(shù)操作,孔隙率及孔腔直徑均優(yōu)于傳統(tǒng)方法,且無細(xì)胞毒性,與體外細(xì)胞的相容性較傳統(tǒng)方法亦更佳。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]關(guān)巍,汪昌寧.脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)在牙周病學(xué)中的應(yīng)用[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2017,44(6):669-673.

    [2]Szabo AZ,F(xiàn)ong S,Yue L,et al.The CD44+ ALDH+ population of human keratinocytes is enriched for epidermal stem cells with long-term repopulating ability[J].Stem Cells,2013,31(4):786-799.

    [3]羅志軍,黎洪棉,王和庚,等.脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)與人脂肪干細(xì)胞的生物相容性[J].中國組織工程研究,2012,16(25):4616-4621.

    [4]Cronin H,Goldstein G.Biologic skin substitutes and their applications in dermatology[J].Dermatol Surg,2013,39(1):30-34.

    [5]Banyard DA,Bourgeois JM,Widgerow AD,et al.Regenerative biomaterials:a review[J].Plast Reconstr Surg,2015,135(6):1740-1748.

    [6]Kuroda K,Kabata T,Hayashi K,et al.The paracrine effect of adipose-derived stem cells inhibits osteoarthritis progression[J].BMC Musculoskelet Disord,2015,16(1):1-10.

    [7]Ribeiro S,F(xiàn)erreira V,Stutz B,et al.Evaluation of the zone of keratinized tissue using exposed acellular dermal matrix over tooth extraction sites[J].Implant Dent,2015,24(2):180-184.

    [8]Basegmez C,Karabuda ZC,Demirel K,et al.The comparison of acellular dermal matrix allografts with free gingival grafts in the augmentation of peri-implant attached mucosa:a randomised controlled trial[J].Eur J Oral Implantol,2013,6(2):145-152.

    [9]姜濤,張愛君,李雪陽,等.人新型脫細(xì)胞真皮制備及性狀分析[J].中國組織工程研究,2016,20(7):1006-1012.

    [10]熊武,張彪,蔡昫,等.新型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及相關(guān)性能實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)師雜志,2017,19(7):1018-1021.

    [11]Kocak E,Nagel TW,Rd HJ,et al.Biologic matrices in oncologic breast reconstruction after mastectomy[J].Expert Rev Med Devices,2014,11(1):65-75.

    [12]Kuna VK,Padma AM,Hakansson J,et al.Significantly accelerated wound healing of full-thickness skin using a novel composite gel of porcine acellular dermal matrix and human peripheral blood cells[J].Cell Transplant,2017,26(2):293-307.

    [13]楊榮強(qiáng).異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)臨床應(yīng)用研究與進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué),2017,26(9):132-135.

    [14]邵小鈞,龐戀蘇,袁仕廷,等.異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在口腔頜面部創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36(9):900-903,907.

    [15]時(shí)長江,王鵬飛,辛大森,等.自體BMSCs復(fù)合改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國矯形外科雜志,2014,22(12):1111-1118.

    [16]陳武,王韋瑋,時(shí)新站,等.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為屏障膜的細(xì)胞相容性及細(xì)胞封閉性的體外研究[J].上??谇会t(yī)學(xué),2013,22(3):260-264.

    [17]張愛君,李強(qiáng),崔瑩瑩,等.不同年齡階段人脫細(xì)胞真皮的制備及細(xì)胞滲透性研究[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2014,20(2):130-133.

    [18]姜濤,金培生,陶常波,等.改良法制備人脫細(xì)胞真皮的特性與體外細(xì)胞相容性[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2016,22(6):369-372.

    [收稿日期]2019-02-20

    本文引用格式:鄧霞,鐘惠蘭.改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2019,28(10):102-105.

    猜你喜歡
    改良法
    一種改良的土壤線蟲分離方法的效果評(píng)估
    番茄葉片及果實(shí)總RNA 提取方法的比較
    茴香5種組織RNA提取方法比較
    改良法測量胃管留置長度對(duì)腦卒中患者胃內(nèi)殘留量監(jiān)測的影響
    改良法口服硫酸鋇X線下復(fù)位胃扭轉(zhuǎn)的應(yīng)用價(jià)值
    路基用回填土土質(zhì)改良方法的對(duì)比研究
    靜脈腔內(nèi)激光聯(lián)合傳統(tǒng)手術(shù)改良法治療下肢淺靜脈曲張療效觀察
    初發(fā)翼狀胬肉切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)改良法與傳統(tǒng)法療效對(duì)比研究
    改良法經(jīng)鼻置胃管的應(yīng)用解剖學(xué)研究*
    Ⅱ/Ⅲ期無縫臨床試驗(yàn)中合并檢驗(yàn)法與改良法的比較*
    亚洲 欧美一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜视频精品福利| 日韩欧美三级三区| 亚洲五月天丁香| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品国产国语对白av| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 哪里可以看免费的av片| 青草久久国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美成人午夜精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 日本 欧美在线| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲专区字幕在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 两个人视频免费观看高清| 亚洲免费av在线视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 妹子高潮喷水视频| 国产高清videossex| 午夜久久久久精精品| 国产1区2区3区精品| 女性被躁到高潮视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产在线观看jvid| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲九九香蕉| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久久国产a免费观看| 嫩草影院精品99| 听说在线观看完整版免费高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 嫩草影院精品99| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 性色av乱码一区二区三区2| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲七黄色美女视频| 99国产综合亚洲精品| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美3d第一页| 伦理电影大哥的女人| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕免费在线视频6| 日本熟妇午夜| 亚洲综合色惰| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产在视频线在精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久国产乱子免费精品| 丝袜美腿在线中文| 国产精品久久电影中文字幕| 在线观看66精品国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| av视频在线观看入口| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费看光身美女| 搡老岳熟女国产| 日本爱情动作片www.在线观看 | 免费看a级黄色片| 欧美一区二区亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久成人免费电影| 美女内射精品一级片tv| 直男gayav资源| 在线a可以看的网站| 精品一区二区免费观看| 成人av在线播放网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品福利在线免费观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产淫片久久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产高清视频在线播放一区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久国产成人精品二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 岛国在线免费视频观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美三级亚洲精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 色视频www国产| 日韩国内少妇激情av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品综合久久久久久久免费| 天美传媒精品一区二区| 亚洲久久久久久中文字幕| 一级黄色大片毛片| 精品久久久久久久久av| 性欧美人与动物交配| 又黄又爽又免费观看的视频| 黑人高潮一二区| av女优亚洲男人天堂| 赤兔流量卡办理| 日本与韩国留学比较| 麻豆国产97在线/欧美| 免费搜索国产男女视频| 久久久久久久久久成人| 不卡视频在线观看欧美| 不卡视频在线观看欧美| 在线a可以看的网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 村上凉子中文字幕在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 波多野结衣高清作品| 中国国产av一级| 两个人视频免费观看高清| 国产精品一区www在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品不卡视频一区二区| 一a级毛片在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av成人精品一区久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| 精品午夜福利视频在线观看一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久久大精品| 亚洲人成网站在线播| 成人亚洲欧美一区二区av| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 秋霞在线观看毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲成人久久性| 激情 狠狠 欧美| 一级av片app| 波野结衣二区三区在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 又爽又黄无遮挡网站| 国产黄片美女视频| 欧美精品国产亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 久久热精品热| 免费看美女性在线毛片视频| 国产高清三级在线| 午夜福利18| 91久久精品国产一区二区成人| 国产 一区 欧美 日韩| 国产午夜福利久久久久久| 在线免费观看的www视频| 97在线视频观看| 全区人妻精品视频| 国产三级中文精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲人与动物交配视频| 99热这里只有是精品在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产亚洲91精品色在线| 99久久精品国产国产毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 可以在线观看毛片的网站| 国产熟女欧美一区二区| av天堂在线播放| 亚洲精品国产成人久久av| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩成人伦理影院| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线国产一区二区在线| 午夜日韩欧美国产| 久久久欧美国产精品| 中文资源天堂在线| 永久网站在线| av中文乱码字幕在线| 麻豆国产av国片精品| 久久99热6这里只有精品| 国产成人freesex在线 | 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美激情久久久久久爽电影| av国产免费在线观看| 欧美激情在线99| 亚洲不卡免费看| .国产精品久久| 国产私拍福利视频在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 联通29元200g的流量卡| 两个人的视频大全免费| 久久久久久国产a免费观看| 久99久视频精品免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美日韩综合久久久久久| 黄色一级大片看看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av免费在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 麻豆一二三区av精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩成人伦理影院| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 村上凉子中文字幕在线| 久久99热这里只有精品18| 99在线人妻在线中文字幕| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲四区av| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品久久久久久久久免| 黄色配什么色好看| 成年女人看的毛片在线观看| 丰满的人妻完整版| 久久精品国产自在天天线| 午夜a级毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 99riav亚洲国产免费| 亚洲四区av| 女人被狂操c到高潮| 乱码一卡2卡4卡精品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产精品不卡视频一区二区| 搞女人的毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产久久久一区二区三区| 精品福利观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 九色成人免费人妻av| 国产亚洲精品久久久com| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 在线观看一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 麻豆一二三区av精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费av不卡在线播放| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院新地址| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美精品v在线| 国产片特级美女逼逼视频| 成年版毛片免费区| а√天堂www在线а√下载| 一级毛片aaaaaa免费看小| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 永久网站在线| 亚洲欧美清纯卡通| 一级黄色大片毛片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品女同一区二区软件| 欧美高清成人免费视频www| 色吧在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产av在哪里看| 男人和女人高潮做爰伦理| 婷婷亚洲欧美| 两个人视频免费观看高清| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 97超碰精品成人国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 不卡一级毛片| 俺也久久电影网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色哟哟·www| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩亚洲欧美综合| 全区人妻精品视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产成人freesex在线 | 亚洲专区国产一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 国产免费男女视频| 免费大片18禁| 赤兔流量卡办理| 精品午夜福利在线看| 日本在线视频免费播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美色视频一区免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩精品中文字幕看吧| а√天堂www在线а√下载| 国产精品不卡视频一区二区| 嫩草影院精品99| 99精品在免费线老司机午夜| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 女人被狂操c到高潮| 97碰自拍视频| 国产麻豆成人av免费视频| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费av不卡在线播放| а√天堂www在线а√下载| 久久亚洲国产成人精品v| 床上黄色一级片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩三级伦理在线观看| 国产高清三级在线| 亚洲av免费在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久国产成人精品二区| 日日啪夜夜撸| 秋霞在线观看毛片| av在线观看视频网站免费| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 久久午夜福利片| 国产精品国产高清国产av| 综合色丁香网| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美中文日本在线观看视频| 深夜a级毛片| 99热6这里只有精品| 1000部很黄的大片| 国产精品一区www在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲国产色片| 日韩一本色道免费dvd| 成人av在线播放网站| 色哟哟哟哟哟哟| 禁无遮挡网站| 国产精品一区二区性色av| 禁无遮挡网站| 免费在线观看影片大全网站| 成人av在线播放网站| 我的老师免费观看完整版| 国内精品宾馆在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99久国产av精品国产电影| 久久精品91蜜桃| 国产成人影院久久av| 欧美最新免费一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 在线a可以看的网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本爱情动作片www.在线观看 | 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲成人av在线免费| av卡一久久| 网址你懂的国产日韩在线| 丝袜美腿在线中文| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜免费激情av| 国产熟女欧美一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 不卡一级毛片| 国产精品一区www在线观看| 日韩欧美 国产精品| 在线免费十八禁| 久久久久久九九精品二区国产| av女优亚洲男人天堂| 91久久精品电影网| 99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产 一区 欧美 日韩| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人人妻人人看人人澡| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久国内视频| 丝袜喷水一区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 少妇的逼水好多| 99久久中文字幕三级久久日本| 最近2019中文字幕mv第一页| h日本视频在线播放| a级毛片a级免费在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲欧美日韩东京热| 色哟哟·www| 级片在线观看| 美女大奶头视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 女同久久另类99精品国产91| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲18禁久久av| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产免费男女视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 一级黄色大片毛片| 麻豆国产av国片精品| 大型黄色视频在线免费观看| 又爽又黄无遮挡网站| 一a级毛片在线观看| 国产精品永久免费网站| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 午夜精品在线福利| 国产三级中文精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产高清激情床上av| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品人妻久久久影院| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美性感艳星| 伦理电影大哥的女人| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产真实乱freesex| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久成人免费电影| 国产成人a区在线观看| 精品久久久久久久久av| 久久久久久久久久成人| 国产精品久久视频播放| 身体一侧抽搐| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91av网一区二区| 直男gayav资源| 天堂动漫精品| 日韩成人伦理影院| 99久久无色码亚洲精品果冻| 不卡一级毛片| 桃色一区二区三区在线观看| 久久这里只有精品中国| 国产高清有码在线观看视频| 一个人看的www免费观看视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品一区www在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 一级黄色大片毛片| 国产人妻一区二区三区在| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品日产1卡2卡| av免费在线看不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 嫩草影院新地址| 日本成人三级电影网站| 在线免费十八禁| 国产精品综合久久久久久久免费| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品亚洲美女久久久| 免费观看在线日韩| 嫩草影院入口| 一个人看视频在线观看www免费| 日本 av在线| 国产视频内射| 一级黄色大片毛片| 一区二区三区免费毛片| 久久久久国产网址| 淫秽高清视频在线观看| 丝袜喷水一区| av免费在线看不卡| 精品久久久久久久久久久久久| 热99在线观看视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产三级在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 春色校园在线视频观看| 欧美区成人在线视频| 久久久久国内视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜老司机福利剧场| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品三级大全| 观看免费一级毛片| 成人国产麻豆网| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 91久久精品电影网| 春色校园在线视频观看| 在线观看66精品国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 18+在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲中文字幕日韩| 午夜老司机福利剧场| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 夜夜爽天天搞| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲四区av| 久久人人精品亚洲av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲国产欧美人成| 99久久九九国产精品国产免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产高清三级在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产日本99.免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产综合懂色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产视频一区二区在线看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品av视频在线免费观看| 99久久精品一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人av一区二区三区在线看| 老司机福利观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜影院日韩av| 真实男女啪啪啪动态图| 免费观看人在逋| 亚洲电影在线观看av| 亚洲一区高清亚洲精品| 天堂动漫精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 能在线免费观看的黄片| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美高清成人免费视频www| 一边摸一边抽搐一进一小说| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久久精品94久久精品| 小说图片视频综合网站| 色视频www国产| 黑人高潮一二区| 免费看光身美女| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲自拍偷在线| 色av中文字幕| 人人妻人人澡欧美一区二区| а√天堂www在线а√下载| 如何舔出高潮| 欧美bdsm另类| 国产久久久一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 黄色欧美视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 久久这里只有精品中国| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看美女被高潮喷水网站| 身体一侧抽搐| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产熟女欧美一区二区| 91精品国产九色| 色哟哟·www| 小说图片视频综合网站| 久久久国产成人精品二区| 长腿黑丝高跟| 国产黄片美女视频| 国产视频内射| 长腿黑丝高跟| av福利片在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 国产av不卡久久| 成年版毛片免费区| 国产日本99.免费观看| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品国产高清国产av| 午夜激情福利司机影院| 99热只有精品国产| 国产毛片a区久久久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日韩中字成人| 赤兔流量卡办理| 美女cb高潮喷水在线观看| 黄片wwwwww| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩欧美精品v在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩高清综合在线| 搡老岳熟女国产| 中文字幕av在线有码专区| 午夜免费激情av| 少妇丰满av| 色5月婷婷丁香| 国产人妻一区二区三区在| 香蕉av资源在线| 国产成人freesex在线 | 国产高清激情床上av| 国产成人一区二区在线| 能在线免费观看的黄片| 日韩欧美三级三区| 免费无遮挡裸体视频|