哺乳動物早期胚胎滋養(yǎng)外胚層發(fā)育的研究進展

張艷艷，彭 輝，肖天放

(福建農(nóng)林大學動物科學學院，福州 350002)

滋養(yǎng)外胚層的形成對早期胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。滋養(yǎng)外胚層完整性受損將導致囊胚形成失敗甚至死亡，同時滋養(yǎng)外胚層的滲透性和液體轉(zhuǎn)運功能受阻也將導致囊胚形成失??；滋養(yǎng)外胚層不能正確地分化將造成胚胎不能附植或附植后形成的胎盤畸形，進而增加胎兒的流產(chǎn)率和死亡率，因此，研究調(diào)控滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的分子機制具有重要的理論和實踐意義。

1 哺乳動物滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育

哺乳動物早期胚胎發(fā)育到一定時期發(fā)生胚胎致密化，致密化是以相鄰卵裂球界限不清、細胞變扁和E-cadherin依賴細胞間黏附的確立為特征的形態(tài)變化過程。卵裂球獲得以微絨毛頂端定位為特征的細胞極性和獲得胞質(zhì)極性，之后隨著細胞分裂，外部細胞保持極性并產(chǎn)生滋養(yǎng)外胚層上皮。在囊胚形成的過程中，滋養(yǎng)外胚層細胞形成有黏附連接和緊密連接功能的轉(zhuǎn)運上皮[1]。鈉泵(Na+/K+-ATPase)的活性導致穿過滋養(yǎng)外胚層離子梯度的確立和囊胚腔形成過程中的液體積聚[2]。此外，水通道有助于穿過滋養(yǎng)外胚層的水運動并導致囊胚腔擴張[3]。囊胚從透明帶中孵出以后，滋養(yǎng)外胚層又分化為2種滋養(yǎng)層細胞：覆蓋內(nèi)細胞團的細胞，稱極滋養(yǎng)層(polar trophoblast)；圍繞囊胚腔的細胞，稱壁滋養(yǎng)層(mural trophoblast)。極滋養(yǎng)層增殖活躍，刺激極滋養(yǎng)層增殖的信號起源于內(nèi)細胞團，并且在局部起作用[4]。壁滋養(yǎng)層細胞圍繞囊胚腔，不能與內(nèi)細胞團緊密連接。附植以后，覆蓋在內(nèi)細胞團外面的極滋養(yǎng)層細胞繼續(xù)增殖，形成包含滋養(yǎng)層干細胞的胚外外胚層(extra-embryonic ectoderm, ExE)和二倍體的絨毛膜錐(ectoplacental cone, EPC)，同時壁滋養(yǎng)層細胞停止分裂形成滋養(yǎng)層巨細胞[5]。

2 哺乳動物滋養(yǎng)外胚層發(fā)育需要的關(guān)鍵基因及其相互關(guān)系

2.1 哺乳動物滋養(yǎng)外胚層發(fā)育需要的關(guān)鍵基因

在附植前胚胎發(fā)育過程中，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層發(fā)育的基因主要有含TEA結(jié)構(gòu)域的家族成員4 (TEA domain family member 4,Tead4)、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2 (caudal type homeobox 2,Cdx2)和Eomes(eomesodermin)，且這3個基因都是滋養(yǎng)外胚層發(fā)育所必需的[6-8]。Cdx2在滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞團譜系分化中起作用，Eomes參與極滋養(yǎng)層和壁滋養(yǎng)層細胞命運的控制，Ets家族成員E74樣轉(zhuǎn)錄因子5 (E74-like factor 5,Elf5)在極滋養(yǎng)層細胞譜系分化過程中，參與控制胚外外胚層和絨毛膜錐的細胞決定[9]。此外，SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2 (SRY-box 2,Sox2)和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3 (forkhead box D3,Foxd3)對滋養(yǎng)層和外胚層的發(fā)育也非常重要[10]，母源性的Sox 2調(diào)控滋養(yǎng)層的分化命運[11]，而敲除Foxd3將影響早期胚胎外胚層的形成[12]。

在小鼠未受精卵母細胞和受精合子中幾乎檢測不到Tead4 mRNA，但從2-細胞期開始，Tead4表達增加一直貫穿整個胚泡期，在8-細胞和桑椹胚期Tead4的表達達到峰值[6]，此時，正是滋養(yǎng)外胚層形成和分化的關(guān)鍵時期。Tead4在滋養(yǎng)層干細胞中表達極顯著高于在胚胎干細胞中表達，而在滋養(yǎng)層干細胞分化成滋養(yǎng)層巨細胞的過程中，這種高水平表達一直維持著。然而，Tead4在胚胎干細胞分化成胚狀體的過程中一直低水平表達，說明Tead4主要在滋養(yǎng)外胚層中起作用[6]。敲除Tead4基因后，Tead4-/-胚胎桑椹胚以前的發(fā)育與Tead4+/+和Tead4+/-胚胎沒有差異，之后，Tead4-/-胚胎不能形成囊胚腔，維持著桑椹胚樣的形態(tài)[13]。細胞數(shù)量與Tead4+/+和Tead4+/-胚胎的細胞數(shù)量沒有顯著差異[13]，說明盡管Tead4-/-胚胎的細胞增殖沒有阻斷或延遲，但卻不能形成滋養(yǎng)外胚層。在Tead4-/-胚胎中所有測定的滋養(yǎng)外胚層特異基因Cdx2、整聯(lián)蛋白α 7 (integrin alpha 7，Itga7)和鈣黏蛋白3 (cadherin 3，Cdh3)均沒有表達，而Eomes和成纖維細胞生長因子受體2 (fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)gfr2)的表達顯著降低，表明，滋養(yǎng)外胚層發(fā)育失敗[13]，從而說明了滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育離不開Tead4的表達[14]。

Cdx2在滋養(yǎng)外胚層中的表達是所知道的譜系分化的早期事件之一[15]，免疫熒光定位分析表明，Cdx2從8-細胞開始表達，從8-～32-細胞，Cdx2的表達水平明顯增加[16]。在囊胚階段早期，Cdx2的表達更多的限制在胚胎外部細胞；在擴張囊胚階段，Cdx 2蛋白只定位在滋養(yǎng)外胚層的細胞核。敲除Cdx2基因后，Cdx2-/-胚胎能夠形成囊胚腔，但囊胚腔卻不能維持，并伴隨著滋養(yǎng)外胚層細胞形態(tài)學上的改變，而Cdx2+/+和Cdx2+/-胚胎能夠形成擴張囊胚，并從透明帶中孵出[7]，說明敲除Cdx2基因后滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育不完全或發(fā)育失敗。分析滋養(yǎng)層特異的標志基因表明，Cdx2-/-胚胎能夠表達滋養(yǎng)外胚層標志基因Eomes和Fgfr2，但Eomes的表達顯著降低，分化的滋養(yǎng)層巨細胞標志基因Hand1和Pl1的表達在Cdx2-/-胚胎中檢測不到，而它們在Cdx2+/+和Cdx2+/-胚胎中能夠檢測到[7]。進一步的研究表明，Cdx2-/-胚胎在體外不能形成滋養(yǎng)層巨細胞或滋養(yǎng)層干細胞，說明胚胎早期滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育需要Cdx2表達。

Eomes轉(zhuǎn)錄物首次在囊胚滋養(yǎng)層細胞中被檢測到，之后在胚外外胚層持續(xù)表達[8]。小鼠早期胚胎缺乏Eomes，將導致胚胎阻滯在囊胚期，究其原因發(fā)現(xiàn)，突變的滋養(yǎng)外胚層不能分化為滋養(yǎng)層，也不能進一步分化為極滋養(yǎng)層和壁滋養(yǎng)層細胞[8]。因此，滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育需要Eomes參與。

2.2 哺乳動物滋養(yǎng)外胚層特異性基因Tead 4、Cdx 2和Eomes之間的關(guān)系

在鼠胚早期發(fā)育過程中，Tead4首先在2-細胞開始表達，在8-細胞和桑椹胚Tead4的表達達到峰值。在Tead4-/-胚胎中Cdx2的表達劇烈下調(diào)，表明Tead4在Cdx2上游調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育[13]。因為在8-～18-細胞Cdx2微弱表達，同時Cdx2表達的維持或上調(diào)需要Tead4。然而，在Tead4-/-胚胎中，Eomes不表達或微弱表達[6,13]，出現(xiàn)這種情況的原因可能為檢測的方法不同而導致檢測的靈敏度不同，總之，Eomes高水平表達需要Tead4 的存在，說明Tead4在Eomes的上游起調(diào)節(jié)作用。Cdx2從8-細胞開始表達，從8-～32-細胞，Cdx2的表達水平明顯增加。在Cdx2-/-胚胎中Eomes表達顯著降低和在胚胎干細胞中通過Cdx2能夠快速誘導Eomes表達，說明Eomes在Cdx2下游區(qū)，但在Cdx2-/-胚胎中，Eomes持續(xù)表達也表明，存在Eomes表達不依賴Cdx2機制[7]。在Tead4-/-胚胎中Eomes不表達，暗示Tead4調(diào)節(jié)Eomes不依賴Cdx2。Tead4-/-胚胎不能形成囊胚，Cdx2-/-胚胎能夠形成暫時的囊胚，之后囊胚腔很快塌陷，而Eomes-/-胚胎能夠形成擴張囊胚，表明在Eomes-/-胚胎中，Tead4和Cdx2能夠正常表達。

Tead4、Cdx2和Eomes可能通過3種不同的途徑調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚腔形成。第1種是Cdx2依賴途徑，Tead4在外部細胞中激活Cdx2，Cdx2促進滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。第2種是Eomes依賴途徑，Tead4激活Eomes的表達，Eomes再調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。同時，Cdx2也能激活Eomes。第3種是Tead4依賴途徑，Tead 4不依賴Cdx2和Eomes而直接調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層特異基因的表達?？傊?，Tead4、Cdx2和Eomes相互協(xié)作促進滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育。

3 調(diào)控哺乳動物滋養(yǎng)外胚層完整性和功能相關(guān)的蛋白

滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能維持對附植前胚胎發(fā)育至關(guān)重要。滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能受到損壞將導致胚胎發(fā)育停止、不能形成囊胚腔或胚胎致死。影響滋養(yǎng)外胚層完整性和功能蛋白主要有粘附連接蛋白、緊密連接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白等。

在胚胎致密化過程中，粘附連接蛋白E-cadherin與catenin形成粘附復合體，一方面，有利于外部卵裂球的極化，另一方面，有利于緊密連接的形成和滋養(yǎng)外胚層的分化。Catenin包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin。研究表明，β-catenin敲除胚胎和γ-catenin敲除胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段[17-18]，說明滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育正常，其完整性和功能能夠繼續(xù)維持。然而，E-cad-/-胚胎不能形成滋養(yǎng)外胚層上皮和囊胚腔[19]，而α-catenin敲除胚胎的滋養(yǎng)外胚層上皮也是異常的[20]，表明在滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育中E-cadherin和α-catenin起著非常重要的作用。

在囊胚的形成過程中，滋養(yǎng)外胚層細胞間由緊密連接形成所產(chǎn)生的滲透性封閉十分重要，是囊胚形成的必要條件。如果緊密連接封閉不充分，轉(zhuǎn)運的物質(zhì)很可能通過細胞間的縫隙而滲漏，致使不能形成擴張囊胚。研究表明，在胚胎的早期發(fā)育過程中完全敲除或沉默ZO-2[21]、ZO-3[22]、Cingulin[23]和Occludin[24]并不影響緊密連接的形成，而使ZO-1 沉默將導致胚胎不能發(fā)育到囊胚[25]。敲除組織中特異表達的Claudin基因顯示緊密連接的形成和屏障功能被破壞[26-28]，說明緊密連接的形成需要ZO-1和Claudin蛋白的表達與正確組裝。

在囊胚形成之前，Na+/K+-ATPase極化分布在滋養(yǎng)外胚層基底外側(cè)膜[29]。在桑椹胚～囊胚的形成過程中，Na+/K+-ATPase亞基基因表達上調(diào)，且Na+/K+-ATPase的活性顯著增加，用Na+/K+-ATPase的特異性抑制劑Ouabain處理之后影響囊胚形成[30]，說明Na+/K+-ATPase在囊胚的形成過程中發(fā)揮作用。此外，Na+/K+-ATPase β亞基本身具有細胞間黏附分子的功能[31]，在早期胚胎的發(fā)育過程中，緊密連接的組裝需要Na+/K+-ATPase的活性[32]，因此，Na+/K+-ATPase還能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層細胞間緊密連接的形成和功能[30]。

在囊胚形成過程中，水通道蛋白(AQPs)在促進水運動方面可能起著重要的作用[33]。目前，在哺乳動物上已經(jīng)鑒別出11個水通道蛋白，根據(jù)該家族蛋白對水和小分子的選擇性通透作用，該家族蛋白又可分為2個亞群。AQP 0、AQP 1、AQP 2、AQP 4、AQP 5、AQP 6、AQP 8和AQP 10對水分子具有高度選擇性，而AQP 3、AQP 7和AQP 9的選擇性相對較差，允許小分子通過[34]。

Na+/K+-ATPase和AQPs介導的穿過滋養(yǎng)外胚層的水運動，加上緊密連接封閉以阻斷水的滲漏是促進囊胚形成的主要機制。由此可知，在胚胎的早期發(fā)育過程中，粘附連接蛋白、緊密連接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白對滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚形成起著至關(guān)重要的作用。

4 維持滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的蛋白與Tead 4和Cdx 2之間的關(guān)系

由上述可知，在胚胎的早期發(fā)育過程中，粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs在滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育和囊胚形成方面起重要作用。E-cad-/-胚胎和α-cat-/-胚胎發(fā)育異常，ZO-1和Na+/K+-ATPase β1亞型沉默都將導致胚胎不能發(fā)育到囊胚，而Tead4-/-胚胎和Cdx2-/-胚胎的滋養(yǎng)外胚層譜系發(fā)育失敗，胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能維持，因此推測，粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs與Tead4及Cdx2之間可能存在某種關(guān)系。E-cadherin、α-catenin、ZO-1 α-、Na+/K+-ATPase和關(guān)鍵的AQPs在胚胎附植前發(fā)育的所有階段都表達，Tead4和Cdx2可能直接或間接調(diào)控E-cadherin、α-catenin和ZO-1 α在粘附連接復合體和緊密連接上的組裝、Na+/K+-ATPase在滋養(yǎng)外胚層膜區(qū)的定位或插入到膜區(qū)以及關(guān)鍵AQPs的表達與功能。ZO-1 α和Na+/K+-ATPase β1亞型在桑椹胚～囊胚的轉(zhuǎn)換過程中表達，推測Tead4和Cdx2很可能直接或間接調(diào)控ZO-1和Na+/K+-ATPase β1基因表達。

5 展 望

利用基因敲除方法分別制作Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎，對滋養(yǎng)外胚層特異基因的表達以及滋養(yǎng)外胚層的分化機理進行研究。Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能維持，暗示滋養(yǎng)外胚層的完整性和功能受到損壞。對粘附連接成分E-cadherin和β-catenin以及緊密連接成分ZO-1的定位進行研究，同時研究細胞極化成分、JNK底物蛋白c-Jun以及p38 MAPK信號，結(jié)果只有E-cadherin和ZO-1的定位有些異常，其它的均正常[13,15]，說明Tead4或Cdx2與滋養(yǎng)外胚層連接的形成有一定關(guān)系，但二者之間有什么因果關(guān)系仍不清楚。Tead4或Cdx2應(yīng)該還存在調(diào)控滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的其它機制[35-36]。Na+/K+-ATPase和AQPs在囊胚的形成過程中起著重要作用，Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎的囊胚腔形成失敗可能與Na+/K+-ATPase和AQPs相關(guān)的機制沒有進行深入研究。通過RNA干擾與基因敲除技術(shù)建立Tead4或Cdx2沉默與敲除的胚胎，Tead4和Cdx2的表達與粘附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、緊密連接蛋白(ZO-1α-和ZO-1 α+)、Na+/K+-ATPase和關(guān)鍵AQPs的表達與定位之間的關(guān)系，闡明Tead4和Cdx2維持滋養(yǎng)外胚層完整性和功能的分子機制有待進一步研究和證實。