稀釋方法、孵育溫度和時間對冷凍-解凍后豬精液質(zhì)量的影響

鄧雙義，張 偉*，王世銀，唐志高

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆恒匯新牧種豬場，新疆 昌吉 831100)

豬精子對低溫非常敏感，在冷凍過程中很容易由于冷打擊而死亡[1]。雖然早在1956年Polge等[2-3]就首次成功冷凍豬精液并配種獲得仔豬，但是到目前為止世界范圍內(nèi)豬冷凍精液應用比例不超過1%[4]。陳超等[5]研究表明，稀釋密度為0.8×108～1.6×108/mL時，解凍后即時和2 h時的精子活力很高。以卵黃為基礎的冷凍稀釋液中加入乳糖和果糖的凍后活率要優(yōu)于山梨糖醇[6]。Silva等[7]研究發(fā)現(xiàn),以椰汁為基礎的冷凍稀釋液中加入5%的二甲基甲酰胺，可顯著提高豬精子的凍后活率。郭堂玉等[8]研究表明，采用50 ℃解凍的豬冷凍精液，精子活率和質(zhì)膜完整率顯著高于37 ℃和70 ℃解凍溫度組。近年來，豬精液冷凍技術取得了很大突破，精子凍后活率已達85%以上[9]。同時，母豬深部輸精技術已在生產(chǎn)中大面積推廣，在保證受胎率的同時大大降低了單次輸入母豬子宮內(nèi)有效精子數(shù)[10]。

雖然豬精液冷凍技術已開展了大量的研究并日趨成熟，精子凍后活率不斷提高且漸趨穩(wěn)定。但有關豬冷凍精液的解凍及解凍后處理方面的研究相對較少。本研究就豬冷凍精液解凍后的稀釋方法、保存溫度和時間對精液質(zhì)量的影響進行了初步研究，以期為該技術的推廣提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 冷凍精液 試驗所用豬冷凍精液為購自國內(nèi)某公司的長白豬細管冷凍精液，每個細管0.5 mL，約含2億個有效精子。

1.1.2 儀器設備 全自動精子質(zhì)量分析系統(tǒng)(scA780-54fc，法國卡蘇)，生物顯微鏡(M200D，Motic)，恒溫水浴鍋，17 ℃恒溫箱，50 L液氮罐。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷凍精液解凍 2個恒溫水浴鍋溫度分別設置為50 ℃和36 ℃。從液氮罐中夾取所需數(shù)量的細管凍精，迅速投入50 ℃恒溫水浴鍋中保持16 s后迅速轉入36 ℃恒溫水域鍋中。凍精在50 ℃恒溫水浴鍋中解凍期間，始終保持在水面以下，并不斷晃動，以保證其均勻受熱解凍。

1.2.2 不同稀釋方法對精子活率和形態(tài)的影響 Ⅰ組凍精解凍后注入40 mL事先預熱至36 ℃的稀釋液中并輕輕震蕩混勻備用。Ⅱ組凍精解凍后注入一個潔凈的預熱至36 ℃的空試管中，然后緩慢加入20 mL事先預熱至36 ℃的稀釋液，并輕輕震蕩混勻，待精子適應5 min后再緩慢加入剩余20 mL等溫的稀釋液，使其達到40 mL的輸精體積。

上述2種方法稀釋的冷凍精液，在36 ℃恒溫水域鍋中孵育5 min后分別用潔凈的玻璃棒蘸取1滴精液至于載玻片上，蓋上蓋玻片(避免氣泡)，使用全自動精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測定活率。同時采用馬紅等[11]描述的方法評定質(zhì)膜完整率和頂體完整率，以評估2種稀釋方法對精子形態(tài)結構的影響。

1.2.3 不同保存溫度和時間對解凍后冷凍精液活率的影響 采用兩步稀釋法稀釋4支細管凍精，在36 ℃恒溫水域鍋中孵育5 min后測定精子活率，然后將其分為2份，每份20 mL。其中1份仍然置于36 ℃恒溫水浴鍋中，每隔5 min測定1次精子活率，直至精子活率低于40%為止；另1份包裹毛巾后至于17 ℃恒溫箱中，第一天每隔5 h測定1次精子活率，從第2天開始每隔12 h測定1次精子活率，直至精子活率低于50%為止。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 上述試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同稀釋方法對精液凍后活率及形態(tài)的影響

由表1可知，Ⅱ組精子凍后活率為82.6%，極顯著高于Ⅰ組精子活率(P<0.01)。Ⅱ組精子解凍后質(zhì)膜完整率和頂體完整率均極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，說明兩步稀釋較一步稀釋可有效緩解稀釋打擊。另外，Ⅰ組中是將解凍后的細管精液注入到稀釋液中，加重了稀釋打擊效應，這也可能是其精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率較低的原因。

表1 不同稀釋方法對豬冷凍精液凍后活率和形態(tài)的影響Table 1 The effect of dilution methods on motility rate after freezing and shape of thawed swine semen %

2.2 不同保存時間和溫度對解凍后精液活率的影響

從表2數(shù)據(jù)可見，豬冷凍精液解凍、稀釋后保存于36 ℃的恒溫水浴鍋中，5 min、10 min和15 min三次測定結果差異不顯著(P>0.05)。隨著保存時間的延長，精子活率會出現(xiàn)較快的下降，20 min和25 min的測定結果顯著低于前15 min 的精子活率(P<0.05)，且顯著高于第30 min的精子活率(P<0.05)，30 min后精子活率以更快的速度下降，35 min和40 min時精子活率極顯著低于30 min前的精子活率(P<0.01)。但是在40 min的保存時間內(nèi)，未見精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。

表2 不同保存溫度和時間對解凍后冷凍精液活率的影響Table 2 The effect of storage temperature and time on motility rate and shape of thawed swine semen

豬冷凍精液解凍、稀釋后保存于17 ℃的恒溫箱中，精子活率可得到較長時間的保持(表2)。15 h內(nèi)精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率均無顯著差異(P>0.05)，第20 h時精子活率和質(zhì)膜完整率顯著低于前期檢測結果(P<0.05)，但頂體完整率和前期檢測結果差異不顯著(P>0.05)。保存至20 h以后精子各項指標均出現(xiàn)較快的下降，至48 h時精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率已極顯著低于前20 h的測定結果(P<0.01)。

3 討 論

3.1 稀釋對解凍后精子活率及形態(tài)的影響

豬為多胎動物，子宮角長，需要輸入足量體積和有效精子數(shù)的精液，才能保障正常的情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。生產(chǎn)中，新鮮精液常規(guī)輸精的體積一般每次為80 mL(約含80億有效精子)，即使采用深部數(shù)據(jù)技術，輸精量一般也在60 mL(約含60×108有效精子)[10]。所以，豬細管冷凍精液解凍后需要用稀釋液稀釋至一定體積后才能輸精。

目前，豬凍精生產(chǎn)企業(yè)提供了專用的瓶裝稀釋液，用于解凍后細管凍精的稀釋，體積一般是每瓶40 mL。實際生產(chǎn)中為了操作方便，將解凍后的細管凍精直接注入稀釋液中進行稀釋。按照精液稀釋的操作要求，應將稀釋液緩慢加入精液并輕輕混勻，若進行高倍稀釋時應進行兩步稀釋[13]，以最大限度的避免稀釋打擊[12]?？梢娚鲜霾僮黠@然是不符合精液稀釋操作要求。從試驗結果亦可以看出，同一批細管凍精，在同樣的解凍溫度和時間下，采用兩步稀釋并采用正確的稀釋方法將稀釋液加入精液中(Ⅱ組)，所得精子凍后活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率均極顯著高于企業(yè)推薦的稀釋方法(Ⅰ組)(P<0.01)，從精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率出現(xiàn)極顯著下降可以推斷，精子凍后活率的下降是由于精子結構損傷所致。

精子作為一種特殊的細胞，其結構很容易受到外界因素的影響。馬紅等[13]的研究表明，離心力和離心時間的增加不利于精子質(zhì)量的保持，當使用1 000×g和1 200×g離心力豬精液時，豬精子質(zhì)量會出現(xiàn)顯著下降，采用800×g的離心力離心15 min可獲得最佳的離心效率和凍后精子質(zhì)量。劉莉等[14]發(fā)現(xiàn)，冷凍前17 ℃過夜保存對豬精子結構未見明顯影響，但是從17 ℃降溫至4 ℃，以及4 ℃平衡1.5 h均對精子結構產(chǎn)生一定程度的損傷。豬冷凍精液制作及使用是一個系統(tǒng)的操作過程，主要包括稀釋、離心、二次稀釋、降溫平衡、灌裝、冷凍、解凍和三次稀釋等技術環(huán)節(jié)，每一步均會對精子有不同程度的損傷。本試驗對解凍后豬精子稀釋方法的研究，可為優(yōu)化豬冷凍精液解凍后稀釋操作進而提高豬精子凍后活率提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 解凍后保存溫度和保存時間對豬冷凍精液解凍后精子活率及形態(tài)的影響

解凍、稀釋后的冷凍精液一般都置于36 ℃的恒溫水浴鍋中暫時保存，待解凍完所需凍精后再送到豬舍輸精。但是解凍、稀釋后的豬冷凍精液36 ℃保存多長時間不會影響精子凍后活率和質(zhì)量尚未見文獻報道。母豬散養(yǎng)戶大多既沒有實驗室條件，也沒有專業(yè)技術人員，使用的凍精一般根據(jù)其需求量解凍、稀釋好以后再配送，所以從解凍到輸精中間要間隔較長的時間，需要將精液暫時保存于17 ℃的恒溫箱中進行配送，但是解凍后的豬凍精在17 ℃可以保持多少時間較為可靠亦鮮有文獻報道。

上述兩種情況給實際生產(chǎn)中豬冷凍精液的使用造成了很多困擾，也可能是目前豬冷凍精液配種成績差異較大的重要原因[15-17]。本研究結果表明，豬冷凍精液解凍、稀釋后保存于36℃的恒溫水浴鍋中，15 min內(nèi)精子活率無顯著降低(P>0.05)，20 min后精子活率即開始迅速降低(P<0.05)，由于精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)，可能原因是精子快速運動導致能量耗盡而死亡所致，所以最好在解凍后15 min內(nèi)完成輸精?？紤]到實際生產(chǎn)中解凍、稀釋的精液帶出實驗室后溫度一般均會低于36 ℃，精子運動速度降低，自身攜帶的能量可以維持更長的時間，精子活率下降速度亦隨之變慢，所以最多應該在解凍后30 min內(nèi)完成輸精。解凍、稀釋后保存于17 ℃恒溫箱中15 h內(nèi)的豬精液精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率均無顯著差異(P>0.05)，此后各項指標即以較快的速度下降。所以，給母豬散養(yǎng)戶配送的精液，必須解凍、稀釋后保存于17 ℃恒溫箱中，最好在15 h內(nèi)完成配送和輸精。

4 結 論

本研究對豬冷凍精液解凍后的稀釋方法、保存溫度和時間對精子質(zhì)量的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)與凍精一步稀釋法相比，采用兩步法稀釋可極顯著提高精子的凍后活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。