腦脊液二代測(cè)序?qū)Σ《拘阅X炎的診斷價(jià)值：附三例報(bào)告

厲廣栩，李淵龍，逯軍，孫薇薇

病毒性腦炎是一種由病毒引起的中樞系統(tǒng)感染性疾病，可累及腦膜和腦實(shí)質(zhì)。近年來(lái)，兒童病毒性腦炎發(fā)病率逐漸升高（由0.035‰升至0.160‰），嚴(yán)重影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)患兒家庭造成巨大的負(fù)擔(dān)[1]。引起腦炎的皰疹病毒包括單純皰疹病毒（HSV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）和水痘帶狀皰疹病毒（VZV），此外，有研究表明人類皰疹病毒7型（HHV-7）和人類皰疹病毒6型（HHV-6）對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有一定的神經(jīng)親嗜性[2]。由HSV引起的單純皰疹病毒腦炎（HSE）是兒童散發(fā)腦炎最常見(jiàn)的病因，其可引起腦組織的出血性壞死或變態(tài)反應(yīng)性腦損害，未經(jīng)治療的HSE患兒死亡率高達(dá)90%，而經(jīng)過(guò)早期治療的患兒死亡率會(huì)下降至20%～30%[3]。因此早期診斷對(duì)制定有效的治療方案及改善患兒預(yù)后有至關(guān)重要的作用，能極大地降低病毒性腦炎患兒后遺癥的發(fā)生率及死亡率。本文通過(guò)介紹3例病毒性腦炎患兒的診治過(guò)程，探討宏基因組學(xué)二代基因檢測(cè)技術(shù)在病毒性腦炎早期診斷與鑒別中的價(jià)值，為臨床提供借鑒。

1 病例簡(jiǎn)介

患兒1，男，10歲。因“發(fā)熱10 d，意識(shí)障礙0.5 h，抽搐1次”于2019-10-17入住中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院?；純喝朐呵?0 d無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，熱型不規(guī)則，最高達(dá)40 ℃，無(wú)抽搐、嘔吐、頭痛、腹瀉，無(wú)嗜睡；多次于?？谑衅渌t(yī)院及私人診所就診后治療效果欠佳，仍有發(fā)熱、表情淡漠、不愿交流、全身乏力?；純喝朐呵?.5 h出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為頭頸向右偏斜，雙眼球向上固定，四肢強(qiáng)直，伴有尖叫，呼之不應(yīng)。入院時(shí)查體：體溫36.7 ℃，脈搏110次/min，呼吸21次/min，血壓101/59 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；意識(shí)不清，精神疲倦，不能交流對(duì)答，頸抵抗，心肺腹查體未見(jiàn)明顯異常；四肢肌張力低下，左上肢肌力約為Ⅳ級(jí)，左下肢肌力約為Ⅱ級(jí)，右側(cè)肢體肌力0級(jí)；右側(cè)提睪反射及雙側(cè)跟腱、膝腱反射未引出，右側(cè)巴彬斯基征陽(yáng)性，余項(xiàng)陰性。輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)：8.9×109/L（參考范圍：3.5×109/L～9.5×109/L），中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)90%（參考范圍：40%～75%）；腰椎穿刺：腦脊液顏色清亮，壓力130 mm H2O（1 mm H2O=0.009 8 kPa），白細(xì)胞計(jì)數(shù)：150×106/L（參考范圍：0～8×106/L）、單核細(xì)胞為主，微量蛋白：1 299 mg/L（參考范圍：150～450 mg/L），糖、氯基本正常；顱腦MRI檢查結(jié)果顯示左側(cè)海馬、外囊區(qū)異常信號(hào)，考慮感染病變；腦脊液自身抗體陰性；腦脊液宏基因組測(cè)序（mNGS）檢測(cè)出人類α皰疹病毒Ⅰ型，診斷為病毒性腦炎。予以阿昔洛韋（湖北科益藥業(yè)股份有限公司）抗感染，靜脈滴注，0.22 g/次，1次/8 h；地塞米松磷酸鈉注射液（三才石岐制藥股份有限公司）抗炎，初始劑量為1 ml/次，2次/d，后逐步減量至0.5 ml/次，4次/d，3 d后患兒熱峰下降，發(fā)熱間隔明顯延長(zhǎng)，未再抽搐，四肢肌力逐漸恢復(fù)。患兒入院后第3天確診為病毒性腦炎后繼續(xù)予以阿昔洛韋抗感染治療；第9天患兒精神明顯好轉(zhuǎn)，未再發(fā)熱，肌力恢復(fù)正常；治療13 d后好轉(zhuǎn)出院。隨訪至2020-02-25，患兒一般情況可，無(wú)頭暈、頭痛、發(fā)熱等，日?；顒?dòng)無(wú)異常。

患兒2，女，9歲。因“間斷頭痛、嘔吐4 d，抽搐0.5 h”于2019-11-23入住中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院?；純喝朐呵? d無(wú)明顯誘因出現(xiàn)頭痛，伴嘔吐（非噴射樣）、5～6次/d，無(wú)發(fā)熱、抽搐、意識(shí)障礙，家屬未予特殊處理?；純喝朐呵? h再次出現(xiàn)嘔吐，性質(zhì)同前，約10次，伴有意識(shí)不清；入院前0.5 h出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為口角歪斜，流涎，四肢強(qiáng)直抖動(dòng)，雙眼上翻，意識(shí)模糊，呼之不應(yīng)，期間有尿失禁。入院時(shí)查體：體溫36.5 ℃，脈搏100次/min，呼吸27次/min，血壓111/68 mm Hg；意識(shí)喪失，頸無(wú)抵抗，雙側(cè)瞳孔等大等圓，對(duì)光反射存在，眼底鏡下見(jiàn)視盤(pán)淡紅，內(nèi)下邊界清，生理杯消失，未見(jiàn)出血及滲出；心肺腹查體未見(jiàn)明顯異常，四肢肌張力正常；生理反射存在，病理征未引出。輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)：9.2×109/L，中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)88%；腰椎穿刺：腦脊液顏色清亮，壓力250 mm H2O，腦脊液生化、常規(guī)、培養(yǎng)均未見(jiàn)明顯異常；甲功七項(xiàng)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（ANCA）、自身抗體、腫瘤自身抗體七項(xiàng)未見(jiàn)異常；顱腦MRI平掃未見(jiàn)異常，婦科彩超未見(jiàn)異常；動(dòng)態(tài)腦電圖提示右額區(qū)、右顳區(qū)尖慢波放電，清醒期及睡眠期均有放電；外送康圣達(dá)查血及腦脊液抗神經(jīng)細(xì)胞抗體、神經(jīng)節(jié)苷脂抗體、中樞神經(jīng)脫髓鞘抗體均為陰性，華大基因腦脊液mNGS檢測(cè)出Starmerella bacillaris以及人類α皰疹病毒Ⅰ型。診斷為：病毒性腦炎，予以阿昔洛韋（湖北科益藥業(yè)股份有限公司）抗病毒，靜脈滴注，0.3 g/次，1次/8 h；甲潑尼龍琥珀酸鈉（比利時(shí)輝瑞）抗炎，靜脈滴注，初始劑量為0.75 g/次，1次/d，后逐漸減量為0.08 g/次，1次/d；丙種球蛋白（上海萊士血液制品股份有限公司）2 mg/kg靜脈滴注，總量為65 mg平均分為4 d滴注完畢；丙戊酸鈉（沈陽(yáng)新馬藥業(yè)有限公司）抗癲癇，1.76 g/次持續(xù)泵入（1 mg·kg-1·h-1），后改為口服制劑（杭州塞諾飛制藥有限公司），10 ml/次，2次/d。患兒入院第2天仍有抽搐1次，意識(shí)呈間斷模糊狀態(tài)，在入院第2天確診為皰疹病毒性腦炎后繼續(xù)予以阿昔洛韋抗感染治療；第7天，患兒精神癥狀明顯好轉(zhuǎn)，抽搐未再發(fā)，偶有失神發(fā)作；治療16 d后患兒無(wú)抽搐、失神發(fā)作，無(wú)不自主運(yùn)動(dòng)，無(wú)頭痛、惡心、嘔吐，無(wú)發(fā)熱等，病情穩(wěn)定后出院。

患兒3，男，11個(gè)月。因“嗜睡2 d，發(fā)熱伴抽搐1 d”于2019-11-01入住中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院。入院前2 d患兒出現(xiàn)嗜睡，無(wú)發(fā)熱、嘔吐，家屬未在意。入院前1 d患兒無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，最高體溫為39.0 ℃，高熱時(shí)有抽搐，表現(xiàn)為呼之不應(yīng)，雙眼凝視上翻，牙關(guān)緊閉，口唇青紫，四肢強(qiáng)直，共抽搐9次，每次持續(xù)時(shí)間均不超過(guò)1 min。入院時(shí)查體：體溫36.6 ℃，脈搏135次/min，呼吸32次/min，動(dòng)脈血氧飽和度98%（鼻導(dǎo)管吸氧下），發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)中等，意識(shí)可，頸無(wú)抵抗，雙側(cè)瞳孔等大等圓，對(duì)光反射存在，咽部可見(jiàn)充血，雙肺呼吸音粗糙，可聞及喉鳴音，心腹查體未見(jiàn)明顯異常，四肢肌張力正常，生理反射存在，病理征未引出。入院后完善輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)：5.3×109/L，中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)50%，C反應(yīng)蛋白1.97 mg/L（參考范圍：0～10 mg/L）；血生化未見(jiàn)異常；顱腦MRI平掃未見(jiàn)異常；腰椎穿刺：壓力120 mm H2O，腦脊液生化、常規(guī)、培養(yǎng)均未見(jiàn)明顯異常；動(dòng)態(tài)腦電圖提示雙側(cè)額頂區(qū)、枕顳區(qū)慢活動(dòng)并非同步尖慢波放電；華大基因腦脊液mNGS檢測(cè)出人類β皰疹病毒6B型。入院后診斷：抽搐查因：小兒癲癇？病毒性腦炎？暫予以頭孢呋辛鈉（Esseti Farmaceutici S.r.l）抗感染，靜脈滴注，0.475 g/次，1次/12 h。入院后3 d待mNGS結(jié)果出來(lái)后修正診斷為：病毒性腦炎，并加用阿昔洛韋（湖北科益藥業(yè)股份有限公司）抗病毒，靜脈滴注，0.095 g/次，1次/12 h，治療11 d后患兒無(wú)發(fā)熱、抽搐、咳嗽、意識(shí)障礙等，病情好轉(zhuǎn)出院。隨訪至2020-02-25，患兒一般情況可，生長(zhǎng)發(fā)育同同齡人，未再出現(xiàn)抽搐。

3例患兒腦脊液mNGS結(jié)果以及腦脊液檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

2 討論

病毒性腦炎是兒科常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染之一，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、抽搐、頭痛等，其早期臨床癥狀不明顯，需要及時(shí)的診斷及治療以降低后遺癥發(fā)生的可能性。在臨床工作中，對(duì)于病毒性腦炎的診斷主要是依靠病史、體征、腦脊液檢查、影像學(xué)檢查、腦電圖檢查、血清學(xué)檢測(cè)以及病原學(xué)檢查等進(jìn)行綜合判斷。病毒性腦炎患兒的腦脊液生化以及常規(guī)檢查中蛋白量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等常缺乏特異性改變，同時(shí)與病情變化不完全一致；腦脊液中病毒的分離以及培養(yǎng)也因陽(yáng)性率低、耗時(shí)耗力以及受檢測(cè)儀器設(shè)備的限制而常不作為診斷的首選。常規(guī)的MRI可以較清楚地顯示病灶大小及變化情況，但在早期發(fā)現(xiàn)病灶、顯示病灶的病理變化等方面仍有不足之處[4]。腦電圖檢查用于診斷病毒性腦炎時(shí)有一定的價(jià)值，能早期反映腦組織受損的情況，但其特異度較低，但凡能造成腦組織損失的疾病如細(xì)菌性腦炎、自身免疫性腦炎均可能造成腦電圖檢查結(jié)果異常。對(duì)于疑似病毒性腦炎的患兒，為明確診斷，需完善病原學(xué)檢測(cè)。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法包括：病毒分離、病毒抗原檢測(cè)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒特異性抗體檢測(cè)〔如病毒特異性免疫球蛋白M（IgM）抗體的檢測(cè)〕及病毒核酸檢測(cè)〔如實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）〕等，但由于檢測(cè)方法的靈敏度及抗體產(chǎn)生所需要時(shí)間的關(guān)系，陽(yáng)性率偏低，因而常規(guī)腦脊液病原學(xué)檢查對(duì)確定病毒感染的類型具有相當(dāng)大的局限性。此外，非培養(yǎng)技術(shù)主要基于醫(yī)務(wù)工作者對(duì)疾病的傾向性診斷，在復(fù)雜/疑難感染性疾病中，常無(wú)法滿足對(duì)病原譜全面檢測(cè)的需要。PCR需要預(yù)知病原體序列信息以設(shè)計(jì)引物及探針，對(duì)未知的病原體無(wú)能為力；并且有報(bào)道指出，在發(fā)病3 d內(nèi)的HSE患者腦脊液樣本中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)陰性[5-7]。在病原體的致病性上，許多病原體的亞型或者基因型之間存在顯著差異，因而在行病原鑒定的同時(shí)獲得病原體的基因組信息對(duì)指導(dǎo)臨床治療十分重要。

表1 3例病毒性腦炎患兒腦脊液mNGS結(jié)果以及腦脊液檢查結(jié)果Table 1 Results of mNGS testing of cerebrospinal fluid and routine cerebrospinal fluid analysis in 3 children with viral encephalitis

mNGS作為一種分子診斷技術(shù)，能夠用較少的樣本量同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)、幾百萬(wàn)甚至上億條核酸序列進(jìn)行測(cè)定，分析環(huán)境樣品所包含的全部微生物的群落組成及其結(jié)構(gòu)和功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的精確鑒定。mNGS通過(guò)其高通量、深度測(cè)序的特點(diǎn)能快速、精準(zhǔn)地測(cè)定病原體，如2015年GUAN等[8]應(yīng)用mNGS對(duì)4例疑似病毒性腦炎患者的腦脊液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果2例檢測(cè)出人類皰疹病毒1型（HHV-1）、1例檢測(cè)出人類皰疹病毒2型（HHV-2）、1例檢測(cè)出人類皰疹病毒3型（HHV-3）。mNGS不僅可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出常見(jiàn)的病原體，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體進(jìn)行定量研究，如2019年LIU等[9]應(yīng)用mNGS診斷出1例患有HSE的1歲患兒，經(jīng)阿昔洛韋治療后，患兒癥狀消失，同時(shí)檢測(cè)患兒腦脊液中HSV-1 DNA定量從4 290下降至0。上述研究表明，對(duì)于常見(jiàn)的皰疹病毒感染的腦炎，腦脊液mNGS不但有重要的確診價(jià)值，而且在一定程度上可評(píng)價(jià)治療效果。mNGS因其“從頭組裝”基因組的特點(diǎn)，能通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增樣本中的所有核酸序列，理論上能無(wú)偏倚地檢測(cè)出所有潛在病原體，在發(fā)現(xiàn)未知病原體方面有著重要的意義。2013年REINKE等[10]在1例狂犬病患者的腦白質(zhì)活體組織標(biāo)本中檢測(cè)到了一種近似蝙蝠狂犬病毒SHBRV-18的新病毒株。YANG等[11]通過(guò)mNGS首次報(bào)道了1例被偽狂犬病毒所感染的腦炎病例。本文報(bào)道的3例皰疹病毒性腦炎患兒均為急性或亞急性起病，且3例患兒均出現(xiàn)抽搐、意識(shí)障礙等癥狀，部分患兒還有發(fā)熱、精神神經(jīng)障礙以及肢體障礙等。在病毒性腦炎的臨床表現(xiàn)中，年齡較小的嬰幼兒常以驚厥發(fā)作、易激惹、煩躁不安為首發(fā)表現(xiàn)[12]，例如患兒3便是以高熱驚厥為首發(fā)表現(xiàn)。3例患兒完善腰椎穿刺進(jìn)行腦脊液培養(yǎng)均未見(jiàn)異常，而通過(guò)腦脊液mNGS檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)了皰疹病毒。在3例患兒的腦脊液生化及常規(guī)中可以發(fā)現(xiàn)，除患兒1腦脊液中單核細(xì)胞增多、蛋白含量增高外，其余兩例患兒腦脊液未見(jiàn)異常。國(guó)外研究表明，腦脊液中單核細(xì)胞增多是中樞神經(jīng)系統(tǒng)HSV感染的重要表現(xiàn)，與其他病毒性腦炎腦脊液以淋巴細(xì)胞增高為主不同，可作為鑒別依據(jù)[13]。患兒1顱腦MRI檢查結(jié)果提示左側(cè)海馬、外囊區(qū)異常信號(hào)，與HSE常侵犯一側(cè)腦組織，尤其是顳葉、島葉和額葉的影像學(xué)表現(xiàn)相符[14]，但目前對(duì)于病毒性腦炎的診斷仍需以病原學(xué)診斷為主。本文對(duì)3例患兒腦脊液標(biāo)本進(jìn)行mNGS，從收集樣本、測(cè)序結(jié)束并完成結(jié)果分析平均耗時(shí)2.3 d，除診斷出常見(jiàn)的人類α皰疹病毒1型及HSV外，還檢測(cè)出相對(duì)少見(jiàn)的人類β皰疹病毒6B型，相較傳統(tǒng)的檢查，mNGS能夠更快、更準(zhǔn)確地得出病原學(xué)結(jié)果?；純?起初考慮為自身免疫性腦炎可能性大，后結(jié)合2017年發(fā)布的《中國(guó)自身免疫性腦炎診治專家共識(shí)》[15]、患兒血及腦脊液中的抗體檢測(cè)結(jié)果以及腦脊液mNGS檢測(cè)結(jié)果綜合診斷為病毒性腦炎。治療上，患兒1、2根據(jù)其臨床癥狀在入院當(dāng)天就經(jīng)驗(yàn)性開(kāi)始阿昔洛韋治療，患兒3也在入院第3天mNGS結(jié)果出來(lái)后加用阿昔洛韋抗感染治療。李瑾等[16]在HSE的預(yù)后分析中指出初始阿昔洛韋治療延遲與1年內(nèi)不良預(yù)后相關(guān)；此外，一項(xiàng)多中心的成年人HSE的預(yù)后研究發(fā)現(xiàn)，延遲48 h后應(yīng)用阿昔洛韋是預(yù)后差的重要因素[17]。綜上所述，mNGS可為臨床提供早期精準(zhǔn)診斷或鑒別診斷依據(jù)，有助于指導(dǎo)臨床早期制定有效治療方案。

因?yàn)閙NGS高通量的特點(diǎn)，腦脊液mNGS通常會(huì)獲得多種疑似病原體基因序列，并需要將這些序列與病原體基因進(jìn)行匹配與分析才能獲得診斷信息，取材或者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中混入的微生物基因序列會(huì)影響結(jié)果的判斷，這種與臨床癥狀不符但出現(xiàn)在分析結(jié)果中的微生物序列稱為背景“噪聲”[18]，對(duì)于這種“噪聲”，目前沒(méi)有統(tǒng)一的判讀，需要結(jié)合患者實(shí)際情況進(jìn)行分析?；純?腦脊液mNGS檢測(cè)中出現(xiàn)Starmerella bacillaris，這種子囊菌廣泛存在于發(fā)酵葡萄汁中，但并無(wú)對(duì)人有致病性的報(bào)道[19]。對(duì)結(jié)果的分析與判讀尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)這無(wú)疑是mNGS未來(lái)需要解決的問(wèn)題。此外，mNGS尚未開(kāi)展與常規(guī)檢測(cè)方法比對(duì)的規(guī)律性研究，檢測(cè)的靈敏度和特異度還需臨床大數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)及與現(xiàn)有方法的比較才能得以驗(yàn)證。

總而言之，mNGS作為一種新技術(shù)，為兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供了重要的病原學(xué)診斷方法。mNGS可以利用較少的腦脊液中微生物DNA，更快、更準(zhǔn)確地提供病原學(xué)證據(jù)，從而指導(dǎo)臨床工作。雖然mNGS存在一些缺點(diǎn)，但相比傳統(tǒng)方法如腦脊液常規(guī)、血清學(xué)抗體或是影像學(xué)均不能從病原學(xué)上給出明確診斷或者診斷相對(duì)粗獷，腦脊液mNGS能夠精準(zhǔn)并且快速地檢測(cè)出病原體，與國(guó)家所倡導(dǎo)的精準(zhǔn)診斷相符合。目前來(lái)說(shuō)mNGS更多的是作為傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充，而非常規(guī)方法。相信隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)mNGS技術(shù)將會(huì)更加完善并且廣泛用于疾病的早期診斷與治療中。

作者貢獻(xiàn)：厲廣栩進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)論文，進(jìn)行論文的修訂；逯軍負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；李淵龍進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集；孫薇薇進(jìn)行文獻(xiàn)/資料整理。

本文無(wú)利益沖突。