精子頂體發(fā)育相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展

常天晴，吳華，馮睿芝，錢云

精子發(fā)生由一系列復(fù)雜而精細(xì)的生物學(xué)過程構(gòu)成，主要包括有絲分裂、減數(shù)分裂和精子變形。精子變形是指減數(shù)分裂后期形成的單倍體圓形精子細(xì)胞經(jīng)過一系列的形態(tài)變化最終成為成熟精子的過程，包括染色質(zhì)重塑、頂體形成、線粒體重排、鞭毛組裝和細(xì)胞質(zhì)殘余體移除等[1]。頂體形成是精子變形過程中的重要事件，涉及前頂體囊泡的形成和運(yùn)輸、前頂體囊泡的融合、頂體在細(xì)胞核上的附著等主要生物學(xué)事件。精子頂體各階段的發(fā)育均受到相關(guān)蛋白的精確調(diào)控，蛋白之間相互作用并表現(xiàn)出復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，相關(guān)蛋白的異常導(dǎo)致精子頂體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，從而引起男性生育力減退甚至不育。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬機(jī)制參與了頂體形成過程中高爾基體源性囊泡運(yùn)輸和融合過程[2]。盡管對于精子發(fā)生過程中頂體的形態(tài)變化已有充分的研究，但其精確的分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的發(fā)掘。本文按照頂體發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)事件發(fā)生順序，對近年相關(guān)蛋白的研究進(jìn)行綜述，以探討頂體形成背后復(fù)雜的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并提出了未來進(jìn)一步的研究方向。

1 頂體的形成及其功能

1.1 頂體的形成頂體的形成分為四個階段：高爾基體階段、頂帽階段、頂體階段和成熟階段[3]。在高爾基體階段，高爾基體產(chǎn)生前頂體囊泡，之后對其進(jìn)行分類并運(yùn)送至核表面，在核表面前頂體囊泡融合形成一個大的頂體囊泡[4]。在頂帽階段，頂體囊泡變大，糖蛋白含量增加，并擴(kuò)散到細(xì)胞核上形成類似帽子的結(jié)構(gòu)。在頂體階段，頂體發(fā)生縮合并附著在頂體內(nèi)膜上，染色質(zhì)凝聚。最后的成熟階段細(xì)胞核繼續(xù)濃縮，核形態(tài)發(fā)生變化，頂體發(fā)生遷移，頂體顆粒遍布整個頂體膜，頂體分化為前部和后部[5]。

1.2 頂體的功能頂體是精子特有的細(xì)胞器，呈帽狀覆蓋在精子核的前部，其內(nèi)充滿了促進(jìn)精子-卵子相互作用的蛋白水解酶和受體。頂體是精子與透明帶結(jié)合和穿透的基礎(chǔ)，其幫助精子穿過放射冠和透明帶，釋放出一系列頂體酶并與卵母細(xì)胞融合，發(fā)生頂體反應(yīng)，其正常形態(tài)和功能對受精起決定性作用。頂體反應(yīng)是保證受精成功的關(guān)鍵步驟之一，在此過程中，外部的頂體膜與內(nèi)部的精子細(xì)胞質(zhì)膜融合，導(dǎo)致頂體酶的釋放，從而分解卵子的外部保護(hù)層，使精子到達(dá)卵子的細(xì)胞質(zhì)[6]。

2 前頂體囊泡的形成和運(yùn)輸相關(guān)蛋白

高爾基體相關(guān)囊泡的形成和運(yùn)輸是頂體形成過程中的重要事件。液泡蛋白分選（vacuolar protein sorting，VPS）家族成員VPS13B定位于高爾基體膜，與高爾基體相關(guān)的小GTP酶RAB6相互作用[7]。Da Costa等[4]研究發(fā)現(xiàn)，VPS13B對于前頂體囊泡的正常運(yùn)輸是必需的。VPS13B在高爾基體階段精子細(xì)胞的前頂體囊泡中表達(dá)，Vps13b-/-雄性小鼠不育，表現(xiàn)出嚴(yán)重的少弱畸形精子癥。VPS13B蛋白的缺失導(dǎo)致精子頂體發(fā)生受損，精子細(xì)胞的前頂體囊泡沒有到達(dá)核膜，而是最終被包裹在溶酶體中，精子細(xì)胞變形或形成異常圓頭精子細(xì)胞，精子濃度、活力均明顯降低。

Rab蛋白是一類小GTP酶，調(diào)節(jié)真核細(xì)胞內(nèi)的小泡運(yùn)輸；Rab2對于成熟降解的內(nèi)溶酶體和自溶酶體的生成至關(guān)重要[8]。研究顯示，具有序列相似性的家族71成員F1（family with sequence similarity 71 member F1，F(xiàn)AM71F1）是睪丸優(yōu)勢表達(dá)蛋白，含有RAB2B結(jié)合區(qū)。也有研究發(fā)現(xiàn)睪丸組織FAM71F1的表達(dá)在男性不育患者中顯著下調(diào)[9]。Morohoshi等[6]研究表明，F(xiàn)AM71F1與活性RAB2A/B結(jié)合形成的復(fù)合物抑制了頂體形成過程中過度的囊泡運(yùn)輸。Fam71f1-/-小鼠的精子頂體在圓形精子細(xì)胞階段異常擴(kuò)張，頂體反應(yīng)相關(guān)的精卵融合蛋白1（izumo spermegg fusion protein 1，IZUMO1）受到損害，因此FAM71F1對于正確的頂體形成和正常的雄性生育是必需的[6]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，纖維鞘相互作用蛋白（fibrous sheath interacting protein，F(xiàn)SIP）在頂體囊泡形成中具有重要作用。Gamallat等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SIP1不僅是一種纖維鞘細(xì)胞骨架蛋白，而且是一種參與長形精子細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的必需蛋白。FSIP1缺失影響精子發(fā)生核心蛋白的表達(dá)，減弱了鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍椎墓δ?，顯著下調(diào)了大多數(shù)參與頂體囊泡形成的蛋白質(zhì)，因而在頂體發(fā)生和鞭毛形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。FSIP1蛋白在圓形精子細(xì)胞中表達(dá)最高，與頂體囊泡蛋白1（acrosomal vesicle protein 1，ACRV1）相互作用，并在第9～12步精子形成期間從細(xì)胞核移位到頂體。Fsip1-/-小鼠是不育的，精子數(shù)量和活力顯著下降，精子頭部畸形，鞭毛組裝失敗，頂體囊泡破裂[10]。Fang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SIP2過表達(dá)小鼠圓形精子細(xì)胞中上調(diào)基因在頂體囊泡中富集，F(xiàn)SIP2在頂體區(qū)域與ACRV1相互作用調(diào)節(jié)ACRV1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而參與頂體形成。Zheng等[12]通過全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）在弱精子癥患者中發(fā)現(xiàn)了新的雙等位基因FSIP2變異體，通過綜合形態(tài)學(xué)分析，在患者的精子中觀察到大量圓頭精子和（或）頂體發(fā)育不全精子，免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique）顯示，F(xiàn)SIP2在人類和小鼠精子形成過程的各個時期的頂體中都有表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)SIP2和參與頂體發(fā)育的蛋白[如熱休克蛋白90B1（heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1）、KIAA1210、HSPA2]相互作用，并且FSIP2調(diào)節(jié)DPY19L2（dpy 19-like 2）和精子頂體相關(guān)蛋白1（sperm acrosome associated 1，SPACA1）的表達(dá)。

另有研究表明，著絲粒蛋白E（centromeric protein E，CENP-E）以緊湊的結(jié)構(gòu)沿著微管運(yùn)送相關(guān)物質(zhì)[13]。She等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CENP-E在精子發(fā)生過程中介導(dǎo)膜運(yùn)輸和囊泡運(yùn)輸，對頂體形成具有重要作用。小鼠睪丸長期注射變構(gòu)抑制劑GSK923925特異性抑制CENP-E后，睪丸生精小管結(jié)構(gòu)紊亂，生精過程中斷，長形精子細(xì)胞形態(tài)異常。組織化學(xué)及透射電子顯微鏡分析顯示，CENP-E被GSK923925抑制后，頂體形態(tài)不規(guī)則，頂體顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，高爾基體源性囊泡的數(shù)量顯著減少[14]。

3 前頂體囊泡融合相關(guān)蛋白

前頂體囊泡形成后被運(yùn)輸至精子的細(xì)胞核表面，在細(xì)胞核表面相互融合形成一個大的頂體囊泡，相關(guān)蛋白異常會造成囊泡融合失敗從而影響頂體的正常發(fā)育。AU040320是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于質(zhì)膜、核內(nèi)體、高爾基體和反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)蛋白（trans Golgi network，TGN）。Guidi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AU040320蛋白定位于生殖細(xì)胞的TGN，但在成熟的頂體中未檢測到，表明該蛋白可能是前頂體囊泡正常形成所必需的。AU040320-/-雄性小鼠不育，精子運(yùn)動能力受損，頭部畸形，缺乏頂體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的精子超微結(jié)構(gòu)分析顯示，前頂體囊泡在圓形精子細(xì)胞頂體附近積聚，但不能融合成單個頂體囊泡，最終導(dǎo)致頂體發(fā)育異常。

高爾基體基質(zhì)蛋白130（Golgi matrix protein 130，GM130）是一種與高爾基體膜緊密結(jié)合的高爾基體基質(zhì)蛋白，與高爾基體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P115和高爾基體重組與堆疊蛋白65（Golgi reassembly stacking protein 65，GRASP65）相互作用，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡與高爾基體膜融合過程中發(fā)揮重要作用，從而保持高爾基體結(jié)構(gòu)的完整性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，GM130-/-雄鼠不育，精子缺乏頂體結(jié)構(gòu)、頭部呈圓形、線粒體鞘組裝異常，與人類圓頭精子癥特點一致[17]。免疫熒光結(jié)果顯示，精子發(fā)生過程中P115和GRASP65蛋白不能被募集到高爾基體中，導(dǎo)致高爾基體的碎片化，許多高爾基體衍生的前頂體囊泡聚集在髓質(zhì)區(qū)而未能融合成單個大頂體囊泡[17]。此外，睪丸生精細(xì)胞中銜接蛋白1（adaptin 1）和TGN46的共定位被破壞，這表明頂體發(fā)生異?？赡苁怯捎谏?xì)胞中高爾基體衍生的前頂體囊泡未能正確組裝而導(dǎo)致囊泡融合失敗，最終引起GM130-/-雄鼠完全不育[17]。

高爾基體微管相關(guān)蛋白210（Golgi-microtubuleassociated protein of 210 kDa，GMAP210）也被稱為甲狀腺激素受體相互作用物11（thyroid hormone receptor interactor 11，TRIP11），對維持高爾基體正常形態(tài)和功能起重要作用。GMAP210是鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白20（intraflagellar transport 20，IFT20）的高爾基膜受體，二者在高爾基體內(nèi)共同發(fā)揮作用[18]。研究已證實IFT20在精子發(fā)生和雄性生殖中發(fā)揮重要作用[19]。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GMAP210蛋白在睪丸和肝臟中高表達(dá)，在睪丸發(fā)育過程中GMAP210的表達(dá)水平隨年齡增長而增加。在頂體形成的正常過程中，前頂體囊泡的融合以及一些頂體蛋白的正常表達(dá)和定位都需要GMAP210參與。生殖細(xì)胞特異性Gmap210-/-雄性小鼠生育力顯著下降，精子頭部呈長橢圓形并缺乏頂體，進(jìn)一步超微結(jié)構(gòu)分析顯示，精子細(xì)胞中的高爾基體更加分散，前頂體囊泡沒有融合，因此不能形成帽狀頂體囊泡。此外，Gmap210-/-小鼠睪丸SPACA1、透明帶結(jié)合蛋白1（acrosomal protein zona pellucida binding protein 1，ZPBP1）和IFT20的表達(dá)水平顯著下降，IFT20在各級生精細(xì)胞中的定位亦發(fā)生異常[20]。

中心體蛋白70（centrosomal protein 70，CEP70）屬于CEP家族，在人類精子發(fā)生的不同階段都有表達(dá)，特別是在減數(shù)分裂和變形階段高表達(dá)[21]。CEP70還參與微管的伸展和動態(tài)調(diào)節(jié)[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠CEP70的缺失導(dǎo)致與精子鞭毛、頭部、頂體和微管細(xì)胞骨架形成相關(guān)的蛋白顯著減少，精子發(fā)生受阻于Ⅶ期和Ⅷ期，大部分圓形精子細(xì)胞不能發(fā)育至長形精子細(xì)胞，Cep70-/-小鼠精子細(xì)胞高爾基體階段可以發(fā)現(xiàn)多個頂體結(jié)構(gòu)，而頂帽階段和成熟階段檢測到空泡化或不規(guī)則形狀的頂體，頂體基質(zhì)成分顯著下調(diào)，精子發(fā)生異常而最終引起不育。

4 頂體在細(xì)胞核上附著的相關(guān)蛋白

除了被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核表面并融合形成單個大的頂體囊泡外，頂體在細(xì)胞核上的附著對其功能也非常重要。DPY19L2蛋白在睪丸中高度表達(dá)，位于精子核膜的內(nèi)膜上，面向頂體，并認(rèn)為其功能障礙與圓頭精子癥的發(fā)生有關(guān)。在Dpy19l2敲除的小鼠精子細(xì)胞中，頂體基質(zhì)不再與頂體緊密結(jié)合，頂體無法沿細(xì)胞核延伸，最終因頂體形成障礙而導(dǎo)致圓頭精子的形成[24]。Castaneda等[5]研究發(fā)現(xiàn)，序列相似家族209（family with sequence similarity 209，F(xiàn)AM209）在哺乳動物睪丸中特異性表達(dá)，是第一個被證明與DPY19L2相互作用的蛋白，定位于內(nèi)核膜上并對頂體發(fā)育至關(guān)重要。在小鼠出生后第20天，睪丸Fam209基因在RNA水平上被檢測到。Fam209-/-小鼠精子活力降低，精子頭部畸形，第9步精子細(xì)胞中頂體致密物質(zhì)異常定位，一些晚期精子細(xì)胞中頂體缺失[5]。

纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白65（cilia and flagella associated protein 65，CFAP65）已被證明定位于人類精子的頂體區(qū)域和鞭毛中段，CFAP65突變會導(dǎo)致嚴(yán)重的弱精子癥，表現(xiàn)為頂體發(fā)育不全和鞭毛畸形[25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在Cfap65-/-小鼠睪丸中，第9步精子細(xì)胞的精子頭部過度狹窄，并伴有精子領(lǐng)（manchette，精子變形過程中短暫出現(xiàn)的特殊裙擺樣結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)缺陷和成熟期頂體發(fā)育異常。進(jìn)一步精子超微結(jié)構(gòu)分析顯示，頂體沿著核周區(qū)異常附著，核周膜中有不規(guī)則腫脹和空泡樣內(nèi)容物。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，當(dāng)CFAP65缺失時，頂體形成過程中的蛋白質(zhì)平衡系統(tǒng)被破壞，SPACA1在第11～12步精子細(xì)胞中顯示異常定位，并且在Cfap65-/-小鼠的成熟精子中不存在；ZPBP在圓形精子細(xì)胞中的表達(dá)減少，并且未能定位在長形精子細(xì)胞的頂體區(qū)域[26]。

頂體下層板（acroplaxome）是核膜和頂體內(nèi)膜之間的特殊骨架結(jié)構(gòu)，是核周層的一部分。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn)肌動蛋白相關(guān)蛋白T1（actin related protein T1，ACTRT1）在精子頂體下層板特異表達(dá)，與ACTRT2、肌動蛋白樣蛋白7A（actin-like protein 7A，ACTL7A）和ACTL9相互作用形成多聚體復(fù)合物，并定位于精子細(xì)胞的亞染色體區(qū)域，Actrt1-/-雄鼠生育率嚴(yán)重降低，精子頭部畸形，頂體下層板結(jié)構(gòu)變得疏松，頂體從核膜上脫落。進(jìn)一步的蛋白相互作用研究發(fā)現(xiàn)，ACTRT1可能通過與SPACA1、多腺苷二磷酸核糖聚合酶11[poly（ADP－ribose）polymerase 11，PARP11]和精子發(fā)生相關(guān)蛋白46（spermatogenesis associated protein 46，SPATA46）相互作用，將發(fā)育中的頂體錨定在細(xì)胞核上。

磷酸蛋白質(zhì)組分析表明，在精子發(fā)育過程中，有幾條依賴于激酶的通路是活躍的，但特定的激酶在精子發(fā)生中的作用尚不清楚[28]。Crapster等[29]研究發(fā)現(xiàn)，同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶4（homeodomaininteracting protein kinase 4，HIPK4）是精子頂體發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在小鼠精子形成和發(fā)育中具有重要功能。HIPK4主要表達(dá)于圓形和早期伸長的精子細(xì)胞中，Hipk4-/-雄鼠不育，表現(xiàn)出與少弱畸形精子癥一致的表型。Hipk4-/-雄鼠精子細(xì)胞的頂體與頂體下層板分離，導(dǎo)致頭部結(jié)構(gòu)異常。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，HIPK4的過表達(dá)誘導(dǎo)分支的絲狀肌動蛋白結(jié)構(gòu)，HIPK4的缺乏改變絲狀肌動蛋白的加帽蛋白在睪丸中的亞細(xì)胞分布，因而HIPK4在細(xì)胞骨架重塑中具有重要作用[29]。

SPACA1是一種定位于頂體內(nèi)膜的膜蛋白，對于精子發(fā)生過程中頂體的擴(kuò)張和避免頂體的退化和消失是必不可少的[30]。Chen等[31]報道了一個SPACA1的純合無義突變，該研究使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析和蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)證明了SPACA1能夠與ZPBP和ACTL7A相互作用，因而在誘導(dǎo)頂體顆粒附著和將頂體連接到細(xì)胞核的過程中具有重要作用。SPACA1的缺失降低了精子中ACTL7A的表達(dá)，并削弱了ACTL7A和SPACA1的相互作用，破壞了頂體基質(zhì)的穩(wěn)定性以及頂體與頂體下層板的對接，最終導(dǎo)致頂體發(fā)育不全。

5 自噬相關(guān)蛋白對頂體形成的作用

自噬是真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）的調(diào)控下，利用溶酶體降解功能失調(diào)或不必要的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)正常生理活動及穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞代謝過程[32]。細(xì)胞自噬與精子發(fā)生過程中多種生理和病理過程密切相關(guān)。Shang等[33]研究發(fā)現(xiàn)自噬缺失會導(dǎo)致精子活力下降，精子尾部結(jié)構(gòu)遭到破壞而出現(xiàn)嚴(yán)重的畸形精子癥。Lei等[34]研究顯示，液泡膜蛋白8（vacuole membrane protein 8，Vac8）增強(qiáng)自噬活性，促進(jìn)精子變形過程中胞質(zhì)核糖體的自噬降解，從而為長形精子的運(yùn)動提供能量。

ATG參與了許多與精子命運(yùn)有關(guān)的重要事件，如睪酮等性激素的產(chǎn)生、外質(zhì)特化結(jié)構(gòu)組裝、頂體發(fā)生和父系線粒體消除等[35]。Atg7-/-雄鼠不育并伴有異常頂體形成，類似于人類圓頭精子癥[36]。特異性敲除雄性生殖細(xì)胞中的Atg5會損害自噬流（autophagic flux），導(dǎo)致頂體發(fā)生缺陷、線粒體重排、過多細(xì)胞質(zhì)和殘余體（residual bodies）的保留，因此小鼠的生育力顯著下降。精子超微及結(jié)構(gòu)分析顯示Atg5-/-小鼠附睪尾精子頭部呈圓形、腫脹、彎曲或雙頭畸形，頂體形成異常，精子活力顯著下降[1]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶，通過對多種底物進(jìn)行脫乙?；谠S多生物過程中起重要作用[37]。SIRT1在細(xì)胞核中對微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的脫乙?；饔檬筁C3重新分布到細(xì)胞質(zhì)，從而介導(dǎo)LC3的核質(zhì)運(yùn)輸，這對于自噬小體的形成是必不可少的[38]。Liu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞特異性Sirt1-/-雄性小鼠幾乎完全不育，精子頭部形態(tài)異常，頂體結(jié)構(gòu)缺陷，進(jìn)一步研究表明，在精子發(fā)生過程中，SIRT1通過對LC3去乙酰化而介導(dǎo)LC3的核質(zhì)運(yùn)輸，LC3進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后立即被ATG7激活，然后轉(zhuǎn)移到高爾基體衍生的小泡中，促進(jìn)頂體生物發(fā)生?？傮w而言，自噬相關(guān)蛋白影響精子頂體發(fā)生的研究相對較少，分子機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

6 結(jié)語

近年全球男性不育癥的發(fā)病率逐年升高，精子異常是男性不育的主要原因。受精是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，精子與卵子相遇后，與卵子透明帶上的特異性蛋白相互作用，誘發(fā)頂體反應(yīng)，與卵子融合最終完成受精過程。作為精子細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，頂體是成功受精的關(guān)鍵所在。頂體不同發(fā)育階段受多種不同的蛋白調(diào)控，頂體發(fā)育相關(guān)蛋白在精子發(fā)生和男性不育癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，頂體結(jié)構(gòu)和功能障礙引起受精失敗而導(dǎo)致男性不育。近年來隨著高通量測序技術(shù)和敲除小鼠模型的廣泛應(yīng)用，已鑒定出許多精子頂體發(fā)育異常相關(guān)不育癥致病基因，并揭示了其在精子發(fā)生和不育癥中的重要作用及相關(guān)機(jī)制，但其精確分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。未來需要更多的研究來證實已發(fā)現(xiàn)的基因是否是人類不育的致病基因，并且對相關(guān)蛋白在人類生育中的作用進(jìn)行有針對性的研究。對頂體發(fā)育相關(guān)蛋白在不育癥中作用的深入研究能夠在一定程度上解釋不育癥的發(fā)病機(jī)制，為男性不育的診斷和治療提供新的思路。此外，對相關(guān)過程的干預(yù)將為新型避孕方法的開發(fā)提供依據(jù)。