北京地區(qū)豬圓環(huán)病毒3型感染的檢測及基因組遺傳變異分析

孫 明，馬 君，喬明明，劉巧榮，田新生，楊欣艷，孫勝永，陳西釗,2*

(1. 北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094； 2. 中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，為無囊膜的單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，是在哺乳動物細胞中能自主復(fù)制的最小病毒。豬圓環(huán)病毒目前有兩個血清型：豬圓環(huán)病毒Ⅰ型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)[1]。PCV1對豬沒有致病性，PCV2可致豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated disease, PCV AD)，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、繁殖障礙(reproductive failure)等有關(guān)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。本研究從患PMWS的斷奶仔豬體內(nèi)檢出圓環(huán)病毒3型的序列，并對其病毒分離和全基因測序，分析其培養(yǎng)特征和基因組的遺傳變異情況，為PCV3在中國的流行病學(xué)調(diào)查以及有效防治提供科學(xué)的依據(jù)。PCV2最早在1985年被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病，但屬于零星發(fā)生，直至20世紀90年末才成為流行趨勢，并遍布世界很多國家。我國于2001年首次報道該病[4]，目前已廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。有人報道在豬、牛胃蛋白酶和嚙齒類動物中檢出PCV1和PCV2的DNA，這使得PCV2再次受到眾多研究人員的關(guān)注。2016年P(guān)alinski等[3]和Phan等[5]首次報道了一種新的圓環(huán)病毒——PCV3。Palinski等[3]用PCR和IHC方法，從PDNS損傷的母豬皮膚、肺、腎、淋巴結(jié)、血清以及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)檢出PCV3，推測PCV3可垂直傳播。PCV3的Cap蛋白和Rep蛋白氨基酸序列與PCV2和蝙蝠圓環(huán)病毒相似性分別是37%和55%。Li等[6]報道，環(huán)形病毒和圓環(huán)病毒可能存在跨物種傳播。翟少倫等[7]對豬圓環(huán)病毒感染人類的可能途徑進行了剖析，不過這些推測需要進一步的試驗驗證和臨床調(diào)查。我們針對這個新出現(xiàn)的病毒——PCV3從分子方面進行相關(guān)研究，分析其遺傳變異特征，以研究PCV3與PCV2、PCV1以及其他物種的圓環(huán)病毒之間的親緣關(guān)系，為PCV3的流行病學(xué)和防控研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患豬臨床情況

收集2016年12月至2017年11月期間，北京地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場73份臨床表現(xiàn)繁殖障礙和嚴重呼吸道疾病豬的淋巴結(jié)、肺、脾和腎等組織，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 載體、菌株和主要試劑

pMD19-T克隆載體、Ex-Taq酶購自大連TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；總DNA提取試劑盒為北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為Omega產(chǎn)品。豬圓環(huán)病毒3型實時熒光PCR檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的PCV3和PCV2全基因序列分析，設(shè)計3對引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1引物序列

Table1Thesequenceoftheprimers

引物名稱Primer name上游引物(5'→3')Sense primer下游引物(5'→3')Antisense primer產(chǎn)物位置Genome positionP1TAGTATTACCCGGCACCTCGGAAATTCATCAAATGGAACCCACCCAT1—880位P2TTGGTGGGATGGTTATA ATGGGGAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCA806—1 505位P3TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCAGTGCCCGGCACCAAAATGAGACACA1 381—2 000位

1.4 基因擴增

用DNA提取一份陽性病料，按照DNA試劑盒說明書提取病毒全基因組，按照以下程序進行基因擴增：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用OMEGA公司膠回收試劑盒回收純化擴增的目的基因片段。

1.5 擴增產(chǎn)物的克隆及測序

分別將PCR擴增得到的3個片段連接到pMD19-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。用PCR方法篩選陽性克隆，將初步鑒定的陽性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.6 PCV3全基因組拼接以及序列同源性分析

應(yīng)用DNAMan和DNAStar對測序序列進行拼接，并將其與PCV1、PCV2、PCV3以及其他物種圓環(huán)病毒基因組序列進行序列同源性分析、比對；并對其Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸序列進行比對分析，繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 2016—2017年北京地區(qū)PCV3檢出情況

用豬圓環(huán)病毒3型和豬圓環(huán)病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒進行檢測，檢測結(jié)果顯示PCV2和PCV3陽性率分別為58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.7%(18/73)。

2.2 PCV3基因組擴增

成功獲得與預(yù)期大小相符的基因片段，結(jié)果見圖1。大小分別為880、700和620 bp。

1、2和3分別代表P1、P2和P3引物擴增；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準1, 2, and 3 were amplified with P1, P2, and P3 primers, respectively；M. DL2000 DNA marker圖1 PCV3全基因組克隆Fig.1 Clones of PCV3 genome

2.3 克隆鑒定和測序

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定顯示，成功將3個片段克隆到pMD19-T載體中。陽性質(zhì)粒經(jīng)測序、拼接，獲得了PCV3全基因組序列，序列全長2 000 nt。該序列已經(jīng)提交到GenBank上，登錄號為MG546667，將該病毒命名為PCV3/CN/BJ-YH2016?；蚪M含有3個開放閱讀框(ORF)，主要編碼2種蛋白：復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)和核衣殼蛋白(Cap)。

2.4 基因組序列同源性分析

利用DNAMAN生物分析軟件將PCV3/CN/BJ-YH2016基因組序列與NCBI上現(xiàn)有的PCV3全基因組序列進行比較分析，并繪制系統(tǒng)進化樹(圖2)。發(fā)現(xiàn)基因組序列與NCBI上的30株P(guān)CV3序列相似性為98.6%～99.3%。其中與PCV3/CN/Anhui-14/201611毒株相似性最低，和PCV3-US/SD2016毒株(KX966193)、PCV3/CN/Chongqing-148/2016(KY075991)、PCV3/CN/Chongqing-147/2016(KY075990)和PCV3/CN/Jiangxi-62/2016(KY075989)相似性最高。

與PCV2、PCV1以及其他物種的圓環(huán)病毒基因組序列系統(tǒng)進化分析顯示，PCV3可能與水貂圓環(huán)病毒和蝙蝠圓環(huán)病毒親緣關(guān)系密切，在一個大的分枝上，見圖2。

圖2 PCV3/CN/BJ-YH2016毒株與其他參考毒株全基因組進化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the complete genomes of PCV3/CN/BJ-YH2016 and other reference viruses

2.5 Rep遺傳進化分析

分析現(xiàn)有的PCV3毒株，本分離株與美國毒株P(guān)CV3-US/MO2015(GenBank序列號KX778720)毒株的Rep蛋白氨基酸序列相似性最高(為100%)，與國內(nèi)毒株P(guān)CV3/CN/Guangdong-SG1/2016(GenBank序列號MF589105)相似性最低(為95%)，有16個氨基酸變異，全部集中在5—23位氨基酸，與PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016和2164毒株的Rep基因推導(dǎo)氨基酸序列對比有3個氨基酸變異，分別位于44、122和187 aa位點。與PCV2、PCV1和BatCV相比，Rep氨基酸序列相似性分別為48%、46%和55%。Rep系統(tǒng)進化樹顯示，該分離株和蝙蝠以及魚類圓環(huán)病毒在一個分枝上，親緣關(guān)系較近(圖3)。

2.6 Cap遺傳進化分析

Cap蛋白氨基酸序列與美國毒株2164(KX458235)的相似性為100%，與其他毒株均有1～4個氨基酸發(fā)生變異，其中與PCV3-US/MO2015毒株相比，變異位點分別位于24、26、56和100 aa。該毒株Cap基因核苷酸序列與國內(nèi)26個毒株以及國外7個代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分別為97.2%～100%和97.6%～100%，編碼的氨基酸序列相似性分別為97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和國內(nèi)外PCV3具有較高的同源性，遺傳關(guān)系較近。系統(tǒng)進化樹顯示該分離毒株屬于3b亞群(圖4)。

圖3 基于PCV3 Rep基因序列同源性的遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PCV3 on Rep gene sequence homology

圖4 基于PCV3 Cap基因序列同源性構(gòu)建的遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PCV3 on Cap gene sequence homology

3 討 論

PCV1普遍存在于豬群中而不致病，PCV2通常被認為是引起豬圓環(huán)病毒病的主要因素。Li等[6]報道在腹瀉患者和健康人的糞便、人用疫苗及牛肉中檢測到PCV2；稱PCV2可能感染人類的路線包括食物傳播(使用或者接觸新鮮豬肉產(chǎn)品，食用未熟牛肉或者生鮮奶、喝生水)、接種感染、異種器官移植、空氣傳播，以突出公共衛(wèi)生意義和物種交叉?zhèn)鞑8]。20世紀90年代中期，PCV2首次從加拿大斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的患病豬體內(nèi)分離[9]，很快遍布世界各地。1993年P(guān)DNS在世界多個國家報道，并陸續(xù)在豬體內(nèi)檢測到PCV2，并認為PCV2是主要致病因素。后Thibault等[11]和Segalés等[12]報道從豬體內(nèi)檢測到的PCV2抗原不一致，這引發(fā)了人們對PCV2在PDNS中作用的猜測[3]。2016年，美國學(xué)者報道了一種新的圓環(huán)病毒基因型——PCV3，該病毒從出現(xiàn)PDNS癥狀、流產(chǎn)仔豬以及患PMWS的斷奶仔豬體內(nèi)分離得到，而PCV2檢測為陰性[3, 5]。這提示PCV3可能為導(dǎo)致PDNS、PMWS以及繁殖障礙的病原之一。

由于PCV2對養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失，故應(yīng)對這個新出現(xiàn)的PCV3進行更深入的研究，以證明其在PCVADS中的重要性。Phan等[5]從3例出現(xiàn)厭食、體重下降、關(guān)節(jié)和淋巴結(jié)腫大，心損傷和多系統(tǒng)炎癥(腸炎、肺炎)等癥狀的斷奶仔豬體內(nèi)檢測出PCV3。Palinski等[3]從患PDNS的母豬流產(chǎn)木乃伊胎和死于PDNS的母豬體內(nèi)檢測到PCV3，他們用PCR和IHC方法，從患PDNS樣損傷的母豬的皮膚、肺、腎和淋巴結(jié)中檢出PCV3，而未檢測到PCV2，他們對271份豬呼吸系統(tǒng)疾病豬進行了qPCR和ELISA檢測，分別檢出陽性34份(12.5%) 和83份(55%)，表明PCV3是侵蝕呼吸系統(tǒng)的。2016年12月至2017年11月，本實驗室對北京地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場臨床表現(xiàn)繁殖障礙和嚴重呼吸系統(tǒng)疾病的患豬進行了PCV2和PCV3的檢測，結(jié)果顯示，PCV2和PCV3陽性率分別為58.9%(43/73)和30.1%(22/73)，PCV3和PCV2混合感染率24.6%(18/73)，此數(shù)據(jù)與Ku等[10]的研究結(jié)果相一致。本研究充分證明，北京也存在PCV3的感染。隨之對養(yǎng)殖場進行調(diào)研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分養(yǎng)殖場管理不當，疫苗免疫不規(guī)范，未定期對豬進行PCV2免疫，衛(wèi)生情況欠佳，發(fā)病豬主要集中在20～30日齡的保育豬，保育豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，腿關(guān)節(jié)腫大，死亡率高達30%，母豬流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎。這些結(jié)果說明PCV3在不孕、PDNS和PMWS中扮演著重要的角色。為了進一步研究PCV3遺傳變異特征，本研究選取1份PCV3陽性樣品進行全基因組測序。

測序結(jié)果和遺傳進化分析顯示，該病毒基因組全長2 000 bp，并將病毒命名為PCV3/CN/BJ-YH2016。其與NCBI上的30株P(guān)CV3基因組序列相似性為98.6%～99.3%；基因組序列系統(tǒng)進化分析顯示，PCV3與PCV2、PCV1以及水貂圓環(huán)病毒和蝙蝠圓環(huán)病毒在一個大的分枝上，親緣關(guān)系密切。Rep蛋白氨基酸序列分析顯示，該毒株與美國毒株P(guān)CV3-US/MO2015毒株的相似性最高，為100%；與國內(nèi)毒株P(guān)CV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，為95%；PCV3與PCV2、PCV1和BatCV相比，相似性分別為48%、46%和55%；系統(tǒng)進化樹顯示，該分離株和犬圓環(huán)病毒、鵝圓環(huán)病毒、鴨圓環(huán)病毒以及蝙蝠圓環(huán)病毒在一個分枝上，親緣關(guān)系較近。這與Palinski等[3]和Phan等[5]的研究結(jié)果相一致。Phan等[5]認為：無論PCV3在豬體內(nèi)一直存在還是從別的物種傳播引起，仍是未知數(shù)，這需要對歷史樣品進行研究分析。Palinski等[3]根據(jù)PCV3、PCV2、PCV1和其他物種的圓環(huán)病毒系統(tǒng)進化樹提出：PCV3、PCV2、PCV1和BatCV-2(蝙蝠圓環(huán)病毒)可能擁有共同的祖先，然而這種推測缺少有力證據(jù)[3,13]。

Cap基因序列比對結(jié)果顯示，北京毒株P(guān)CV3/CN/BJ-YH2016與國內(nèi)26個毒株以及國外7個代表毒株的Cap基因相比，核苷酸相似性分別為97.2%～100%和97.6%～100%，編碼的氨基酸序列相似性分別為97.8%～100%和98.1%～100%；表明PCV3北京毒株和國內(nèi)外PCV3具有較高的同源性，遺傳關(guān)系較近；系統(tǒng)進化樹顯示目前國內(nèi)外毒株主要是3a和3b亞型，本分離毒株屬于3b亞群。

本研究表明PCV3在北京地區(qū)廣泛存在，且患病豬場一般存在管理不當，疫苗免疫不規(guī)范，衛(wèi)生情況欠佳，且出現(xiàn)24.6%患豬同時感染PCV2和PCV3，并伴有細菌感染。有報道PCV3和PCV2毒株的抗原交叉保護性較低，現(xiàn)有的PCV2疫苗無法為PCV3感染提供有效的免疫保護作用[2，14-15]。養(yǎng)殖場之所以出現(xiàn)30%的死亡率，可能與患豬感染PCV2、PCV3并伴有細菌感染有關(guān)，從而導(dǎo)致發(fā)病豬較高的死亡率。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)加強衛(wèi)生管理、按時接種疫苗，并定期進行PCV3的流行狀況調(diào)查，以有效防控PCV3的流行。

4 結(jié) 論

北京地區(qū)豬群中已存在PCV3感染，并對其進行了基因組測序，基因組遺傳分析結(jié)果顯示，PCV3全基因組長2 000 bp，并命名為PCV3/CN/BJ-YH2016。其Rep蛋白氨基酸序列與美國毒株P(guān)CV3-US/MO2015的相似性最高，為100%；與中國毒株P(guān)CV3/CN/Guangdong-SG1/2016相似性最低，為95%；Cap蛋白氨基酸序列與美國毒株2164的相似性為100%，與其他毒株相比均有4個氨基酸發(fā)生變異。這些數(shù)據(jù)將為研究這種新型病毒——PCV3的遺傳變異和流行病學(xué)特征提供分子生物學(xué)依據(jù)。