蜂膠中白楊素衍生物抗高尿酸活性研究

徐軍，楊美林，仲崇琳

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)所，吉林長春130012）

高尿酸血癥是指血液中的尿酸濃度超出正常范圍的一種代謝性疾病[1]。研究表明，近年來我國高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，且其與一些代謝性疾病如糖尿病、肥胖癥及心腦血管疾病等密切相關(guān)[2,3]。尿酸（uric acid,UA）是人類嘌呤及核酸分解代謝的最終產(chǎn)物，由于人體內(nèi)沒有尿酸酶，所以尿酸可以作為代謝的終產(chǎn)物直接排出體外。食物中的嘌呤經(jīng)過嘌呤分解、嘌呤物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化和反饋性調(diào)節(jié)嘌呤合成等生物反應(yīng)過程中生成UA，多種代謝酶如5’-核苷酸酶（5’nucleotidase,5’-NT）、腺苷脫氨酶（adenosine de-aminase,ADA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XO）和嘌呤核苷磷酸化酶（pufine nucleoside phosphorylase,PNP）參與該代謝過程。腺嘌呤核糖核苷酸在5’-NT作用下脫磷酸生成腺苷；ADA在嘌呤分解代謝途徑中，主要催化腺嘌呤核苷（A）和脫氧腺嘌呤核苷（dA）不可逆的脫氨，分別生成次黃嘌呤核苷及脫氧次黃嘌呤核苷；PNP和XO是嘌呤分解途徑后期的關(guān)鍵酶，次黃嘌呤核苷在PNP作用下，分解成次黃嘌呤，次黃嘌呤在XO的作用下生成黃嘌呤及UA。因此，嘌呤分解代謝途徑是尿酸生成的直接途徑，該途徑的關(guān)鍵酶均可能成為抗高尿酸血癥藥物的潛在靶點(diǎn)[4]。XO抑制劑如Allopurinol、Febuxostat現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床；試驗(yàn)證明PNP抑制劑（Ulodesine）能有效降低體內(nèi)UA水平，同時降低血液中黃嘌呤和次黃嘌呤的含量，是安全性和耐受性較好的降尿酸藥物，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床[5]。CHY10化學(xué)名是8-[(2,4-二氟苯氨基)甲基]-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，系本課題組以蜂膠提取物白楊素為原料合成的Mannich堿衍生物。前期研究發(fā)現(xiàn)，白楊素Mannich堿衍生物在體內(nèi)體外對XO有抑制作用[6]。灌胃給予白楊素Mannich堿衍生物可以明顯降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，并發(fā)現(xiàn)其降尿酸的機(jī)制與抑制XO活性相關(guān)，已獲專利授權(quán)（專利號：ZL201610256522.7）[7]。然而，CHY10對嘌呤分解途徑上的其他關(guān)鍵酶類如5’-NT、ADA和PNP等的影響未見報(bào)道。本研究旨在通過UA前體物質(zhì)次黃嘌呤和尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀聯(lián)合造模法制備高尿酸血癥小鼠，并在其體內(nèi)考察CHY10對血清尿酸（serum uric acid,SUA）及XO活性影響情況，以及是否對肝臟中5’-NT、ADA和PNP的mRNA表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步闡明其治療高尿酸血癥的作用機(jī)制。

圖1 8-[（2,4-二氟苯氨基）甲基]-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮（CHY10）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of 8-[(2,4-difluoroanilino)methyl]-5,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzo-4-ketone

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料白楊素衍生物CHY10是由本實(shí)驗(yàn)合成，方法參見文獻(xiàn)[6]；別嘌醇片：廣東彼迪藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成不同濃度，備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性昆明種小鼠，體重為18～22 g（購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001，動物質(zhì)量合格證號：211002300016301，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（吉）2010-0006。飼養(yǎng)環(huán)境為屏蔽環(huán)境，自由攝食、飲水。

1.1.3 試劑尿酸試劑盒、黃嘌呤氧化酶試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供；液相用試劑均為色譜純，購自成都艾科化學(xué)試劑經(jīng)銷有限公司。

1.2 儀器

PECTRA MAX190全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；SONICS V超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonic公司）；ND-1000核酸蛋白定量檢測儀（NanoDrop公司）；CFX-96 PCR儀（美國BIO-RAD公司）；水平電泳儀（美國BIO-RAD公司）；Gel Doc XR凝膠成像分析儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、給藥和造模 昆明小鼠，隨機(jī)分為6組（n=10）：正常對照組，高尿酸血癥模型組，CHY10高、中、低劑量組（10 mg/kg、5 mg/kg和2.5 mg/kg），陽性藥別嘌醇組（1 mg/kg）。采用次黃嘌呤和氧嗪酸鉀聯(lián)合造模法，每天上午10時給予次黃嘌呤300 mg/kg+氧嗪酸鉀250 mg/kg，造模藥物用3 g/L的CMC-Na溶液配制成相應(yīng)的混懸液，除正常對照組給予等量蒸餾水灌胃外，其余各組采用對應(yīng)造模藥物灌胃。灌胃體積均為0.1 mL/10g，連續(xù)給藥7 d，每天1次。從給予造模劑開始，CHY10高、中、低劑量組每天下午13時分別灌胃給藥相應(yīng)濃度的CHY10，連續(xù)7 d，每天1次；陽性藥組給予1 mg/kg別嘌醇，連續(xù)7 d，每天1次。模型組和正常對照組給予等體積的0.5% CMC-Na[8]。實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠均正常飲食。末次給藥1 h后從小鼠眼眶后靜脈叢取血1.5 mL，放置30 min后，7 000 r/min離心10min，取100μL采用試劑盒法測定SUA水平[9]，并進(jìn)行血清中XO的活性檢測。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用成組t檢驗(yàn)對兩組均數(shù)比較。

1.3.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)小鼠眼眶后靜脈叢取血后，取肝組織，液氮速凍1h后，-80℃冰箱貯存待測酶mRNA的表達(dá)。查詢NCBI并參考文獻(xiàn)，利用Pubmed中Pick Primer在線軟件挑選引物[10,11]，對產(chǎn)物進(jìn)行Blast以確保擴(kuò)增基因特異性（表1），引物由上海生工生物有限公司合成。取50～100 mg肝臟到研磨管中，加入適量TRIzol，按試劑盒說明書提取總RNA并進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5’-NT的PCR條件為94℃5min，94℃1min，55.7℃1min，72℃1 min；ADA的PCR條件為94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s；PNP的PCR條件為94℃3 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s；均是35個循環(huán)[10]。

表1 PCR引物序列Table 1 The primer sequence used in real time PCR analysis

1.3.3 PCR產(chǎn)物半定量分析利用Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上對各組PCR的產(chǎn)物進(jìn)行分析，分別計(jì)算每條泳道上的特異PCR產(chǎn)物，其與GAPDH總強(qiáng)度的比值即表示各組樣品的特異酶基因mRNA的水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 CHY10對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響

末次給藥1h后采血測定各組小鼠SUA，結(jié)果見表2。與正常組相比，模型組小鼠的SUA顯著升高，提示該模型成功；與模型組相比，陽性藥別嘌醇組SUA顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；CHY10高劑量10 mg/kg可顯著降低SUA（P＜0.001），中劑量5 mg/kg降低SUA（P＜0.01），低劑量2.5 mg/kg對SUA無影響。

表2 CHY10對高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of CHY10 on serum uric acid levels in hyperuricemic mice(±s，n=10)

表2 CHY10對高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of CHY10 on serum uric acid levels in hyperuricemic mice(±s，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較###P＜0.001。Note:compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001;compared with the control group,###P＜0.001.

組別Group 劑量（mg/kg）Dose 血清尿酸（μmol/L）SUA正常組 - 89.92±10.58模型組 - 131.77±11.18###陽性藥組 1 90.66±9.37***CHY10-H 10 98.53±7.64***CHY10-M 5 115.34±12.55**CHY10-L 2.5 126.71±11.23

采用試劑盒測定血清中XO的活性，結(jié)果見表3。模型組的XO活性升高，提示該模型成功（P＜0.05）；給藥后，CHY10高劑量組的血清XO活性有所降低（P＜0.05）。

表3 CHY10對高尿酸血癥小鼠XO的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of CHY10 on XO activities in serum of hyperuricemic mice

表3 CHY10對高尿酸血癥小鼠XO的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of CHY10 on XO activities in serum of hyperuricemic mice

注：與模型組比較，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.01；與正常組比較#P＜0.05。Note:comparedwithmodelgroup,*P＜0.05,**P＜0.01;comparedwithcontrolgroup,#P＜0.05.

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2.2 CHY10對高尿酸血癥小鼠XO上游相關(guān)酶5’-NT、ADA、PNP mRNA的影響

模型組的5’-NT mRNA表達(dá)產(chǎn)物與正常組相比有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，CHY10各劑量組和陽性藥組對高尿酸血癥小鼠肝組織中的5’-NT mRNA表達(dá)沒有明顯影響，見圖2。

圖2 CHY10對高尿酸血癥小鼠5’-NT mRNA的相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of CHY10 on expression of 5’-NT mRNA in hyperuricemic mice

模型組的ADA mRNA表達(dá)產(chǎn)物與正常組相比有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，CHY10各劑量組可以上調(diào)高尿酸血癥小鼠肝組織中ADA mRNA的表達(dá)，且隨著劑量的增加表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，別嘌醇組ADA mRNA的表達(dá)與模型組相比沒有下調(diào)，見圖3。

圖3 CHY10對高尿酸血癥小鼠ADA mRNA的相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of CHY10 on expression of ADA mRNA in hyperuricemic mice

模型組的PNP mRNA表達(dá)產(chǎn)物與正常組相比有所下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，CHY10各劑量組可以下調(diào)高尿酸血癥小鼠肝組織中PNP mRNA的表達(dá)，以CHY10中劑量組降低最顯著，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖4 CHY10對高尿酸血癥小鼠PNP mRNA的相對表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of CHY10 on expression of PNP mRNA in hyperuricemic mice

3 結(jié)論

本研究采用次黃嘌呤和氧嗪酸鉀聯(lián)合造模法，該模型相對穩(wěn)定，對肝腎損傷相對較小，能夠通過檢測血清尿酸和肌酐水平進(jìn)而判斷成功與否以及小鼠腎臟功能的健康程度，是目前廣泛采用的高尿酸血癥模型建立方法之一。結(jié)果表明，末次給藥后，CHY10低、中、高劑量組和別嘌醇組均能降低尿酸水平。體內(nèi)活性測定表明，CHY10能明顯抑制XO的活性，對PNP、ADA和5'-NT的mRNA表達(dá)無明顯影響。