宮頸癌患者殺傷性T細胞中CD39分子表達水平及臨床相關(guān)性研究

莊俊紅

摘要：目的：研究腫瘤患者外周血中淋巴細胞亞群的各項指標及CD39分子表達水平和腫瘤患者臨床信息及預(yù)后的相關(guān)性。方法：選取宮頸癌患者共43例，收集腫瘤患者外周血并用流式細胞術(shù)檢測和分析外周血中淋巴細胞亞群7項指標及CD39分子表達水平，同時收集腫瘤患者的臨床信息，分析兩者是否具有相關(guān)性。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中淋巴細胞亞群7項指標，其中CD8陽性T細胞絕對數(shù)及CD4/CD8比值同患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān);此外在宮頸癌中CD4陽性和CD8陽性T淋巴細胞表面CD39分子的表達水平同患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌早中期患者外周血中CD8陽性T細胞的數(shù)量較晚期患者明顯增多，提示腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的數(shù)量同患者的預(yù)后相關(guān);此外早中期宮頸癌患者CD4陽性和CD8陽性T細胞表面CD39分子表達水平明顯低于晚期患者，提示CD39分子可能同晚期患者CD8陽性T細胞數(shù)量減少相關(guān)。

關(guān)鍵詞：淋巴細胞亞群，流式細胞術(shù)，細胞毒性T細胞

Abstract：Objective? The purpose of this study is to investigate the correlation between lymphocyte subsets， CD39 expression level in peripheral blood of tumor patients and their clinical information and prognosis. Methods Initially， We chose 134 patients who have one of the following cancers： lung cancer， cervical cancer， or breast cancer and collected their clinical information and peripheral blood. Furthermore， we detected 7 indicators of lymphocyte subsets and CD39 expression level in their peripheral blood by flow cytometry and analyzed the correlation between those indicator values of each individual and its corresponding clinical information. Results According to our study， correlation did exist between the absolute counts of CD8+ T cells， the ratio of CD4/CD8 and clinical stages， lymph node metastasis， distant metastasis;and also there is correlation between the CD39 expression level and clinical stages， lymph node metastasis， distant metastasis. Conclusion The number of CD8+ T cells in the peripheral blood of patients with cervical cancer in the early and middle stage is significantly higher than that inthe advanced stage， suggesting that the number of CD8+ T cells is associated with the prognosis of patients. In addition， the expression levels of CD39 molecules on the surface of CD4+ and CD8+ T cells in patients with early and middle stage cervical cancer were significantly lower than those in advanced patients， suggesting that CD39 molecules may be related to the decrease in the number of CD8+ T cells in advanced patients

Key Words：lymphocyte subsets， flow cytometry， cytotoxic T cell

【中圖分類號】R711.74???????????? 【文獻標識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）12--03

人口的增長和老齡化，以及多種不良生活方式導(dǎo)致癌癥患者數(shù)量越來越多，全球癌癥負擔(dān)持續(xù)增加。癌癥的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。機體抗腫瘤免疫中免疫細胞起主導(dǎo)作用，能夠識別和清除腫瘤細胞。流式淋巴細胞亞群作為一種常規(guī)檢查，是反映細胞免疫功能的重要指標，在腫瘤免疫監(jiān)測具有重要意義，進一步為患者的臨床治療方案提供參考依據(jù)。代謝組學(xué)和免疫學(xué)一直是醫(yī)學(xué)生物學(xué)的前言領(lǐng)域。已有文獻報道在腫瘤免疫微環(huán)境中腺苷是一個較為重要的免疫抑制分子，它能夠促進調(diào)節(jié)性T細胞的生成，同時影響免疫微環(huán)境中的其他免疫細胞，從而促進腫瘤細胞的逃逸。而CD39作為腺苷代謝途徑中的起始分子，在腺苷產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用。本研究一方面通過分析患者外周血中CD3陽性T淋巴細胞，CD4陽性T淋巴細胞，CD8陽性T淋巴細胞，B淋巴細胞和NK細胞占淋巴細胞的比例及絕對數(shù)，并將這些指標相結(jié)合，從而評估機體的免疫功能狀態(tài);另一方面通過檢測T細胞上CD39分子的表達水平，同時結(jié)合腫瘤患者的臨床信息，進行相關(guān)性研究，從而探索腺苷代謝途徑的關(guān)鍵分子CD39影響腫瘤患者免疫功能的機制。

1.材料與方法

1.1材料

采集天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院放療科住院患者EDTA抗凝外周血2ml。所有患者采血前均未接受過腫瘤治療，并且具有完整的臨床相關(guān)資料。

1.2實驗方法

取100ul外周血樣本加入流式管中，標記CD3/CD19/CD16+CD56/CD45和CD3/CD4/CD8/CD45抗體（Beckman Coulter公司），室溫孵育15分鐘，加入500ul溶血素（Beckman Coulter公司），室溫靜置10分鐘，PBS洗滌細胞后上機。流式數(shù)據(jù)用Kaluza軟件（Beckman Coulter公司）進行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS statistics 21軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)樣本數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，獨立樣本之間采用t檢驗或者單因素分析檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法;當(dāng)樣本數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時，樣本之間采用非參數(shù)t檢驗和Kruskal-Wallis檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1宮頸癌患者外周血淋巴細胞亞群同其臨床信息的相關(guān)性分析

為了進一步驗證我們上述的結(jié)論，我們再次收集宮頸癌患者43例，年齡分布25-69歲，病理類型都為鱗癌。根據(jù)TNM分期，本研究分別將患者外周血中淋巴細胞亞群的指標與患者臨床信息進行分析。

結(jié)果顯示其中CD3陽性T細胞和CD4陽性T細胞占淋巴細胞百分比和絕對數(shù)與患者的所有臨床信息都無統(tǒng)計學(xué)差異，沒有相關(guān)性，CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比與患者的臨床信息同樣無統(tǒng)計學(xué)差異。宮頸癌患者外周血中淋巴細胞亞群指標CD8陽性T細胞絕對數(shù)及CD4/CD8比值則同宮頸癌患者的臨床T分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，如圖3表2所示。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者其外周血中CD8陽性T細胞的數(shù)量較沒有淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移的患者要少（圖1A和1C），同時CD4/CD8比值明顯升高（圖1B和1D）。根據(jù)單因素分析我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中CD4/CD8比值同T分期具有相關(guān)性，但是CD8陽性T細胞的絕對數(shù)則和T分期無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。進一步分析T1-T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞絕對數(shù)和CD4/CD8比值同T分期的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞數(shù)量要少于T3期（如圖2E所示，有統(tǒng)計學(xué)差異）和T1-T2期（如圖2E所示，無統(tǒng)計學(xué)意義。猜測由于樣本數(shù)量不夠，導(dǎo)致其沒有統(tǒng)計學(xué)差異）。而T4期患者的CD4/CD8比值要明顯高于T1-3期患者（如圖1F所示，均有統(tǒng)計學(xué)差異）。因此早中期宮頸癌患者較晚期宮頸癌患者外周血中具有更多的CD8陽性T細胞數(shù)量和較低的CD4/CD8比值;而有淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞數(shù)量低于無轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，CD4/CD8比值則較高。

通過上述結(jié)果，我們證實了宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數(shù)與患者的腫瘤進展具有相關(guān)性，晚期患者其CD8陽性T細胞較少，自身的免疫功能較弱，更有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，同時也具有更差的預(yù)后。那與CD8陽性T細胞絕對數(shù)該指標相關(guān)聯(lián)的指標CD4/CD8比值也能夠從另一個側(cè)面反應(yīng)肺癌患者的免疫功能狀態(tài)，提示預(yù)后。兩者相結(jié)合從而給臨床一個重要的信息，方便患者的后續(xù)治療。腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數(shù)及其相關(guān)聯(lián)的指標CD4/CD8比值同腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時這兩個指標也是腫瘤患者預(yù)后的獨立因素。外周血中具有較多數(shù)量的CD8陽性T細胞（CD4/CD8比值相對較低）的腫瘤患者具有更好的預(yù)后。

2.2宮頸癌患者外周血中T淋巴細胞亞群表面CD39分子表達水平同臨床信息相關(guān)性分析

腺苷作為免疫微環(huán)境中重要的負性調(diào)控分子，對機體免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用。而CD39分子作為腺苷代謝途徑的關(guān)鍵分子是否也對機體免疫具有調(diào)節(jié)作用？本研究檢測了宮頸癌患者外周血中T淋巴細胞表面CD39分子的表達水平，同時與臨床信息進行相關(guān)性分析。

結(jié)果顯示CD4和CD8陽性的T細胞表面CD39分子表達水平同同宮頸癌患者的臨床T分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，如圖2所示。不管CD4陽性T細胞還是CD8陽性T細胞表面CD39分子表達水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移患者要明顯高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的患者。此外CD39分子表達水平也同宮頸癌T分期相關(guān)，在T4期表達水平最高，在T1期表達水平最低。因此得出結(jié)論早中期宮頸癌患者T淋巴細胞表面CD39分子表達水平要明顯低于晚期宮頸癌患者。

圖2宮頸癌患者外周血中T淋巴細胞表達CD39分子表達水平同T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

A. CD4陽性T細胞表面CD39分子表達水平同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;B. CD8陽性T細胞表面CD39分子表達水平同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;C. CD4陽性T細胞表面CD39分子表達水平同遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;D.CD8陽性T細胞表面CD39分子表達水平同遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;E. CD4陽性T細胞表面CD39分子表達水平同臨床T分期的相關(guān)性;F. CD8陽性T細胞表面CD39分子表達水平同臨床T分期的相關(guān)性

結(jié)合前面的結(jié)論，我們發(fā)現(xiàn)晚期宮頸癌患者的由于CD8陽性T細胞數(shù)量的減少，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移進展，進而引起預(yù)后不佳。而晚期宮頸癌患者其T淋巴細胞表面CD39分子表達水平要明顯高于早中期患者。提示CD39分子表達水平與CD8陽性T細胞數(shù)量具有負相關(guān)性。作為免疫負調(diào)控因子腺苷代謝途徑的關(guān)鍵分子，CD39也具有負調(diào)控性能，能通過某些分子機制引發(fā)CD8陽性T細胞的耗竭，從而減少CD8陽性T細胞的數(shù)量，最終使得腫瘤細胞轉(zhuǎn)移進展。結(jié)合已有的文獻報道，本研究通過分析宮頸癌患者不同時期T淋巴細胞絕對數(shù)及其表面負性調(diào)控分子CD39表達水平，提出及證實了CD39分子同CD8陽性T淋巴細胞的功能具有負相關(guān)性。我們也將繼續(xù)對其具體分子機制進行研究探索。

3.討論

免疫系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)，具有監(jiān)視、防御和調(diào)控的作用。如何使機體有效識別腫瘤細胞并對其進行清除是腫瘤治療的核心問題之一。淋巴細胞作為主要的免疫細胞，在免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程中起重要作用。淋巴細胞包括輔助性T細胞，記憶型T細胞，調(diào)節(jié)性T細胞等等。因此我們通過流式細胞術(shù)檢測腫瘤患者外周血中CD3陽性T細胞，CD4陽性T細胞，CD8陽性T細胞，B淋巴細胞和NK細胞來評估腫瘤患者的一個免疫功能狀態(tài)，從而為臨床提供有用的信息。T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫是機體主動的免疫應(yīng)答，T淋巴細胞具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細胞、輔助B細胞產(chǎn)生抗體以及產(chǎn)生細胞因子等。而CD8陽性T細胞是細胞毒性T細胞，能夠直接殺傷靶細胞。因為本研究檢測和分析T淋巴細胞及其亞群同臨床的相關(guān)性。結(jié)果顯示腫瘤患者外周血中同細胞毒性T細胞相關(guān)的兩個指標CD8陽性T細胞絕對數(shù)和CD4/CD8比值同腫瘤患者的臨床信息相關(guān)，早中期腫瘤患者外周血中細胞毒性T細胞數(shù)量要高于晚期患者，提示細胞毒性T細胞的數(shù)量與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。腫瘤患者外周血中具有較多數(shù)量的細胞毒性T細胞，其具有更好的預(yù)后。本研究很好的詮釋了細胞毒性T細胞作為機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的主要執(zhí)行者，只有這類淋巴細胞基數(shù)達到一定數(shù)量時，機體的免疫系統(tǒng)才有可能去殺傷腫瘤細胞;而如果這類細胞的數(shù)量基數(shù)都很低，機體的免疫系統(tǒng)就無法去殺傷腫瘤細胞，從而影響后續(xù)的治療包括一些免疫單抗治療，如PD-1，CTLA-4等。外周血淋巴細胞亞群雖然不能夠準確反應(yīng)腫瘤原位中淋巴細胞亞群的狀態(tài)，但是外周血樣本取材方便，檢測準確的特點，同時同一患者外周血和腫瘤原位淋巴細胞亞群變化具有一致性，使得外周血淋巴細胞亞群分析成為目前最為可行的評估腫瘤患者免疫狀態(tài)。

已有研究報道CD39分子的表達能夠鑒別CD8+ T細胞是否耗竭，同時其他研究也證實了CD39和PD-1分子能夠共表達與T淋巴細胞表面。而CD39分子能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞轉(zhuǎn)化和生成。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們可以大膽的猜測，作為負性調(diào)控分子的CD39，其表達于CD8陽性T細胞的表面，能夠通過某些信號通路，進而引發(fā)CD8陽性T細胞的耗竭，使得CD8陽性T細胞的數(shù)量減少。此外，CD39的表達還可通過某些信號通路進一步引發(fā)T細胞一些免疫檢查點的表達，比如PD-1，進一步發(fā)揮其負向免疫調(diào)控作用。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數(shù)同患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示可能是腫瘤患者預(yù)后的獨立因素之一。腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的數(shù)量越多，患者具有更好的預(yù)后。我們希望通過檢測腫瘤患者外周血中淋巴細胞亞群，為臨床提供有價值的信息，進而使臨床能夠根據(jù)每個患者的免疫功能狀態(tài)制訂個體化的治療策略，也使每個患者能夠從各項檢測中得到最優(yōu)化的獲益。此外本研究還發(fā)現(xiàn)了CD39分子表達水平同CD8陽性T細胞數(shù)量具有負相關(guān)性，為后續(xù)闡明CD39分子負向調(diào)控分子機制提供了基礎(chǔ)。

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