X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良家系的基因突變分析及產(chǎn)前診斷

金玉霞，李素萍，李晶，唐萍

外胚層發(fā)育不良（ectodermal dysplasias，ED）是一種遺傳性疾病，以汗腺、毛發(fā)、牙齒、指甲等兩個(gè)或兩個(gè)以上外胚層發(fā)育不良或形態(tài)缺陷為主要特征。少汗型外胚層發(fā)育不良（hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED）是 ED最 常 見(jiàn)的亞型，發(fā)病率約為1/100 000[1]，可分為常染色體顯性遺傳、隱性遺傳及X-連鎖遺傳。X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不 良（X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia，XL-HED）在臨床上較為罕見(jiàn)，其“在線《人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）”編號(hào)為305100，主要由OMIM編號(hào)為300451的Ectodysplasin A（EDA）基因突變導(dǎo)致，呈X-連鎖隱性遺傳。

XL-HED臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為汗腺分泌少、毛發(fā)稀少、先天性牙齒缺如等[2]。絕大多數(shù)XL-HED患者為男性，但由于患者汗腺存在不可逆性損傷、散熱功能異常，因此患者在嬰幼兒期常出現(xiàn)高熱，甚至?xí)＜吧黐3-4]。此外，成年XL-HED患者存在特殊面容[5]，會(huì)給患者及其家庭帶來(lái)沉重的身心負(fù)擔(dān)。目前，臨床尚無(wú)有效治療XL-HED的方法，而遺傳咨詢及準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷是預(yù)防和減少XL-HED患兒出生的有效措施[6]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序法及Sanger測(cè)序法檢出先證者基因突變，之后對(duì)其家系成員進(jìn)行了遺傳學(xué)分析，從而明確了致病基因突變位點(diǎn)，為后續(xù)該家系成員遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了參考依據(jù)。

本文要點(diǎn)：

X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，發(fā)病率極低。本研究通過(guò)對(duì)疑似存在X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良家族史的孕婦進(jìn)行遺傳咨詢，采用高通量測(cè)序法及Sanger測(cè)序法對(duì)先證者、可能的致病基因攜帶者及孕婦本人進(jìn)行基因突變分析等明確Ectodysplasin A（EDA）基因半合子突變是X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良的致病性突變。本研究通過(guò)對(duì)先證者及其家系成員進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷等避免了X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良患兒的出生，并為該家系成員后續(xù)遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了重要參考依據(jù)，本研究發(fā)現(xiàn)的致病性基因突變類(lèi)型為已知致病性變異，后續(xù)仍需進(jìn)一步關(guān)注X-連鎖少汗型外胚層發(fā)育不良的致病性基因及基因突變類(lèi)型。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 先證者（Ⅱ3），男，28歲，因少汗、皮膚干燥、易出現(xiàn)高熱而于2020年2月來(lái)嘉興市婦幼保健院咨詢。先證者自幼無(wú)汗，體溫常高達(dá)39～40 ℃，皮膚及呼吸道黏膜干燥，頭發(fā)干枯稀少（目前戴假發(fā)），眉毛、睫毛稀疏，體毛、腋毛均稀少，牙齒數(shù)目尚可、但偏小，特殊面容、面部皮膚暗黑，眼周、口周伴色素沉著，額頭膨隆，眼眶凹陷，下頜突出，唇前突（見(jiàn)圖1）、趾（指）甲基本正常。先證者父母非近親結(jié)婚，弟弟（Ⅱ4）存在類(lèi)似病史，姐姐（Ⅱ2）表型基本正常但頭發(fā)偏少、牙齒細(xì)小且稍尖，外甥女（Ⅲ1）亦存在牙齒形狀異常（呈尖形），姐夫及其家系成員無(wú)類(lèi)似情況。先證者因其姐姐再次妊娠而前來(lái)進(jìn)行遺傳咨詢，希望了解胎兒發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并行產(chǎn)前診斷，遂繪制其家系圖譜（見(jiàn)圖2）。本研究經(jīng)嘉興市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)〔批準(zhǔn)號(hào)：2020產(chǎn)前倫（快）-1〕。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 分別采集先證者及其姐姐、外甥女外周靜脈血各2 ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝；采用血液基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN DNA Blood mini kit，Germany）并嚴(yán)格按照操作說(shuō)明提取基因組DNA；采用NanoDrop（Thermo Scientific，USA）測(cè)定DNA濃度和純度。

1.2.2 高通量測(cè)序 采用目標(biāo)芯片捕獲高通量測(cè)序法對(duì)ED相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，所用合成芯片（美國(guó)NimbleGen公司）于華大基因研究院定制，具體操作步驟如下：（1）將制備好的DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平、接頭連接，并經(jīng)非捕獲聚合酶鏈反應(yīng)（non-captured PCR）構(gòu)建完整的文庫(kù)；（2）先通過(guò)合成芯片上帶有生物標(biāo)記素的單鏈DNA探針進(jìn)行雜交，再利用鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠將選取的特定基因的外顯子及側(cè)翼±30 bp區(qū)域進(jìn)行富集，并經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增富集后產(chǎn)物、進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)以獲得序列捕獲雜交效率；（3）qPCR檢測(cè)合格后將一定數(shù)量的文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、分析和解讀，所用儀器為Illumina HiSeq2000。

圖1 先證者家系圖譜Figure 1 Pedigree map of the proband

圖2 先證者面部特征Figure 2 Facial features of the proband

1.2.3 基因突變致病性分析 基于1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）、OMIM、人類(lèi)基因組遺傳變異（Clinical Genome Variation）ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)、ED基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)檢索結(jié)果分析檢測(cè)到的基因突變，同時(shí)使用 Polymorphism Phenotyping version 2、Protein Variation Effect Analyzer（PROVEAN）對(duì)錯(cuò)義變異進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和致病性分析，參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南對(duì)基因突變致病性進(jìn)行判讀。

1.2.4 Sanger測(cè)序 根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的基因突變查詢美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)以獲取EDA基因的DNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物（引物序列：F'ATGGGACCTGATGGATTATTTA，R'AGTTTCAAGCGATTCTCCTG）并由華大基因科技有限公司合成、純化；分別采用瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，并采用ABI Big Dye Rterminator reagents 2.0試劑盒、ABI 3100基因分析儀（Applied Biosystem，F(xiàn)oster，USA）進(jìn)行Sanger測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入Polyphred軟件進(jìn)行突變位點(diǎn)分析。

1.2.5 羊水母源污染鑒定和產(chǎn)前診斷 明確先證者基因突變位點(diǎn)后告知其相關(guān)情況，先證者簽署知情同意書(shū)。先證者姐姐于妊娠18周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)以采集羊水，其中部分羊水用于細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析，部分羊水用于提取基因組DNA。選用PowerPlex16試劑盒進(jìn)行基因型分析以排除羊水標(biāo)本母源污染，確定無(wú)母源污染后對(duì)羊水DNA的EDA基因進(jìn)行有針對(duì)性的Sanger測(cè)序，但羊水DNA提取濃度低導(dǎo)致Sanger擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低且測(cè)序信號(hào)差、低峰高，因而轉(zhuǎn)用時(shí)間飛行質(zhì)譜分析技術(shù)（Mass ARRAY）對(duì)胎兒基因組DNA進(jìn)行有針對(duì)性的基因突變位點(diǎn)分析，最后通過(guò)MassARRAY延伸產(chǎn)物峰數(shù)據(jù)判斷相應(yīng)基因突變位點(diǎn)基因型。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果 高通量測(cè)序結(jié)果顯示先證者EDA基因第二外顯子編碼區(qū)（EX2/CDS2區(qū)）存在一半合子突變c.467G＞A（p.Arg156His，Hemi；參考轉(zhuǎn)錄本NM_001399），該突變位點(diǎn)位于X染色體，為錯(cuò)義突變，并由于鳥(niǎo)嘌呤（G）被腺嘌呤（A）替換而導(dǎo)致EDA基因的第156位氨基酸密碼子CGC突變?yōu)镃AC，造成正常的精氨酸（Arg）被組氨酸（His）替代。先證者Sanger測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。經(jīng)查，先證者c.467G＞A（p.Arg156His）在1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率為0，在HGMD為已知致病性變異并已被報(bào)道[7]。先證者確診為XL-HED，先證者姐姐及外甥女均經(jīng)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)c.467G＞A雜合突變，為雜合攜帶者（見(jiàn)圖3）。

2.2 產(chǎn)前診斷 羊水經(jīng)母源污染鑒定確定無(wú)母體細(xì)胞。胎兒羊水染色體核型分析未見(jiàn)明顯異常。Mass ARRAY結(jié)果顯示先證者只出現(xiàn)A型突變峰；胎兒（Ⅲ2）G型峰明顯、無(wú)A型突變峰，即不存在EDA基因突變位點(diǎn)（見(jiàn)圖4）。

2.3 遺傳咨詢 遺傳咨詢門(mén)診告知先證者姐姐胎兒不存在EDA基因突變，可繼續(xù)妊娠，同時(shí)告知其XL-HED遺傳異質(zhì)性，不排除臨床表現(xiàn)典型卻無(wú)法找出相關(guān)基因突變位點(diǎn)的可能。

3 討論

圖3 XL-HED家系成員EDA基因測(cè)序結(jié)果Figure 3 EDA gene sequencing results of the XL-HED family members

圖4 XL-HED家系成員Mass ARRAY結(jié)果Figure 4 Mass ARRAY results of the XL-HED family members

XL-HED約占全部HED的90%[8]，其致病基因EDA基因位于Xq13.1，全長(zhǎng)423 kb，包含有12個(gè)外顯子，編碼含有391個(gè)氨基酸的ectodysplasin A蛋白[9]。截至目前，已有多種EDA基因突變類(lèi)型被報(bào)道，而HAN等[2]通過(guò)總結(jié)2015—2019年報(bào)道的62例漢族HED患者EDA基因類(lèi)型發(fā)現(xiàn)其突變類(lèi)型涉及錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、插入突變、移碼突變、剪接突變、缺失、重復(fù)等，其中40%為錯(cuò)義突變，且第1～10外顯子均存在突變位點(diǎn)。有研究表明，EDA基因無(wú)義突變所致HED患者易出現(xiàn)先天性牙齒缺如，而EDA基因錯(cuò)義突變所致HED患者則易出現(xiàn)少汗、無(wú)汗癥狀[2]，且很少出現(xiàn)牙齒缺如[10]，提示HED患者雖有相似的臨床表型，但不同EDA基因突變類(lèi)型所致HED患者臨床表型仍存在一定差異。本研究中先證者嚴(yán)重少汗，常伴有高熱但牙齒缺如并不明顯，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

EDA基因?qū)儆谀[瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）配體基因家族[11]，其所編碼的ectodysplasin A蛋白屬于Ⅱ型跨膜蛋白，而ectodysplasin A蛋白的結(jié)構(gòu)域包括細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、酶裂解結(jié)構(gòu)域、膠原樣結(jié)構(gòu)域、TNF同源結(jié)構(gòu)域等[2，12]。核因子（NF）-κB或Wnt/β-catenin細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路是參與正常外胚層器官發(fā)育的重要信號(hào)通路[13]，而約50%的EDA基因突變患者存在ectodysplasin A蛋白功能改變，進(jìn)而影響NF-κB或Wnt/β-catenin細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路[8]。本研究中先證者及其姐姐、外甥女EDA基因第二外顯子467位點(diǎn)G被A替換，造成EDA基因第156位氨基酸密碼子CGC突變?yōu)镃AC、Arg被His替代，同時(shí)該突變位于酶裂解結(jié)構(gòu)域，打破了酶裂解位點(diǎn)并影響了EDA基因編碼的ectodysplasin A蛋白，從而導(dǎo)致正常外胚層上皮細(xì)胞信號(hào)通路中斷并影響皮膚及其附屬物的正常發(fā)育[7，12]。

XL-HED患者因汗腺發(fā)育不全而常伴有少汗、高熱、皮膚干燥，對(duì)于＜1歲的XL-HED患兒，出現(xiàn)高熱伴肺部感染時(shí)常會(huì)危及其生命。此外，XL-HED患者還會(huì)終身存在相關(guān)并發(fā)癥，如復(fù)發(fā)性鼻竇感染、濕疹等，不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者身心健康，還會(huì)給患者家庭及社會(huì)造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床尚無(wú)有效治療XL-HED的方法，因此有效的產(chǎn)前診斷對(duì)避免XL-HED患兒的出生具有重要意義。通常情況下，可通過(guò)出汗減少、頭發(fā)稀疏、牙齒發(fā)育異常三聯(lián)癥診斷XLHED，但女性患者受X染色體隨機(jī)失活影響可能會(huì)出現(xiàn)牙齒缺陷和出汗不均相關(guān)表型，本研究中女性患者均表現(xiàn)出牙齒異常，提示應(yīng)重視女性患者的產(chǎn)前診斷以降低男性新生兒死亡風(fēng)險(xiǎn)等。

本研究對(duì)疑似存在XL-HED家族史的孕婦進(jìn)行了遺傳咨詢，并對(duì)先證者、可能的致病基因攜帶者及孕婦本人進(jìn)行了家系分析及EDA基因檢測(cè)，明確該家系成員EDA基因突變位點(diǎn)后對(duì)胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，后明確該胎兒不存在EDA基因突變并告知相關(guān)家系成員XL-HED遺傳異質(zhì)性，后期仍需進(jìn)行出生后隨訪。需要指出的是，如該胎兒產(chǎn)前診斷為XLHED，則應(yīng)在充分告知孕婦及家屬真實(shí)信息并在知情同意情況下尊重其選擇權(quán)，并進(jìn)行遺傳咨詢。提示遺傳咨詢及有效的產(chǎn)前診斷是減少及避免XL-HED患兒出生的有效路徑。

作者貢獻(xiàn)：金玉霞進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)/資料收集、整理，撰寫(xiě)論文，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；金玉霞、李素萍進(jìn)行論文的修訂；李晶進(jìn)行英文的修訂；唐萍負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。