反芻動(dòng)物瘤胃纖維降解微生物的研究進(jìn)展

朱相德,李婭楠,徐曉鋒

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要成分，是環(huán)境中含量最豐富的可再生有機(jī)化合物之一[1]。它是由成百上千個(gè)葡萄糖單元通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接的線性聚合物組成的[2]。不同的調(diào)查估計(jì)，全球每年的纖維素產(chǎn)量為1011～1012t[3]。反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)由細(xì)菌、古菌、原蟲和真菌組成的復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)[4]。且每毫升瘤胃液估計(jì)含有約1010個(gè)細(xì)菌，其中約10%是纖維素分解細(xì)菌[5]。研究發(fā)現(xiàn)，降解纖維素的細(xì)菌主要有：產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌[6]，降解纖維素的厭氧真菌包括：厭氧腸真菌[7]、新孢子菌屬、環(huán)孢霉菌屬等[8]。這些纖維降解微生物能夠降解纖維素產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸(VFA)為反芻動(dòng)物提供能量[9]。因此，研究瘤胃纖維降解微生物對(duì)纖維素的降解機(jī)制并提高纖維素利用率具有重要意義。本文從瘤胃纖維降解微生物對(duì)纖維物質(zhì)的降解、瘤胃纖維降解微生物的分離篩選及瘤胃纖維降解微生物的調(diào)控作一綜述，旨在為瘤胃纖維降解微生物的理論研究提供參考。

1 瘤胃纖維降解微生物的降解作用

1.1 纖維素酶

植物性飼料大多含有較高纖維素，其在瘤胃中降解時(shí)需要纖維素降解微生物分泌的酶來(lái)催化。纖維素酶實(shí)質(zhì)上是由多種酶組成的復(fù)合酶[10]主要包括三類：(1)內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶簡(jiǎn)稱為內(nèi)切酶，隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無(wú)定形位置，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的寡糖，從而產(chǎn)生新的鏈端[11]。(2)外切-β-1,4-葡聚糖酶簡(jiǎn)稱外切酶，作用于纖維素多糖鏈的還原端或非還原端，釋放出的產(chǎn)物主要是葡萄糖或纖維二糖，也可作用于微晶纖維素。(3)β-葡萄糖苷酶，水解可溶性纖維糊精和纖維二糖為葡萄糖[12-15]。在纖維素降解過(guò)程中，這三種酶協(xié)同完成降解任務(wù)。

1.2 瘤胃纖維素酶基因的多樣性

反芻動(dòng)物瘤胃微生物能夠分泌各式各樣的酶，挖掘瘤胃這一高效纖維降解系統(tǒng)的重要途經(jīng)就是研究纖維素降解酶基因表達(dá)的多樣性及酶誘導(dǎo)調(diào)控。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們采用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)瘤胃纖維素酶基因的多樣性進(jìn)行研究。Hess等[16]采用宏基因組技術(shù)對(duì)奶牛瘤胃微生物進(jìn)行了測(cè)序, 共鑒定了27 755 個(gè)碳水化合物活性酶基因, 并有90個(gè)候選蛋白表達(dá)，其中57%的能降解纖維素。 這些基因的發(fā)現(xiàn)為以后發(fā)掘更多新型的纖維素酶開辟了道路。Javad等[17]在駱駝瘤胃中發(fā)現(xiàn)66 個(gè)較完整的基因組，其中擬桿菌含有較高比例的脫支酶和寡糖降解酶基因，厚壁菌和纖維桿菌門富含纖維素酶和半纖維素酶基因，顯示出極高的多樣性。張慧敏等[18]對(duì)海子水牛進(jìn)行宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)具有木質(zhì)纖維素降解能力的蛋白質(zhì)是由38 011 個(gè)基因所編碼, 其中糖苷水解酶 (GH) 基因數(shù)量最多 (17 877 個(gè)) 、 糖基轉(zhuǎn)移酶 (GT) (8 637 個(gè)) 、碳水化合物結(jié)合模塊 (CBM) (4 693 個(gè)) 和碳水化合物酯酶 (CE) 基因 (4 214 個(gè)) 數(shù)量次之, 多糖裂合酶 (PL) (1 296 個(gè)) 和輔助氧化還原酶 (AA) 基因 (934個(gè)) 數(shù)量較少。且研究發(fā)現(xiàn)糖苷水解酶家族(GHs)5、6、7、8、9、10、12、44、45、51、61和74具有纖維素水解活性[19]。其中GH7家族纖維素酶主要集中于整個(gè)內(nèi)切纖維素酶系中，GH5家族中纖維素酶種類較為多樣[20]， GH6和GH7家族中外切葡聚糖酶含量豐富[21]，β-葡萄糖苷酶多在GH3家族[22]?？傊?，瘤胃中存在大量還未挖掘的纖維素酶基因，如果能將其分離并在工程菌中表達(dá)將極具應(yīng)用前景。

1.3 纖維素酶降解纖維素的作用機(jī)制

纖維素酶降解纖維素的作用機(jī)制目前未有定論，不同研究者的觀點(diǎn)有一定的分歧。主要理論有：1950 年，Reese等[23]提出的C1-Cx假說(shuō)，即結(jié)晶纖維素首先被C1酶(外切葡聚糖酶)作用變?yōu)闊o(wú)定形纖維素，再通過(guò)Cx酶(內(nèi)切葡聚糖酶)的水解作用將無(wú)定形纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維二糖，最后纖維二糖被進(jìn)一步水解為葡萄糖。Enari等[24]提出的順序作用假說(shuō)，即首先纖維素被外切葡聚糖酶降解為可溶的纖維糊精和纖維二糖，然后由內(nèi)切葡聚糖酶將可溶性物質(zhì)全部轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維二糖，最后β-葡萄糖苷酶降解纖維二糖為葡萄糖。目前更受關(guān)注的有關(guān)纖維素降解的協(xié)同理論，其具體內(nèi)容為：首先內(nèi)切葡聚糖酶切割纖維素，釋放了自由鏈末端；然后這些末端被外切葡聚糖酶降解，當(dāng)它們沿著鏈移動(dòng)時(shí)會(huì)釋放纖維二糖，最后β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖[10]。

1.4 纖維小體

可分解纖維素的厭氧細(xì)菌能夠產(chǎn)生一種多酶復(fù)合體--纖維小體(cellulosome)，用于降解木質(zhì)纖維素[25]。纖維小體是由支架蛋白的粘附素模塊和各種多糖降解酶的Dockerin (對(duì)接蛋白)模塊之間的蛋白質(zhì)相互作用形成的超分子多酶復(fù)合體[26]。Lamed等[27]首次發(fā)現(xiàn)其存在于超嗜熱厭氧微生物熱纖梭菌 (clostridium thermocellum) 中并鑒定, 分子大小為2×106～6×106u, 由14～50個(gè)亞基組成。在瘤胃四種主要的能夠降解纖維素的細(xì)菌中黃色瘤胃球菌是唯一已知的通過(guò)產(chǎn)纖維素酶進(jìn)一步組裝成纖維小體去降解纖維素的細(xì)菌[28]。從它的基因組草圖中發(fā)現(xiàn)223個(gè)含有Dockerin的開放閱讀框。這是在梭狀芽孢桿菌中觀察到的纖維小體的組分的三倍，使其纖維小體成為迄今為止最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[29]。白色瘤胃球菌的糖苷水解酶蛋白缺少Dockerin[30]，表明它的糖苷水解酶蛋白只保留在細(xì)菌細(xì)胞表面，并沒(méi)有形成真正的纖維小體，而是通過(guò)碳水化合物底物被碳水化合物連接域黏附來(lái)開展分解活動(dòng)[31]。厭氧真菌的的纖維小體與厭氧纖維降解細(xì)菌的纖維小體有許多相似的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，也是酶通過(guò)真菌的Dockerin連接到支架蛋白上，但它們的結(jié)構(gòu)在氨基酸序列上有所不同[32]。

1.5 厭氧真菌對(duì)纖維物質(zhì)的降解

厭氧真菌屬于新麗鞭毛菌門[33]。雖然它們?cè)诹鑫钢泻枯^低，但由于其有多糖降解酶庫(kù)[34]，因此在飼料植物結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解中發(fā)揮重要作用[35]。其從兩個(gè)方面降解纖維素，第一，厭氧性真菌存在豐富的假根系統(tǒng)，通過(guò)其穿透作用促使瘤胃內(nèi)的纖維素疏松；第二，厭氧性真菌在瘤胃體內(nèi)分泌出纖維素酶將已經(jīng)被疏松的纖維素分解成VFA，最后VFA被動(dòng)物直接吸收[36]。

2 瘤胃纖維降解微生物的分離篩選

隨著16S rRNA測(cè)序分析技術(shù)和ITS區(qū)高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用[37]，人們對(duì)瘤胃微生物有了更加全面的認(rèn)識(shí)。為了研究單個(gè)菌落的降解特性，研究者借助Hungate滾管法[38]和選擇培養(yǎng)法[39]，已經(jīng)分離篩選出了多種具有纖維降解能力的細(xì)菌及真菌。Sari等[40]在亞齊牛瘤胃瘤胃液中分離出了一種纖維素降解菌，經(jīng)鑒定其可能是腸桿菌科的一個(gè)新種或另一個(gè)屬；韋海婷[41]從梅花鹿瘤胃中分離出了蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌兩株纖維降解菌； Aihemaiti[42]從新疆綿羊、牛、駱駝的瘤胃液中分離出84 株纖維素降解菌株，其中40 株表現(xiàn)出較強(qiáng)的纖維素分解能力。其中革蘭氏陰性菌株37 株，革蘭氏陽(yáng)性菌株3 株。

Orpin[43]于1975 年首次證明了厭氧真菌在瘤胃中是存在的。隨著研究的不斷深入，Sun[44]采用Hungate滾管法分離了28 個(gè)纖維素分解厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)的菌株；Resende[45]從荷斯坦奶牛瘤胃中分離了12 株能夠降解木質(zhì)纖維素的真菌菌株；李敏[46]采用體外亨氏滾管培養(yǎng)技術(shù)，從綿羊瘤胃液中分離得到3 株具有纖維降解能力的厭氧真菌，經(jīng)鑒定其為Neocallimastix屬菌，Piromyces屬菌和Cyllamyces屬菌；Wei等[47]從青藏高原放牧牦牛瘤胃中分離到20 株真菌-產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)物。

近年來(lái)，兼性厭氧菌也相繼被分離出來(lái)。李君風(fēng)[48]從牦牛瘤胃中分離出具有分解纖維素能力的兼性厭氧菌，經(jīng)鑒定為糞腸球菌；李潤(rùn)泫[36]在野生動(dòng)物牦牛瘤胃液中也篩選出17 株具有纖維降解能力的兼性厭氧細(xì)菌；呂宗浩[49]從奶牛瘤胃液中采用羧甲基纖維素鈉平板法篩選出了特基拉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等15 株兼性纖維素分解菌。

3 瘤胃纖維降解微生物的調(diào)控

瘤胃中纖維物質(zhì)的降解任務(wù)是由瘤胃纖維降解微生物所執(zhí)行，主要是細(xì)菌。因此，優(yōu)化激活瘤胃纖維降解微生物是非常重要的[50]。影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物菌群發(fā)生變化的主要因素是飼料的組成及其本身的性質(zhì)[51-52]。研究者通過(guò)改變飼糧性質(zhì)、種類、調(diào)制方法以及添加各類添加劑的手段來(lái)調(diào)控瘤胃纖維降解微生物，以促進(jìn)纖維降解微生物種群的生長(zhǎng)和活性，改善飼料的消化。調(diào)控效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括纖維消化率以及瘤胃細(xì)菌豐度和活性[50]。

3.1 碳水化合物的調(diào)控作用

反芻動(dòng)物瘤胃微生物的能量主要來(lái)源于瘤胃微生物對(duì)碳水化合物降解所產(chǎn)生的能量。日糧中碳水化合物的組成和比例變化會(huì)導(dǎo)致瘤胃纖維降解微生物的群落的變化[53]。而碳水化合物對(duì)瘤胃纖維降解微生物的影響研究主要集中在非纖維性碳水化合物(NFC)與中性洗滌纖維(NDF)之間的比值對(duì)瘤胃纖維降解微生物纖維降解能力的影響研究。

普宣宣等[54]研究發(fā)現(xiàn)，卡拉庫(kù)爾羊瘤胃纖維降解菌、半纖維素降解菌分別在NFC/NDF為0.96、1.37時(shí)相對(duì)豐度最高；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率在NFC/NDF為1.37時(shí)得到提高；還發(fā)現(xiàn)，NFC/NDF為0.96時(shí)纖維素酶活性最高，比例提高酶活反而降低[55]。Song等[56]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的豐度隨著NFC/NDF比值的升高而顯著降低。高NFC/NDF比增加了瘤胃總VFA的產(chǎn)生，尤其是丙酸，降低了乙酸，從而降低了乙酸與丙酸比，降低了纖維素酶和木聚糖酶活性。造成上述結(jié)果的原因可能是NFC在瘤胃中降解速度快并產(chǎn)生了大量的乳酸和丙酸，使瘤胃pH下降，而pH值過(guò)低會(huì)使瘤胃纖維降解微生物的生長(zhǎng)受到抑制和降低纖維素酶活[57-58]。以上研究表明，碳水化合物通過(guò)改變瘤胃發(fā)酵模式、改變瘤胃內(nèi)環(huán)境來(lái)影響纖維降解菌的增殖和纖維素酶活，從而影響反芻動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。因此，飼糧中碳水化合物的結(jié)構(gòu)比例對(duì)反芻動(dòng)物意義重大。

3.2 飼料加工的調(diào)控作用

飼料加工對(duì)瘤胃纖維素降解微生物影響的研究成果更容易在生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)，因此研究者們也積極在此方面進(jìn)行了研究。陳青[59]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃纖維降解菌的含量隨著通過(guò)羊草長(zhǎng)度改變實(shí)現(xiàn)的物理有效中性洗滌纖維(peNDF)水平的適當(dāng)增加而增加，提高了pH和改善瘤胃發(fā)酵。于滿滿[60]研究發(fā)現(xiàn)，不同比例氨化玉米秸稈和苜蓿組合均會(huì)降低發(fā)酵瘤胃液中黃色瘤胃球菌和瘤胃原蟲的相對(duì)數(shù)量，而真菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌群。比例為20∶80時(shí)乙酸和總VFA濃度最高。辛杭書[61]研究發(fā)現(xiàn)，氨化和堿化處理的水稻秸稈在體外培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)數(shù)量顯著提高，72 h后，顯著增加了總VFA濃度?？傮w而言，適當(dāng)?shù)娘暳霞庸し椒▽?duì)瘤胃纖維降解菌具有積極的調(diào)控作用，能通過(guò)增加纖維降解菌的數(shù)量和組成來(lái)提高對(duì)飼料纖維物質(zhì)的消化。

3.3 添加劑的調(diào)控作用

添加劑對(duì)纖維素降解微生物影響的研究涉獵較廣，包括多種添加劑對(duì)纖維降解微生物的影響。Sousa等[62]給全年放牧的尼羅爾牛添加活性酵母，結(jié)果表明，補(bǔ)充活性酵母能使纖維降解菌受益，并提高放牧動(dòng)物的纖維消化率，且不受季節(jié)的影響。Mamuad等[63]添加0.1%的糞腸球菌，改變了微生物群落的豐度和組成，瘤胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)和黃色瘤胃球菌的數(shù)量最高，顯著提高了丙酸和總VFA濃度。Kido等[64]研究了添加低聚纖維糖(Cellooligosaccharides, CE)對(duì)放牧犢牛生長(zhǎng)性能的影響。結(jié)果表明，添加CE對(duì)斷奶犢牛瘤胃微生物組成中纖維分解菌比例的增加有所幫助，且平均日增重(ADG)高于未添加組的。Zhou等[65]在山羊精料中添加不同水平的胡椒提取物(Piper sarmentosum extract , PSE)，結(jié)果表明，添加PSE后不同處理間黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的含量不同，且濃度在1 200 mg/kg時(shí)含量最低。降低了瘤胃乙酸、戊酸濃度和乙酸/丙酸比值。徐曉鋒[66]研究發(fā)現(xiàn)，添加甘露寡糖能夠緩解因飼喂大量淀粉導(dǎo)而致的纖維降解菌豐度的下降，對(duì)瘤胃纖維降解能力的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，不同添加劑會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃纖維降解微生物產(chǎn)生不同程度的影響，從而影響瘤胃發(fā)酵、纖維消化及生長(zhǎng)性能等。并且隨著抗生素的禁用，開發(fā)新的添加劑顯得尤為重要，但要考慮添加劑的功能、特性以及添加量等。

4 展 望

長(zhǎng)期以來(lái)，人類在探索反芻動(dòng)物瘤胃方面付出了很多努力，并在從中收獲了很多經(jīng)驗(yàn)、研究方法以及新技術(shù)。目前對(duì)于瘤胃纖維降解微生物的研究包括兩個(gè)方面：一個(gè)方面是通過(guò)分離優(yōu)勢(shì)單菌研究其降解特性以及添加不同添加物對(duì)其增殖的影響；另一個(gè)方面是以瘤胃為整體研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)序技術(shù)來(lái)研究日糧組成對(duì)其豐度的影響，并添加不同添加物對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。但這些研究并未完全掌握其作用規(guī)律，因此筆者建議未來(lái)研究可以將宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等技術(shù)關(guān)聯(lián)起來(lái)，揭示瘤胃纖維降解微生物的代謝規(guī)律、作用機(jī)制、調(diào)控規(guī)律等。這樣人們可以更全面的認(rèn)識(shí)瘤胃纖維降解微生物并利用其代謝規(guī)律來(lái)合理搭配飼料從而提高粗飼料資源的利用率。