番茄葉片及果實(shí)總RNA 提取方法的比較

郭荔雯 ，擺福紅 ，沙曉東 ，張風(fēng)琴 ，王 林，王曉敏 ，2，3，4

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏設(shè)施園藝（寧夏大學(xué)）技術(shù)創(chuàng)新中心，銀川 750021；3.寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；4.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，銀川 750021）

番茄（Solanum lycopersicum）屬茄科一年生或多年生草本植物，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一種重要模式植物［1］。在番茄分子生物學(xué)研究時(shí)，需從番茄葉片和果實(shí)中提取純度高、完整性好的RNA，但由于其組織中積累了大量的次生代謝物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖和多酚等物質(zhì)易與RNA 共沉淀，對(duì)RNA 的提取和純化有干擾作用，進(jìn)一步影響總RNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量［2］。目前，番茄總RNA 的提取方法有CTAB法、異硫氰酸胍法、Trizol 法及試劑盒法等，不同提取方法對(duì)于同一組織材料提取的差異較大［3，4］，因此對(duì)于植物不同組織或同一組織不同時(shí)期的總RNA 提取方法的比較顯得尤為重要。

本研究以番茄品種Money maker（MM）為材料，分別采用Trizol 法、Trizol 改良法和試劑盒法（提葉片用OMEGA 試劑盒，提果實(shí)用華越洋試劑盒）共3 種方法分別提取番茄葉片和不同時(shí)期果實(shí)的總RNA，從RNA 濃度、純度、完整性、成本等方面篩選出提取番茄葉片和果實(shí)總RNA 的最佳方法，以期為后續(xù)相關(guān)基因的表達(dá)及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為MM，種植于寧夏大學(xué)北校區(qū)溫室，進(jìn)行常規(guī)化管理，葉片于五葉期進(jìn)行采樣，果實(shí)在青果期、轉(zhuǎn)色期以及成熟期分別采樣，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

葉片和不同時(shí)期果實(shí)總RNA 提取的試劑盒法分別為OMEGA 試劑盒與華越洋試劑盒。

1.2.1 OMEGA 試劑盒法 操作參照植物RNA 提取試劑盒（美國(guó)OMEGA 公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 Trizol法 操作參照馬敬等［5］的方法進(jìn)行。

1.2.3 Trizol 改良法 操作參照譚麗麗等［1］的方法，不同之處在于取0.1 g 番茄葉片液氮研磨成細(xì)粉后加0.1 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）繼續(xù)研磨，液氮揮發(fā)后，迅速加入Trizol 試劑，在RNA 沉淀前再加入等量的苯酚∶氯仿∶異戊醇（PCI）=25∶24∶1，重新抽提1次。試驗(yàn)過(guò)程中加入的試劑都需預(yù)冷。

1.2.4 華越洋試劑盒法 操作參照華越洋（北京華越洋）試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 總RNA 質(zhì)量檢測(cè)

取2 μL RNA 溶液，利用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA 樣品濃度和OD值。一般情況下，RNA 樣品的OD260/OD280比值低于1.8 證明有蛋白質(zhì)和酚類(lèi)等雜質(zhì)的污染；而高于2.0 證明有異硫氰酸殘留等或RNA有一定降解，所以純度較高的RNA其OD260/OD280值 應(yīng) 在 1.80～2.00。 RNA 的OD260/OD230值 應(yīng) 大 于2.00，若小于2.00 表明樣品被小分子物質(zhì)或有機(jī)溶劑污染［6，7］。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性：取5 μL RNA 樣品，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（每100 mL凝膠含有 10 μL GelRed）點(diǎn)樣孔中，140 V 恒壓電泳15 min，在凝膠成像儀下觀(guān)察并照相記錄。瓊脂糖凝膠電泳主要用來(lái)檢測(cè)RNA 的完整性，總RNA 樣品的主要成分是28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA；從電泳結(jié)果的28S rRNA 和18S rRNA 的完整性來(lái)判斷RNA 樣品有無(wú)降解以及降解程度［7］。完整性好的RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，其28S rRNA 與18S rRNA 條帶的亮度比例約為2∶1。若發(fā)生部分降解，一方面28S rRNA 會(huì)降解為18S rRNA，導(dǎo)致二者比例的改變；另一方面28S rRNA 與18S rRNA 降解為更小的片段，導(dǎo)致RNA 條帶拖尾；若發(fā)生徹底降解，則RNA 在泳道內(nèi)呈彌散狀，無(wú)任何條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取番茄葉片總RNA 的純度及濃度的比較

由表1可知，Trizol法、Trizol改良法和OMEGA試劑盒法3種方法提取的番茄葉片總RNA的OD260/OD280分別為 1.92、1.97 和 1.99，均在 1.80～2.00，說(shuō)明 3 種方法提取的RNA 均未受DNA、蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染；且3 種方法的OD260/OD230均大于或等于2.00，說(shuō)明3 種方法提取的RNA 基本未受小分子物質(zhì)和鹽類(lèi)污染，表明3 種方法提取的番茄葉片總RNA 純度均符合基本要求。從濃度分析可得，OMEGA 試劑盒法提取的總RNA 濃度最高，為2 560 ng/μL，Trizol 改良法和 Trizol 法次之，分別為 2 096、2 080 ng/μL。因此，對(duì)于番茄葉片，3 種方法提取的RNA純度與濃度都能達(dá)到后續(xù)分子生物學(xué)研究的需求。

表1 3 種方法提取番茄葉片總RNA 的純度及濃度比較

2.2 不同方法提取番茄葉片總RNA 凝膠電泳檢測(cè)

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，3種方法提取的番茄葉片總RNA 均有28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3 個(gè)條帶，且泳道內(nèi)均無(wú)明顯彌散拖尾現(xiàn)象，表明其基本不存在降解。OMEGA 試劑盒法提取的番茄葉片總RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 兩條帶亮度比值約為1∶1，表明其完整性一般；Trizol改良法提取的28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值近似為2∶1，完整性最好；Trizol 法的條帶清晰度較其他2種方法差，28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值約為1∶1。綜上所述，Trizol 改良法提取效果比OMEGA試劑盒法提取的RNA 更好。

圖1 3 種方法提取番茄葉片總RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.3 不同方法提取番茄果實(shí)總RNA純度及濃度比較

由表2可知，對(duì)于青果期的番茄果實(shí)，華越洋試劑盒法和Trizol改良法提取的果實(shí)總RNA的OD260/OD280均在 1.80～2.00，而 Trizol 法OD260/OD280小于 1.80，說(shuō)明受到少量DNA、蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染。但華越洋試劑盒提取的果實(shí)總RNAOD260/OD230大于2.00，表明其純度最好。其他2 種方法OD260/OD230低于1.00，說(shuō)明受到大量小分子物質(zhì)和鹽類(lèi)的嚴(yán)重污染，導(dǎo)致二者純度均較差。Trizol 法提取的RNA 濃度最低（271 ng/μL），Trizol 改良法與華越洋試劑盒法提取的RNA 濃度相當(dāng)，后者略高（317 ng/μL）。

對(duì)于轉(zhuǎn)色期的番茄果實(shí)，華越洋試劑盒法提取的番茄果實(shí)總RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230分別為1.98和2.24；其他2種方法OD260/OD280均小于1.80，說(shuō)明RNA 受到少量DNA、蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染，OD260/OD230略低于2.00，說(shuō)明受到少量小分子物質(zhì)和鹽類(lèi)的污染。3 種方法所提取的RNA 濃度相當(dāng)，依次為351、362、377 ng/μL。

對(duì)于成熟期的番茄果實(shí)，華越洋試劑盒法和Trizol 改良法所提取總RNA 的OD260/OD280分別為1.92和1.91，OD260/OD230分別為2.11和2.03，說(shuō)明兩者純度均較高，而Trizol法OD260/OD280為1.70，OD260/OD230為1.38，說(shuō)明該方法提取的RNA 受各種雜質(zhì)污染比較嚴(yán)重。3 種方法所提取的RNA 濃度相當(dāng)，分別為328、332、348 ng/μL。

表2 3 種方法提取番茄果實(shí)總RNA 的純度及濃度比較

2.4 不同方法提取果實(shí)總RNA 凝膠電泳檢測(cè)

2.4.1 青果期番茄果實(shí)總RNA 凝膠電泳檢測(cè) 3 種方法提取的青果期果實(shí)總RNA 樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，華越洋試劑盒法和Trizol 法提取的總RNA 有明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，且無(wú)彌散，二者亮度比值均為1∶1，完整性較好。而Trizol 改良法提取的總RNA 條帶不夠清晰，無(wú)明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，且有彌散，表明完整性差。綜合而言，華越洋試劑盒法對(duì)番茄青果期總RNA 的提取效果最好（圖2）。

圖2 3 種方法提取青果期番茄果實(shí)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.4.2 轉(zhuǎn)色期番茄果實(shí)總RNA 凝膠電泳檢測(cè) 3 種方法提取的轉(zhuǎn)色期果實(shí)總RNA 樣本經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，Trizol 法提取的總RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 條帶不清晰，說(shuō)明存在嚴(yán)重的降解；而Trizol 改良法、華越洋試劑盒法提取的總RNA條帶較清晰，28S rRNA 和18S rRNA 條帶亮度比值均接近于2∶1，說(shuō)明RNA 的完整性好。所以，Trizol改良法和華越洋試劑盒法對(duì)轉(zhuǎn)色期番茄總RNA 的提取效果均好（圖3）。

圖3 3 種方法提取轉(zhuǎn)色期番茄果實(shí)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.4.3 成熟期番茄果實(shí)總RNA 凝膠電泳檢測(cè) 3 種方法提取成熟期果實(shí)總RNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，華越洋試劑盒法和Trizol 改良法提取的總RNA 均有明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，Trizol 改良法的 28S rRNA 和 18S rRNA 條帶亮度比值接近于2∶1，說(shuō)明該方法提取的成熟期番茄果實(shí)RNA 的完整性較好；Trizol 法提取的總RNA 28S rRNA 和18S rRNA 條帶不明顯，存在大量降解，完整性差。綜合而言，Trizol 改良法適合成熟期番茄果實(shí)總RNA 的提取（圖4）。

圖4 3 種方法提取成熟期番茄果實(shí)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.5 耗時(shí)與成本比較

通過(guò)對(duì)番茄葉片和不同時(shí)期果實(shí)總RNA 提取成本和耗時(shí)比較可知（表3），試劑盒法耗時(shí)最短（40 min），但成本較高（17.2 元/個(gè)、14.8 元/個(gè)）；Trizol 改良法成本次之（5.5 元/個(gè)），但耗時(shí)最長(zhǎng)（75 min）；Trizol 法成本最低（4.8 元/個(gè)），耗時(shí)較長(zhǎng)（65 min）。說(shuō)明試劑盒法具有高效的提取特點(diǎn)，能快速地從番茄葉片及果實(shí)中提取到較高質(zhì)量的RNA，且提取過(guò)程操作簡(jiǎn)單。Trizol改良法成本低，耗時(shí)長(zhǎng)，提取效果較好，Trizol法成本雖然最低，但是提取的效果較差。

表3 RNA 提取方法成本與成本的比較

3 討論

完整性好、純度高的RNA 在基因克隆及表達(dá)分析等分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［8］。目前已有多種植物RNA 提取分離的報(bào)道，但不同植物其組織成分不同，適用的有效提取方法也不同，同一植物組織的RNA 提取效果也有明顯差異［9］，尤其是番茄果實(shí)中含有多糖、多酚和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，如何去除這些物質(zhì)對(duì)番茄果實(shí)提取到有效的RNA 有一定的影響［10］。

在試驗(yàn)中，對(duì)于番茄葉片總RNA 的提取而言，3種方法均適用，其中OMEGA 試劑盒法所提取的總RNA 濃度最高，但電泳條帶中28S rRNA 和18S rRNA 的亮度沒(méi)有明顯的 2∶1 比例，而 Trizol 改良法提取的總RNA 的濃度次之，但電泳條帶中28S rRNA和18S rRNA 的亮度比值約為2∶1，完整性最好。分析造成上述問(wèn)題的原因可能是在操作過(guò)程中對(duì)雜質(zhì)的去除不夠徹底，也有可能是在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)RNA 有所降解，所以提取番茄葉片總RNA 效果最好的是Trizol改良法。

對(duì)于青果期及轉(zhuǎn)色期果實(shí)總RNA 的提取而言，華越洋試劑盒法提取總RNA 的效果最好，純度和濃度均最高，但成本也最高。雖然Trizol 改良法所提取的轉(zhuǎn)色期果實(shí)總RNA 凝膠電泳條帶的28S rRNA與 18S rRNA 亮度比值約為 2∶1，但是OD260/OD280為1.72，低于1.80，說(shuō)明純度不夠好，RNA 受到較多的DNA、蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染。對(duì)于成熟期果實(shí)而言，華越洋試劑盒法提取效果最好，但成本最高；而Trizol 改良法的提取效果次之，但成本低，若在考慮成本的基礎(chǔ)上，Trizol 改良法更適于提取成熟期果實(shí)的RNA。其中，試劑盒法的提取操作較簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，但成本最高（提取番茄葉片的為OMEGA 試劑盒，提取番茄果實(shí)的為華越洋試劑盒）；Trizol 改良法較Trizol 法而言，Trizol 改良法的所有操作均需在冰盒上進(jìn)行，且操作步驟較多，耗時(shí)更長(zhǎng)。除此之外，不同時(shí)期果實(shí)用同種方法提取出RNA 的效果也有所不同，分析可能是由于不同時(shí)期的番茄果實(shí)中多糖、多酚及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量有所不同，尤其是成熟期的果實(shí)多糖及多酚的含量更高，而上述物質(zhì)易與RNA 共沉淀，對(duì)RNA 的提取和純化有干擾作用，進(jìn)一步影響總RNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，即使目前有關(guān)提取RNA 方法的報(bào)道很多，但對(duì)特定的植物組織而言，需根據(jù)具體情況做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，盡可能地減少RNase對(duì)核酸的干擾，進(jìn)而保證提取RNA的效果。

綜合來(lái)看，試劑盒法最適宜于番茄青果期果實(shí)及轉(zhuǎn)色期果實(shí)高質(zhì)量RNA 的提取，Trizol 改良法最適宜于番茄葉片及成熟期果實(shí)高質(zhì)量RNA 的提取，為后續(xù)的基因克隆、mRNA 表達(dá)分析、cDNA 文庫(kù)建立及原位雜交等分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。