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    10種豬常見病毒基因芯片檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

    2018-10-30 07:33:40張小龍房保海石玲玲王冬冬楊宗統(tǒng)王守春尹燕博
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2018年10期
    關(guān)鍵詞:基因芯片探針雜交

    羅 寧,王 群,張小龍,房保海,姜 帆,石玲玲,王冬冬,3,楊宗統(tǒng),王守春,徐 彪*,尹燕博*

    (1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,青島 266109; 2. 山東出入境檢疫檢驗(yàn)局/食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心,青島 266001; 3. 青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,青島 266225; 4. 澳蘭百特生物工程有限公司,青島 266101)

    實(shí)驗(yàn)用豬在人類疾病發(fā)病機(jī)制研究、新藥研發(fā)等方面的應(yīng)用越來越廣泛,這些領(lǐng)域?qū)?shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量的要求也愈來愈高。病毒病是影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要因素之一,建立針對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬病毒病的快速、高通量檢測(cè)方法十分必要[1]。實(shí)驗(yàn)用豬病中,CSFV(classical swine fever virus),PRRSV(porcine reproductive and respiratory syndrome virus),TGEV(transmissible gastroenteritis virus of swine),PEDV(porcine epidemic diarrhea virus),SIV(swine influenza virus),PRV(pseudorabies virus),PCV2(porcine circovirus 2),PPV(porcine parvovirus),PCMV(porcine cytomegalovirus),F(xiàn)MDV(food-and-mouth disease virus)是危害豬群健康的主要病原,且在臨床中存在多種病毒混合感染的情況[2],因此同步、快速、高通量檢測(cè)這10種病毒病對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制具有重要意義。

    目前,針對(duì)病毒性傳染病的診斷一般采用病原分離鑒定以及血清學(xué)方法,但這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差,特別是當(dāng)豬群混合感染多種病原時(shí),應(yīng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行早期快速檢測(cè)和鑒別診斷。基因芯片技術(shù)作為一種新興的分子生物學(xué)研究方法,具有高通量、多樣性、微量化以及自動(dòng)化的特點(diǎn)[3-5]。該方法快速、準(zhǔn)確,在疾病的診斷和病原體的篩查上發(fā)揮著越來越重要的作用[6]。

    本研究針對(duì)豬常見的10種病毒設(shè)計(jì)了10對(duì)特異性引物,設(shè)計(jì)檢測(cè)基因點(diǎn)陣,探索研究同時(shí)檢測(cè)10種病毒的基因芯片檢測(cè)方法,并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用效果評(píng)價(jià),以期進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室診斷效率,為實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制及這10種病毒的防控和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了有力工具。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 檢測(cè)樣本 2016年11月—2017年3月來源于遼寧葫蘆島、河南洛陽、山東膠州、廣西玉林采集的和送檢的臨床病料,來源于山東即墨屠宰線采集的樣本,均為肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等臟器組織,每個(gè)組織標(biāo)記為一個(gè)樣本,共1 006份樣本。

    1.1.2 病毒毒株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA 1株購(gòu)自中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心;豬瘟弱毒疫苗、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)弱毒疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司;豬偽狂犬病活疫苗、豬乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株購(gòu)自中牧股份實(shí)業(yè)有限公司;豬口蹄疫滅活病毒(A型、O型、Asia型)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。細(xì)小病毒滅活疫苗購(gòu)自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司;豬流感病毒[7]由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;豬巨細(xì)胞病毒陽性病料[8]由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.3 主要試劑 晶芯光學(xué)級(jí)氨基基片、晶芯基因芯片點(diǎn)樣液均購(gòu)自北京博奧生物有限公司;核酸雜交液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;λ DNA、RNAiso Plus試劑、Reverse Transcriptase XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor(RNasin)RNA抑制劑、pMD19-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于AXYGEN公司;Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒、2×EasyTaqPCR Super Mix、Trans2K DNA Marker購(gòu)自北京全式金公司;無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV的H1N1、H3N2、H9N2亞型、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV的保守基因核苷酸序列,參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)計(jì)10對(duì)特異性引物。其中TGEV的引物序列參考《豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法》[9]設(shè)計(jì);FMDV引物根據(jù)Fernández等[10]設(shè)計(jì);PPV根據(jù)《豬細(xì)小病毒病聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程》[11]設(shè)計(jì)。通過NCBI上的BLAST工具對(duì)這10對(duì) 引物進(jìn)行比對(duì)分析,分析表明這10對(duì)引物與其他病毒不存在任何同源性。每對(duì)引物合成一條上游引物和兩條下游引物,并將其中一條下游引物的5′端進(jìn)行Cy3分子修飾以對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)記。定位基因引物參考曹三杰等[12]設(shè)計(jì)合成。引物序列、目的基因以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1;引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    表1引物信息及目的基因片段長(zhǎng)度

    Table1Informationofprimersforprobeandlengthoffragment

    病毒Virus目的基因Target gene引物序列(5'→3')Sequences of primers長(zhǎng)度/bpExpected sizeCSFV5' UTRF:ACGTGAGCAGAAGCCCACCT247R:CCGGTTCCTCCACTCCCATTL:Cy3-CCGGTTCCTCCACTCCCATTPRRSVORF6F:GGCTTTCATCCGATTGCG270R:TTGCCTCTGGACTGGTTTL:Cy3-TTGCCTCTGGACTGGTTTTGEVNF:GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC276R:CAACCCAGACAACTCCATCTAL:Cy3-CAACCCAGACAACTCCATCTAPEDVNF:TCGGAACAGGACCTCACG447R:TTGACAGCAGCCACCAGAL:Cy3-TTGACAGCAGCCACCAGASIVMF:TTCTAACCGAGGTCGAAAC229R:AAGCGTCTACGCTGCAGTCCL:Cy3-AAGCGTCTACGCTGCAGTCCPRVgHF:ACCGTCTGAGAGAGACTGAACTTCTC355R:CCCTGATCTTAAATGACGAGGACGTGACL:CCAGTCCCCTTCTCAGATCPCV2ORF2F:TGACCTGTCTACTGCTGTGA472R:CCGTGGATAGTTCTGTAGCAL:Cy3-CCGTGGATAGTTCTGTAGCAPPVVP2F:GGGGAGGGCTTGGTTAGAAT322R:TGGTTGGTGGTGAGGTTGCTL:Cy3-TGGTTGGTGGTGAGGTTGCTPCMVgBF:CAGCGACACCGGAAGTTTCTACG263R:CGACAATTCCTTGGTATACGTCCL:Cy3-CGACAATTCCTTGGTATACGTCCFMDV3DF:GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC275R:CAWCGCAGGTAAAGTGATCTGL:Cy3-CAWCGCAGGTAAAGTGATCTGPositive geneλF:AAAGCGACGCAATGAGGCACT500R:GTTCCACGACCGCAACTGCL:Cy3-GTTCCACGACCGCAACTGC

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 重組質(zhì)粒的制備

    1.2.1.1 特異性目的基因的PCR擴(kuò)增:PRV、PCV2、PPV核酸提取采用酚-氯仿快速抽提法,CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、FMDV核酸提取采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit進(jìn)行,RNA提取后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以提取的核酸DNA或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板,以表1未標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10種病毒的PCR反應(yīng)體系為30 μL:DNA/cDNA 4 μL,上游引物(25 μmol·L-1)1.5 μL,下游引物(25 μmol·L-1)1.5 μL,2×EasyTaqPCR Super Mix 15 μL,補(bǔ)ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s,51~59 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。

    1.2.1.2 PCR退火溫度的確定:以梯度PCR儀在51~59 ℃范圍內(nèi)自動(dòng)設(shè)置8個(gè)退火溫度梯度。梯度退火溫度51、51.3、52.2、53.4、54.8、56.3、57.7、59.2 ℃,每種病毒分別進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增,以確定10種病毒的退火溫度。

    1.2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建:PCR反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。切膠后用DNA回收。將目的片段導(dǎo)入pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化后挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定,經(jīng)鑒定后保菌,提取克隆質(zhì)粒備用,將提取的質(zhì)粒送至生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序鑒定。

    1.2.2 基因芯片的制備

    1.2.2.1 靶基因及定位對(duì)照基因的制備:將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品10種病毒重組質(zhì)粒稀釋50倍后分別作為各PCR反應(yīng)模板,以表1不帶標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,定位對(duì)照基因以λDNA為模板用帶標(biāo)記和不帶標(biāo)記的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,作為芯片反應(yīng)的陽性質(zhì)控,反應(yīng)體系為100 μL:質(zhì)粒2 μL,上游引物(25 μmol·L-1)2 μL,下游引物(25 μmol·L-1)2 μL,2×EasyTaqPCR Super Mix 50 μL,補(bǔ)ddH2O至100 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共40循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。鑒定后用酚-氯仿-異戊醇抽提法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

    1.2.2.2 芯片的設(shè)計(jì)與制備:將靶基因和定位對(duì)照基因定量至400 ng·μL-1,加入等量的基因芯片點(diǎn)樣緩沖液配制成點(diǎn)樣液,將點(diǎn)樣液按芯片設(shè)計(jì)要求(圖1)加入96孔板內(nèi),設(shè)純點(diǎn)樣緩沖液為陰性對(duì)照,用基因芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)在氨基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣。

    圖1 基因芯片矩陣設(shè)計(jì)Fig.1 The design of DNA microarray spotting

    點(diǎn)制好的芯片靜置于點(diǎn)樣儀上過夜固定,放入盛有0.2% SDS的燒杯中,室溫?fù)u床中清洗10 min,再放入盛有無水乙醇的燒杯中洗滌,上下快速提拉芯片架30次,重復(fù)此操作,放入50 mL離心管中,2 000 r·min-1室溫離心10 min甩干后密封,室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 基因芯片雜交 試驗(yàn)采用Cy3直接標(biāo)記法標(biāo)記探針,以稀釋50倍的各標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒為模板,采用各病毒5′端標(biāo)記Cy3分子的下游引物和上游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將cDNA進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增結(jié)束后電泳鑒定進(jìn)行純化。雜交前為了保證同一張芯片上4個(gè)點(diǎn)陣區(qū)域有相同的反應(yīng)條件,并且為防止各個(gè)樣品之間產(chǎn)生交叉污染,需要對(duì)芯片進(jìn)行圍欄的粘貼,將膠粘貼至芯片上使平等分為四個(gè)區(qū)域。然后將芯片置于芯片架上,浸入98 ℃水中變性2 min,取出芯片架迅速浸入冰冷的乙醇中1 min,1 500 r·min-1室溫離心10 min甩干。與此同時(shí)進(jìn)行探針的變性處理,將純化后的各PCR產(chǎn)物混合,95 ℃水中變性5 min,立即冰浴2 min,后與雜交液按1∶2比例混合均勻。

    使用Advalytix的生物芯片雜交儀SB401-0145進(jìn)行雜交, 55 ℃ 2 h。

    1.2.4 芯片雜交后洗滌 雜交結(jié)束后,將芯片水平取出,放入預(yù)熱至42 ℃的洗滌液Ⅰ(0.3×SSC/0.1%SDS)中200 r·min-1室溫清洗2 min,取出芯片放入預(yù)熱至42 ℃的洗液Ⅱ(0.6% SSC)中200 r·min-1室溫清洗2 min,洗滌兩次,最后將芯片在無水乙醇中上下浸提幾次,然后把芯片放入離心管中,1 500 r·min-1離心10 min甩干。

    1.2.5 芯片掃描與結(jié)果判定 芯片用晶芯LuxScan 10K進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)為綠色10 μm分辨率、532 nm單色熒光、100% Power Gain,掃描結(jié)果用16位tiff格式圖片保存,最后對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    當(dāng)?shù)?列與第14列陽性位點(diǎn)有綠色熒光信號(hào),且2列和13列陰性位點(diǎn)沒有熒光信號(hào)時(shí),芯片檢測(cè)結(jié)果為有效結(jié)果。結(jié)果軟件系統(tǒng)分析各位點(diǎn)的信噪比值(signal to noise ratio, SNR),統(tǒng)計(jì)計(jì)算定位對(duì)照基因(10個(gè)位點(diǎn))和探針(各10個(gè)位點(diǎn))的平均SNR,根據(jù)10個(gè)點(diǎn)信號(hào)中位值(Median)以及其與背景信號(hào)平均值的比值(SNRm)為判定依據(jù)。當(dāng)Median≥1 000、SNRm值≥2;掃描出的各個(gè)點(diǎn)陽性清晰可見,三者結(jié)果一致可以判定為雜交結(jié)果成立。

    1.2.6 芯片檢測(cè)的特異性、敏感性、重復(fù)性檢測(cè) 分別以正常組織、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、PRV、PCV2、PPV、JEV和PoRV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別與制備病毒基因芯片進(jìn)行雜交,以驗(yàn)證病毒基因芯片的特異性。

    測(cè)定各病毒重組質(zhì)粒常規(guī)PCR膠回收產(chǎn)物的濃度,將各病毒回收產(chǎn)物等比例混合作101~108倍比稀釋后,分別與制備的基因芯片進(jìn)行雜交,以評(píng)價(jià)病毒基因芯片檢測(cè)的靈敏性。

    以各病毒核酸為模板用帶Cy3分子標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備混合探針然后與3個(gè)批次的6張芯片(2張·批次-1)和同一批次的6張芯片進(jìn)行雜交,以檢驗(yàn)批次內(nèi)及批次間芯片之間的一致性。

    1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 隨機(jī)選取80份臨床樣品處理后取上清液用于病毒RNA或DNA的提取,然后反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選用Cy3分子標(biāo)記的引物標(biāo)記探針,PCR擴(kuò)增后取5 μL電泳,其余與制備的基因芯片雜交,記錄電泳結(jié)果,與基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

    2 結(jié) 果

    2.1 PCR退火溫度的確定

    10種病毒的PCR/RT-PCR最佳退火溫度范圍均較廣,PRRSV退火溫度在51~53.4 ℃之間會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,在53.4~59.2 ℃特異性擴(kuò)增效果良好,PRV退火溫度在52.2~56.3 ℃擴(kuò)增良好,F(xiàn)MDV退火溫度在51~54.8 ℃擴(kuò)增良好,其他病毒在51~59 ℃擴(kuò)增效果均良好無明顯差別(圖2),10種病毒各自最佳退火溫度見表2。

    表210種病毒最佳退火溫度

    Table2Optimumannealingtemperatureoftenviruses

    病毒VirusCSFVPRRSVTGEVPEDVSIVPRVPCV2PPVPCMVFMDV長(zhǎng)度/bpExpected size247270276447229355472322263275最佳退火溫度/℃Optimal annealing temperature51~59.253.4~59.251~56.351~59.251~59.252.2~56.351~56.351~59.251~59.251~54.8

    M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);A. PRRSV;B. PCV2;C. PCMV;D. SIV;E. PRV;F. CSFV;G. PPV;H. PEDV;I. FMDV;J. TGEV;1. 51 ℃;2. 51.3 ℃;3. 52.2 ℃;4. 53.4 ℃;5. 54.8 ℃;6. 56.3 ℃;7. 57.7 ℃;8. 59.2 ℃M. DL2000 DNA marker;A. PRRSV; B. PCV2; C. PCMV; D. SIV; E. PRV; F. CSFV; G. PPV; H. PEDV; I. FMDV; J. TGEV; 1. 51 ℃; 2. 51.3 ℃; 3. 52.2 ℃; 4. 53.4 ℃; 5. 54.8 ℃; 6. 56.3 ℃; 7. 57.7 ℃; 8. 59.2 ℃圖2 單項(xiàng)PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization for annealing temperature of single PCR

    2.2 10種標(biāo)準(zhǔn)品病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果及產(chǎn)物鑒定

    以提取的CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV、λDNA的核酸為模板,用表1不代標(biāo)記的特異性引物分別擴(kuò)增相應(yīng)病毒。結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示,擴(kuò)增出條帶與預(yù)期相符,分別約247、270、276、447、229、355、472、322、263、275 bp(圖3)。連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線工具BLAST比對(duì)分析。結(jié)果顯示,擴(kuò)增序列與10種病毒各自引物設(shè)計(jì)株的預(yù)期擴(kuò)增序列相似性均在99%以上,所測(cè)的序列分別為CSFV 5′ UTR基因、PRRSV ORF6基因、TGEVN基因、PEDVN基因、SIVM基因、PRVgH基因、PCV2 ORF2基因、PPVVP2基因、PCMVgB基因、FMDV 3D基因,均為各病毒高度保守基因序列區(qū)域,驗(yàn)證了基因芯片上的雜交結(jié)果的可信性。

    2.3 芯片特異性檢測(cè)

    使用帶標(biāo)記的引物分別擴(kuò)增CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV、JEV和PoRV等常見豬病毒的基因,與對(duì)照基因混合后進(jìn)行芯片雜交,掃描后分析結(jié)果,芯片上各病毒靶基因與其目標(biāo)探針有較強(qiáng)雜交信號(hào)、可見斑點(diǎn)清晰,與其他非目的探針基本沒有可見信號(hào),非目標(biāo)病毒檢測(cè)結(jié)果呈陰性(圖4)。試驗(yàn)結(jié)果表明基因芯片檢測(cè)這10種病毒的方法特異性良好。

    M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.陰性對(duì)照;2. CSFV PCR產(chǎn)物(247 bp);3. PRRSV PCR產(chǎn)物(270 bp);4. TGEV PCR產(chǎn)物(276 bp);5. PEDV PCR產(chǎn)物(447 bp);6. SIV PCR產(chǎn)物(229 bp);7. PRV PCR產(chǎn)物(355 bp);8. PCV2 PCR產(chǎn)物(472 bp);9. PPV PCR產(chǎn)物(322 bp);10. PCMV PCR產(chǎn)物(263 bp);11. FMDV PCR產(chǎn)物(275 bp);12. λDNA PCR產(chǎn)物(500 bp)M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2. PCR products (247 bp) of CSFV; 3. PCR products (270 bp) of PRRSV; 4. PCR products (276 bp) of TGEV; 5. PCR products (447 bp) of PEDV; 6. PCR products (229 bp) of SIV; 7. PCR products (355 bp) of PRV; 8. PCR products (472 bp) of PCV2; 9. PCR products (322 bp) of PPV; 10. PCR products (263 bp) of PCMV; 11. PCR products (275 bp) of FMDV; 12. PCR products (500 bp) of λDNA圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR product showed on Agarose gel

    2.4 芯片檢測(cè)敏感性試驗(yàn)

    測(cè)定各病毒PCR產(chǎn)物濃度,換算成DNA的拷貝數(shù),將各病毒產(chǎn)物作101~108倍比稀釋后與芯片雜交,掃描結(jié)果分析,各病毒的芯片檢測(cè)敏感性不同,最低檢測(cè)濃度分別如下:CSFV 1.96×105copies·μL-1、PRRSV 2.25×105copies·μL-1、TGEV 3.39×105copies·μL-1、PEDV 2.16×105copies·μL-1、SIV 2.63×105copies·μL-1、PRV 2.68×105copies·μL-1、PCV2 2.93×105copies·μL-1、PPV 2.32×105copies·μL-1、PCMV 3.51×106copies·μL-1、FMDV 1.57×106copies·μL-1,芯片檢測(cè)敏感性結(jié)果表明,該檢測(cè)芯片的最低可檢測(cè)到105copies的病毒。

    2.5 芯片穩(wěn)定性檢測(cè)

    使用帶標(biāo)記引物分別擴(kuò)增各病毒模板,將混合探針與雜交液混合,進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)。掃描結(jié)果顯示在相同雜交條件下,批次內(nèi)和批次間的芯片熒光信號(hào)值相對(duì)穩(wěn)定,檢測(cè)結(jié)果一致,信號(hào)中位值的變異系數(shù)均小于5.26%,檢測(cè)結(jié)果表明同一批次或不同批次的芯片均具有較好可重復(fù)性。

    2.6 臨床樣本檢測(cè)

    156份臨床樣品中,基因芯片檢測(cè)CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV的陽性率分別為6.41%、3.21%、7.05%、7.69%、5.13%、5.13%、3.85%、4.49%、3.21%,未檢出FMDV感染;混合感染情況與單項(xiàng)PCR/RT-PCR符合率見表3;850份屠宰場(chǎng)樣品中,基因芯片檢測(cè)CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV的陽性率分別為7.53%、4.12%、2.35%、0.59%、0.59%、1.18%、4.71%、1.88%、1.18%,未檢出FMDV感染;混合感染情況與單項(xiàng)PCR/RT-PCR符合率見表4,部分樣品檢測(cè)結(jié)果見圖5。

    3 討 論

    豬是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是獲得理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的必要前提。基因芯片檢測(cè)方法具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn)[13],可同時(shí)對(duì)多種病毒基因進(jìn)行檢測(cè)分析,可最大限度保證檢出率,及時(shí)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量水平。

    本研究建立的豬病芯片檢測(cè)方法,在一次試驗(yàn)中可同時(shí)檢測(cè)10種豬病毒,有效縮短檢測(cè)時(shí)間。本試驗(yàn)研究的基因芯片為cDNA芯片,并將探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為約200~450個(gè)堿基,各病毒探針之間的同源性均小于46.7%,避免產(chǎn)生堿基錯(cuò)配影響雜交結(jié)果分析保證了該cDNA芯片的特異性和敏感性,并且各病毒探針有相似的Tm值,從而使雜交條件接近芯片上所有靶基因的最佳條件。

    芯片雜交屬于固-液相雜交反應(yīng),影響雜交反應(yīng)的條件包括雜交雙方的濃度和雜交序列特點(diǎn)、雜交的溫度以及時(shí)間、洗滌條件等。一般情況下雜交溫度比靶基因Tm值小5 ~ 10 ℃時(shí)雜交效率高,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的所有探針均有相似的Tm值,均在82~ 94 ℃, 在雜交過程中加入含50%甲酰胺的雜交液可使雜交溫度降低25 ℃,同時(shí)能夠降低雜交背景。本研究的最適雜交溫度為55 ℃,雜交的效果好,雜交斑點(diǎn)清晰可見,信號(hào)值穩(wěn)定。

    目前標(biāo)記探針的制備分為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法,間接標(biāo)記法是在擴(kuò)增時(shí)將染料標(biāo)記的底物摻入cDNA,直接標(biāo)記法是引物的5′端加入熒光修飾基團(tuán),以帶標(biāo)記的引物擴(kuò)增使cDNA帶上標(biāo)記。直接標(biāo)記法迅速、操作簡(jiǎn)單、步驟少,可快速大規(guī)模分析樣品。而間接標(biāo)記法步驟繁多,引入誤差的幾率增大,還需要在摻入標(biāo)記底物的過程中進(jìn)行等優(yōu)化,這些步驟使得間接標(biāo)記的成本要高于直接標(biāo)記。另外,根據(jù)楊國(guó)淋等[14]、馬銳等[15]報(bào)道,采用直接標(biāo)記法的芯片敏感性比間接標(biāo)記法高100倍,因此本研究選擇直接標(biāo)記法進(jìn)行試驗(yàn)。

    A.陰性對(duì)照;B. 基因芯片檢測(cè)CSFV結(jié)果;C. 基因芯片檢測(cè)PRRSV結(jié)果;D. 基因芯片檢測(cè)TGEV結(jié)果;E. 基因芯片檢測(cè)PEDV結(jié)果;F. 基因芯片檢測(cè)SIV結(jié)果;G基因芯片檢測(cè)PRV結(jié)果;H. 基因芯片檢測(cè)PCV2結(jié)果;I. 基因芯片檢測(cè)PPV結(jié)果;J. 基因芯片檢測(cè)PCMV結(jié)果;K. 基因芯片檢測(cè)FMDV結(jié)果;L. 基因芯片檢測(cè)JEV、PoRV結(jié)果A. Negative control; B. The gene microarray hybridization result of CSFV; C. The gene microarray hybridization result of PRRSV; D. The gene microarray hybridization result of TGEV; E. The gene microarray hybridization result of PEDV; F. The gene microarray hybridization result of SIV; G. The gene microarray hybridization result of PRV; H. The gene microarray hybridization result of PCV2; I. The gene microarray hybridization result of PPV; J. The gene microarray hybridization result of PCMV; K. The gene microarray hybridization result of FMDV; L. The gene microarray hybridization result of JEV, PoRV圖4 芯片檢測(cè)特異性結(jié)果Fig.4 The specificity of the gene microarray assay

    表3臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    Table3Statisticsondetectionofclinicalsampleusedforgenechips

    病原類型Pathogens陽性樣本Positive sample檢出率/%Detection ratesPCR/RT-PCRGene chipPCR/RT-PCRGene chip符合率/%Coincidence ratesCSFV12107.696.4198.72PRRSV855.133.2198.08TGEV7114.497.0597.44PEDV9125.777.6998.08SIV1086.415.1398.72PRV683.855.1398.72PCV2965.773.8598.08PPV875.134.4999.36PCMV553.213.21100.00FMDV0000100.00CSFV+PRRSV1277.694.4996.79CSFV+PCV29105.776.4199.36PRRSV+PCV27124.497.6997.00PRRSV+TGEV895.135.7799.36TGEV+PCV29115.777.0598.72PCV2+PCMV9125.777.6998.00TGEV+PCV2+PPV855.133.2198.08CSFV+PRRSV+PCV2452.563.2199.36TGEV+PEDV+PCV2+PPV341.922.5699.36CSFV+PRRSV+TGEV+PRV+PCV2442.562.56100.00

    表4屠宰場(chǎng)采集樣品850份檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    Table4Statisticsondetectionof850samplestakenfromslaughterhouseusedforgenechips

    病原類型Pathogens陽性樣本Positive sample檢出率/%Detection ratesPCR/RT-PCRGene chipPCR/RT-PCRGene chip符合率/%Coincidence ratesCSFV74648.707.5398.82PRRSV35354.124.12100.00TGEV31203.652.3598.71PEDV850.940.5999.65SIV750.820.5999.76PRV10101.181.18100.00PCV243405.064.7199.65PPV25162.941.8898.94PCMV14101.651.1899.53FMDV0000100.00

    (轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

    圖5 部分臨床樣品芯片檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Screening of clinical specimens by gene chips

    應(yīng)用本試驗(yàn)所構(gòu)建的芯片檢測(cè)方法對(duì)隨機(jī)選取的156份臨床發(fā)病樣本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示,所測(cè)樣本中有151份感染病毒,未感染病毒的只占3.21%,單純感染中以冠狀病毒(TGEV、PEDV)陽性率最高均為7%以上,混合感染陽性率達(dá)到50.64%,多以CSFV+PRRSV感染為主,表明臨床上送檢病料中混合感染較為普遍,所有臨床樣本經(jīng)單項(xiàng)PCR/RT-PCR方法驗(yàn)證,芯片檢測(cè)與PCR技術(shù)檢測(cè)的最低符合率為96.79%;應(yīng)用基因芯片對(duì)屠宰場(chǎng)采集的850份樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示屠宰場(chǎng)的病毒檢出率比臨床病料的檢出率低,未感染的占28.47%,單純感染占24.11%,其中屠宰場(chǎng)中CSFV、PCV2和PRRSV的檢出率較高,為7.53%、4.71%、4.12%,混合感染中這三種病毒的兩兩混合的檢出率較高,芯片與PCR技術(shù)的檢測(cè)總符合率均在96.79%以上,表明基因芯片適用于高通量檢測(cè)。

    本研究所建立的10種病毒基因芯片檢測(cè)試驗(yàn)方法,是建立在PCR/RT-PCR以及核酸特異性雜交的基礎(chǔ)上,暫時(shí)無法區(qū)分各個(gè)病毒強(qiáng)弱毒株,需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究[16]。但對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬而言,只要檢出病毒陽性,無論是野毒株還是疫苗株,均應(yīng)立即淘汰。希望本研究所建立的檢測(cè)方法,能夠成為實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制的有力工具。

    4 結(jié) 論

    建立了檢測(cè)豬常見10種疫病病毒的基因芯片檢測(cè)方法,雜交后熒光信號(hào)清晰、特異性好。芯片檢測(cè)與普通PCR的符合率高于96%。本方法最低可檢測(cè)到105copies的病毒,該方法的建立為實(shí)現(xiàn)多樣品、多病毒的高通量篩查檢測(cè)奠定了基礎(chǔ),對(duì)生豬檢疫和實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制均有裨益。

    致謝:此研究為國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目,特表感謝。同時(shí),衷心感謝山東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心給以場(chǎng)地、儀器上的支持,特別感謝中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的王晨女士在實(shí)驗(yàn)研究過程中的技術(shù)幫助,感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所陳豪泰博士提供豬口蹄疫滅活病毒。

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