一種超低溫冷凍蜜蜂精液方法的研究

莊明亮，李劍飛，李志勇，葛蓬，王志

（吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林吉林132108）

關(guān)鍵字：蜜蜂；精液；超低溫冷凍

蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，同時，蜜蜂也是一種重要的生態(tài)昆蟲，其為農(nóng)作物授粉產(chǎn)生很高的生態(tài)價值。隨著生態(tài)的破壞和農(nóng)藥大面積的使用等因素，蜜蜂種質(zhì)資源遭到破壞，保護蜜蜂種質(zhì)資源越來越引起人們的重視。

蜜蜂種質(zhì)資源保護通常采用群體水平上的活體保種技術(shù)，但活體保存風險性較高，受氣候、蜜粉源及病敵害等外界因素影響較大[1]。蜜蜂精子冷凍技術(shù)能夠?qū)?yōu)質(zhì)蜂種的精子低溫下長時間冷凍保存，最大程度減少外界因素的影響，提高蜜蜂種質(zhì)資源保護的可靠性[2,3]。因此，目前蜜蜂珍稀種質(zhì)資源的保護除了采用群體水平上的活體保種技術(shù)以外，還采用細胞水平上的精子低溫凍存技術(shù)。蜜蜂精子冷凍技術(shù)的出現(xiàn)，豐富了國家級蜜蜂基因庫保種技術(shù)手段，為珍稀蜜蜂種質(zhì)資源保護提供技術(shù)支撐，為蜜蜂遺傳育種以及蜜蜂生物學科發(fā)展做出貢獻。

精子冷凍保存從1803年問世以來，1964年Sawada和Chang首次利用7%的甘油作為冷凍保護劑成功的將蜜蜂精子保存，拉開了蜜蜂精子冷凍保存的序幕[4-6]。近幾年蜜蜂精液低溫冷凍保存技術(shù)取得了一些進步，2010年Hopkins和Herr利用10%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）作為冷凍保護劑，緩慢降溫至冰點以上平衡，解凍后蜜蜂精子活率達到93%[7]。2014年Wegener等[8]開發(fā)高滲透冷凍保護劑，然后用解凍后的精液進行人工授精，蜂王的產(chǎn)子區(qū)占整個子脾的47.5%。關(guān)于蜜蜂精液冷凍的研究更多集中在冷凍保護劑的篩選和冷凍方法優(yōu)化，本文從降低冷凍保護劑對蜜蜂精液的毒害作用入手，采用兩步平衡法將冷凍稀釋劑和保護劑分別平衡、利用程序降溫和離心處理的冷凍方法，考察冷凍后精液的活率、活力和授精蜂王存活率等指標，評價蜜蜂精液冷凍保存效果，為蜜蜂種質(zhì)資源保存提供一定指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗蜂群為吉林省養(yǎng)蜂科學研究所飼養(yǎng)的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）。

1.2 主要試劑

二甲基亞砜、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀和大豆卵磷脂等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要儀器

純水設(shè)備（型號為RODI），購自上海積聚儀器有限公司；電子天平（型號為JD300-3-G），購自沈陽龍騰電子有限公司；恒溫水浴鍋（型號DK-8D），購自太倉精宏儀器設(shè)備有限公司；冷凍降溫儀（型號CL-8000），購自澳大利亞CryoLogic Pty.Ltd.公司。

1.4 方法

1.4.1 蜜蜂精子稀釋劑和冷凍保護劑的制備 精子稀釋劑制備：用電子分析天平準確稱檸檬酸鈉（2.430g）、碳酸氫鈉（0.210 g）、氯化鉀（0.040 g），溶解于40 mL超純水中，充分攪拌，配置成50mL精子稀釋劑，110℃高壓滅菌，冷卻，放入4℃冰箱中臨時存放。

精子冷凍保護劑制備：大豆卵磷脂（1%）、二甲基亞砜（10%），將其溶解于40 mL超純水中，充分攪拌均勻后，配制成50 mL基礎(chǔ)液，110℃高壓滅菌，冷卻，加入過氧化酶（400L）放入4℃冰箱中臨時存放。

1.4.2 蜜蜂精液的獲取 在晴朗的午后13～15時，在蜂箱巢門前捕捉排便回巢的健壯、活躍的性成熟雄蜂，用拇指和食指從腹面捉住胸部兩側(cè)，拇指按壓雄蜂的腹部背板1～3節(jié)處，同時向腹部尾端施加壓力，強迫“陰莖”外翻并射精。在體視顯微鏡下，直接用進樣器逐只采集雄蜂精液。

雄蜂精液的采集，先將進樣器針頭吸入少許生理液再吸入一些空氣，然后操縱進樣器，使針頭與精液接觸后稍微拉開點距離，但二者并不斷開，借助于精液本身的黏滯性，把土黃色精液較完全地抽吸進針頭，采集另外1只雄蜂時先向外旋轉(zhuǎn)操縱桿再吸取，保證不出現(xiàn)氣泡隔離，待針頭內(nèi)貯滿所需精液量后，用生理液封閉針頭，以防精液干涸或污染。

1.4.3 蜜蜂精液的冷凍 采集的蜜蜂精液分為試驗組與對照組。試驗組采用冷凍方法，首先蜜蜂精液與稀釋劑按照比例混合搖勻，用濕毛巾包裹后放入4℃冰箱，靜置1 h；1 h后取出混合液，再加入冷凍保護劑混合輕輕搖勻，用濕毛巾包裹后放入4℃冰箱靜置1 h；把混合稀釋劑與冷凍保護劑的蜜蜂精子放入程序降溫儀中，設(shè)定降溫程序以3.5℃/min下降速率從4℃下降到-60℃，然后投入到液氮中保存。

對照組采用傳統(tǒng)冷凍方法：精液與稀釋劑和冷凍保護劑直接混合輕輕搖勻，用濕毛巾包裹后放入4℃冰箱，靜置2 h；將保存容器放置在離液氮液上方2～3 cm處快速降溫，最后投入液氮中冷凍保存。

1.4.4 蜜蜂精液的解凍 將待解凍的裝有蜜蜂精子的容器從液氮取出，放入37℃水浴鍋中20 s，期間攪拌加速蜜蜂精子的解凍。試驗組蜜蜂精液解凍后，轉(zhuǎn)移至離心管，放入離心機以3 000 r/min離心2 min，棄上清液，加入稀釋液混勻后，再進行3 000 r/min離心1 min，再棄上清液，加入稀釋液混勻后用于蜜蜂人工授精。對照組蜜蜂精液解凍后直接用于蜜蜂人工授精。

1.4.5 精子活率的測定 按照試驗組和對照組的方法分別冷凍保存蜜蜂精液1 d、7d、30d、180 d和360 d，然后解凍用稀釋液稀釋20倍，取10L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400顯微鏡下評價精子活率（直線運動精子百分率）。每次至少檢測200個精子，重復(fù)10次。

1.4.6 精子活力的測定 按照試驗組和對照組的方法分別冷凍保存蜜蜂精液1 d、7 d、30 d、180 d和360 d，然后解凍用稀釋液稀釋20倍，取10L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400顯微鏡下評價精子活力。依據(jù)如下分級標準進行評價：4級表明精子活力與鮮活精子活力無差別，呈快速圓圈運動；3級表明精子活力極好，精子向前運動為快速原地震動；2級精子活力一般，原地震動或圓圈運動向前曲線運動；1級精子活力差，只在原地蠕動；0級精子不能活動[9]。

1.4.7 處女蜂王存活率的測定分別按照試驗組和對照組的方法冷凍保存60 d、180 d以及360 d，然后解凍蜜蜂精子，對30只處女蜂王進行人工授精，吉林省養(yǎng)蜂科學研究所育種場培育的處女蜂王，觀察并記錄處女蜂王3 d內(nèi)的存活情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

蜜蜂存活試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜蜂精子的活率

采用不同方法冷凍保存蜜蜂精子1 d、7 d、60 d、180 d和360 d的精子活率見圖1。保存1 d和7 d，對照組和試驗組的蜜蜂精子活率差異不顯著（P＞0.05）；保存60 d、180 d和360 d，試驗組蜜蜂精子活率均顯著高于對照組（P＜0.05），說明采用試驗組的方法冷凍蜜蜂精液更適合蜜蜂精液的長時間保存，能夠保持較高的活率。

圖1 不同冷凍方法精子活率的對比Fig.1 The comparison of the sperm motility rate of different freezing methods

2.2 蜜蜂精子的活力

采用不同方法冷凍保存蜜蜂精子，解凍后在400倍顯微鏡下觀察精子活力，結(jié)果見圖2。保存1d和7d，對照組和試驗組的蜜蜂精子活力差異均不顯著（P＞0.05）；保存60 d、180 d和360 d，試驗組蜜蜂精子活力均顯著高于對照組（P＜0.05），說明采用試驗組的方法冷凍蜜蜂精液更適合蜜蜂精液的長時間保存，能夠保持較高的活力。

圖2 不同冷凍方法精液活力的對比Fig.2 The comparison of the sperm vitality of different freezing methods

2.3 人工授精蜂王的存活情況

將對照組和試驗組冷凍保存60 d、180 d和360 d的精子，解凍后對處女蜂王進行人工授精，處女蜂王的存活情況見圖3。試驗組處女蜂王的存活率均顯著高于對照組處女蜂王（P＜0.05）。

圖3 不同冷凍方法精子人工授精蜂王存活情況Fig.3 The survival of queen bees after artificial insemination with different frozen sperms

3 討論

精液冷凍過程中會受到一定程度的損傷，主要包括冷凍的冰晶化損傷和保護劑的毒害損傷[10-12]。本試驗從減小保護劑對精子毒害損傷入手，通過改進蜜蜂精子、稀釋液和冷凍保護劑的靜置隨即采用兩步平衡法，提升了冷凍后蜜蜂精子的活力和活率。說明本試驗所用蜜蜂精液稀釋液具有保護精子的作用，采用兩步平衡法進行精液冷凍，稀釋劑先與蜜蜂精液平衡混合，起到保護精子且減小保護劑毒害的作用，所以試驗組蜜蜂精液的活力和活率均顯著高于對照組的傳統(tǒng)方法（P＜0.05）。

本研究結(jié)果表明試驗組人工授精的處女蜂王存活率顯著高于對照組（P＜0.05），因為試驗組蜜蜂精液人工授精前經(jīng)過兩步的離心處理，去除保護劑等有害成分，所以試驗組人工授精的蜂王存活率顯著高于對照組。

本研究優(yōu)化了蜜蜂精液的冷凍方法，采用兩步平衡和程序降溫方法低溫冷凍蜜蜂精液，冷凍保存60 d、180 d和360 d后的蜜蜂精液活率與活力均比傳統(tǒng)冷凍方法顯著提高，而且人工授精后處女王的存活率也顯著提高，提升冷凍效果，可同時滿足蜜蜂精液長期和短期凍存的需求。本研究開發(fā)的超低溫冷凍蜜蜂精液的方法可有效保證蜜蜂優(yōu)良蜂種遺傳物質(zhì)的高效傳遞，實現(xiàn)既經(jīng)濟又安全的運輸方式，同時不受檢疫的限制，且可降低傳播病毒病等的危害，使得低成本利用優(yōu)良蜜蜂資源成為可能。