尿石素C對膠質母細胞瘤生物學行為的調控作用及機制

劉翠蘭，李建軍，趙娣，李承龍，邱長云，劉松

膠質瘤是神經系統(tǒng)最常見的腫瘤，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的發(fā)病率最高，目前尚缺乏有效治療方法。GBM具有侵襲性強、患者生存期短、腫瘤異質性強、復發(fā)率高等特點［1-2］。在體內外GBM治療實驗中，部分植物及其提取物或活性成分，如精油、黃酮類化合物、多酚類、萜烯類和大麻素類顯示出了不同程度的抗腫瘤作用，可能有助于GBM的治療［3］。尿石素C（urolithin C，UC）是天然多酚類化合物，是食物中存在的鞣花單寧的腸道代謝產物之一。UC具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物活性，對心腦血管疾病、神經性病變及癌癥具有潛在的預防和治療效果，但是UC對GBM的作用鮮有報道［4］。本研究以GBM U251和U87 MG細胞為研究對象，探討了UC對GBM細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期的影響及其可能分子作用機制，以期為UC抗GBM的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 GBM細胞株U251和U87 MG購自中國科學院細胞庫；UC購自于MCE公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清及胰酶均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自MCE公司；8.0μm Transwell小室購自美國康寧公司；Matrigel基質膠、FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒和PI∕RNase染色液均購自美國BD公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF購自生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸酶抑制劑PhosSTOP購自德國Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）抗體購自美國abcam公司；兔抗p-AMPK抗體、兔抗細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）抗體、兔抗p-ERK抗體、兔抗絲裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）抗體、兔抗p-p38 MAPK抗體及鼠抗β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；羊抗鼠二抗IR Dye800 CW和羊抗兔二抗IR Dye680 LT均購自美國Li-COR公司。SpectraMax M5酶標儀購自美國Molecular Devices公司，IX53光學顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國BD公司，雙紅外激光成像系統(tǒng)購自美國Li-COR公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) U251和U87 MG細胞均采用含1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至融合度80%～90%時進行傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力 在96孔板中接種細胞懸液，每孔接種3000個細胞，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將U251和U87 MG細胞分為0、20、40、80、120和160μmol∕LUC處理組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時向每孔加入10μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內孵育1～4 h，用SpectraMax M5酶標儀測定在450 nm處的光密度（OD）值，并計算細胞的增殖率=（實驗組OD值-空白組OD值）∕（對照組OD值-空白組OD值）×100%。實驗重復3次。

1.2.3 細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 取對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化并吹打成單個細胞，接種于12孔板中，每孔接種500個細胞，置于培養(yǎng)箱內孵育24 h，根據(jù)U251和U87 MG細胞48 h的半抑制濃度（IC50），將細胞分為0、40、80和120μmol∕L UC處理組，分別孵育48 h后將培養(yǎng)基換成不含UC的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，加入甲醇固定20 min，PBS洗滌2遍，加入0.1%結晶紫溶液染色20 min，清水漂洗浮色，拍照并計算細胞克隆形成率=克隆數(shù)∕接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.2.4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)期U251和U87 MG細胞接種于6孔板，每孔接種5×105個細胞，培養(yǎng)過夜，用移液器吸頭垂直于板底畫“井”字劃痕，用PBS輕輕洗去劃下的細胞，更換新鮮的無血清培養(yǎng)基，加入0、40、80和120μmol∕L濃度的UC，將細胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在0、24和48 h時，顯微鏡下（×40）觀察并拍照，測量劃痕寬度，劃痕愈合百分比=（0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）∕0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 Matrigel基質膠置于4℃冰箱過夜，用冰預冷的PBS按照1∶8稀釋，取80μL基質膠稀釋液加入Transwell上室，于37℃培養(yǎng)箱放置2 h。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化并用無血清DMEM培養(yǎng)基將細胞含量調整至1×105個∕mL，取150μL細胞懸液加入Transwell上室，加入0、40、80和120μmol∕L的UC，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出小室用甲醇固定20 min，PBS洗滌后加入0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌浮色，顯微鏡（×100）下觀察拍照。每個小室隨機讀取3個視野統(tǒng)計侵襲細胞數(shù)量。侵襲細胞百分率=實驗組侵襲細胞數(shù)量∕對照組侵襲細胞數(shù)量×100%。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期 取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，加入0、40、80和120μmol∕L的UC處理24 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，冰預冷的PBS洗滌細胞3次，加入300μL的1×結合緩沖液（binding buffer）懸浮細胞，再加入5μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），避光孵育15 min，上機前5 min加入5μL的碘化丙啶（PI）染色，最后加入200μL的1×binding buffer，細胞充分懸浮后，上機檢測凋亡細胞比例。實驗重復3次。

取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，過夜培養(yǎng)后加入0、40、80和120μmol∕L的UC處理24 h，胰酶消化并收集細胞，冰預冷的PBS洗滌3遍，500μL的PBS懸浮細胞，加入3.5 mL冰預冷的70%乙醇，4℃固定過夜，1500 r∕min離心3 min，收集細胞，PBS洗滌細胞3次，最后加入500μL PI∕RNase染色液，避光染色15 min。細胞充分重懸后，流式細胞儀檢測細胞周期，Modfit LT 3.3軟件分析2種細胞中各周期細胞百分比。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測AMPK、ERK和p38 MAPK的蛋白表達及磷酸化水平 0、40、80和120μmol∕L的UC處理細胞24 h，各組細胞用RIPA（強）裂解液冰上裂解，4℃離心收集蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液100℃變性10 min，蛋白質樣品用12%的SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，轉膜完成后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗滌后分別孵育一抗過夜。AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK（稀釋比例均為1∶1000），β-actin（1∶2000）。一抗孵育完成后TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，經雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并識別灰度進行分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UC對GBM細胞增殖率和克隆形成率影響 與0μmol∕L組比較，U251細胞中不同濃度UC組增殖率于48 h開始降低，而U87 MG細胞中40μmol∕L及以上濃度組于48 h時增殖率開始降低（P＜0.05）。隨時間延長，不同濃度UC組U251和U87 MG細胞增殖率的抑制作用增強（P＜0.05），見表1。48 h時，UC對U251和U87 MG細胞的IC50分別為20.69和52.76μmol∕L。選擇0、40、80和120μmol∕L的UC濃度進行后續(xù)實驗。與0μmol∕L組比較，40、80和120μmol∕L組U251和U87 MG細胞的克隆形成率均降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖1、表2。

2.2 UC對GBM細胞遷移和侵襲能力的影響 與0μmol∕L組比較，40、80和120μmol∕L組均可抑制GBM U251和U87 MG細胞24 h和48 h時的遷移能力和24 h時的細胞侵襲能力，且均呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖2、3和表3、4。

2.3 UC對GBM細胞凋亡及細胞周期的影響 與0μmol∕L組比較，120μmol∕L組的U251細胞凋亡率升高，80和120μmol∕L組的U87 MG細胞凋亡率均升高（P＜0.05），見表5、圖4。與0μmol∕L組比較，40、80和120μmol∕L組U251和U87 MG細胞S期細胞百分比均升高（P＜0.01），見圖5、表6。

Tab.1 Comparison of the proliferation rate of U251 and U87 MG cells between the six groups表1各組U251和U87 MG細胞增殖率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of the proliferation rate of U251 and U87 MG cells between the six groups表1各組U251和U87 MG細胞增殖率比較（n=3，%，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01；a與0μmol∕L組比較，b與20μmol∕L組比較，c與40μmol∕L組比較，d與80μmol∕L組比較，P＜0.05

組別0μmol∕L組20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組160μmol∕L組F U251細胞增殖率24 h 100.00±1.7488.36±2.2777.02±0.35a 66.07±3.69ab 59.39±2.98abc 49.13±6.94abc 27.100**48 h 100.00±1.9260.77±2.39a 43.85±1.33ab 36.24±1.36abc 31.63±0.35abc 28.78±1.04abcd 306.900**72 h 100.00±1.2353.01±3.81a 31.49±2.20ab 23.38±0.69ab 19.12±0.66abc 15.71±0.31abc 281.800**F-40.790**247.600**90.040**135.000**17.240**組別0μmol∕L組20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組160μmol∕L組F U87 MG細胞增殖率24 h 100.00±1.4399.23±1.6791.29±8.2466.25±0.58abc 59.14±1.88abc 50.26±0.30abc 37.140**48 h 100.00±2.5794.42±3.2673.61±3.11ab 39.29±1.75abc 30.67±0.74abc 24.50±1.55abcd 201.200**72 h 100.00±2.56101.20±2.4972.57±4.35ab 32.02±0.57abc 17.51±0.42abcd 12.90±0.18abcd 304.500**F-1.8403.440261.600**317.500**437.900**

Fig.1 Effects of UC on the clone formation ability of U251 and U87 MG cells(crystal violet dyeing)圖1 UC對U251和U87 MG細胞克隆形成能力的影響（結晶紫染色）

Tab.2 Clone formation rate of U251 and U87 MG cells in the four groups表2 各組U251和U87 MG細胞克隆形成率（n=3，%，±s）

Tab.2 Clone formation rate of U251 and U87 MG cells in the four groups表2 各組U251和U87 MG細胞克隆形成率（n=3，%，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01；a與0μmol∕L組比較，b與40μmol∕L組比較，c與80μmol∕L組比較，P＜0.05；表3～7同

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U25136.53±0.5228.20±0.53a 20.80±0.42ab 7.20±0.42abc 689.900**U87 MG 7.13±0.184.20±0.20a 2.80±0.23ab 1.40±0.16abc 174.200**

Fig.2 Migration ability of U251 and U87 MG cells detected by Wound healing assay(×40)圖2 劃痕愈合實驗檢測U251和U87 MG細胞的遷移能力（×40）

Fig.3 Invasion ability of U251 and U87 MG cells detected by Wound healing assay(crystal violet dyeing,×100)圖3 劃痕愈合實驗檢測U251和U87 MG細胞的侵襲能力（結晶紫，×100）

Tab.3 Wound closure rates of U251 and U87 MG cells in the four groups表3 各組U251和U87 MG細胞劃痕愈合率（n=3，%，±s）

Tab.3 Wound closure rates of U251 and U87 MG cells in the four groups表3 各組U251和U87 MG細胞劃痕愈合率（n=3，%，±s）

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U251劃痕愈合率24 h 30.59±0.3819.73±0.36a 10.76±0.44ab 4.49±0.26abc 962.500**48 h 52.14±0.8334.26±0.75a 14.30±0.35ab 9.83±0.47abc 957.800**U87 MG劃痕愈合率24 h 30.49±0.8413.42±0.57a 6.77±0.18ab 3.10±0.24abc 529.700**48 h 62.37±0.7531.78±0.64a 15.13±0.25ab 6.55±0.26abc 2201.000**

Tab.4 Relative invasion rate of U251 and U87 MG cells in the four groups表4 各組U251和U87 MG細胞相對侵襲率（n=3，%，±s）

Tab.4 Relative invasion rate of U251 and U87 MG cells in the four groups表4 各組U251和U87 MG細胞相對侵襲率（n=3，%，±s）

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U251100.00±2.3555.67±3.11a 37.39±1.32ab 15.23±0.88abc 293.100**U87 MG 100.00±1.7566.93±2.03a 24.21±1.19ab 11.91±1.16abc 655.400**

Tab.5 Apoptosis rates of U251 and U87 MG cells in the four groups表5 各組U251和U87 MG細胞凋亡率（n=3，%，±s）

Tab.5 Apoptosis rates of U251 and U87 MG cells in the four groups表5 各組U251和U87 MG細胞凋亡率（n=3，%，±s）

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U2519.26±0.6410.69±0.2012.32±0.65217.79±1.04abc 28.590**U87 MG 10.55±0.6811.54±0.5215.72±1.23ab 21.50±0.81abc 34.170**

2.4 UC對GBM細胞AMPK∕ERK∕p38 MAPK信號通路的影響 與0μmol∕L組比較，40、80和120μmol∕L組U251和U87 MG細胞中p-AMPK和p-p38 MAPK水平均升高，80和120μmol∕L組U251細胞中p-ERK水平升高，但僅120μmol∕L組U87 MG細胞p-ERK水平升高（P＜0.05），見圖6、表7。

3 討論

Fig.4 Apoptosis rates of U251 and U87 MG cells detected by flow cytometry圖4 流式細胞術檢測U251和U87 MG細胞的凋亡率

Fig.5 The cell cycle of U251 and U87 MG cells detected by flow cytometry圖5 流式細胞術檢測U251和U87 MG細胞的細胞周期

Tab.6 The percentage of different cell cycles of U251 and U87 MG cells in the four groups表6 各組U251和U87 MG細胞各周期細胞百分比 （n=3，%，±s）

Tab.6 The percentage of different cell cycles of U251 and U87 MG cells in the four groups表6 各組U251和U87 MG細胞各周期細胞百分比 （n=3，%，±s）

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U251各周期細胞百分比G0∕G163.03±0.4851.88±0.53a 43.27±0.45ab 64.19±0.27bc 502.500**S S 20.14±0.6327.72±0.57a 47.65±0.59ab 23.83±0.56abc 436.100**G2∕M 16.83±0.1820.41±0.09a 9.08±1.03ab 11.98±0.37abc 81.680**U87 MG各周期細胞百分比G0∕G166.86±0.7646.04±0.40a 50.55±0.86ab 61.78±0.73abc 185.900**22.02±0.5138.25±0.54a 37.55±0.52a 35.75±0.47ab 224.000**G2∕M 11.12±0.6315.71±0.69a 11.90±0.81b 2.46±0.31abc 76.870**

目前，GBM最主要的治療方法是手術切除配合放化療，患者的中位生存期僅為15個月［5］。因此，目前的臨床治療方法還不足以有效地治療GBM，需要尋找新的替代療法，包括天然化合物。鞣花酸是廣泛存在于水果和堅果中的天然多酚組分，其腸道代謝產物包括尿石素A（UA）、尿石素B（UB）、UC和尿石素（UD），具有抗氧化［6］、抗炎［7］、神經保護［8］及抗癌［9］作用。尿石素可以通過血腦屏障到達腦部病灶［10-11］。GBM不同細胞系對藥物的敏感度不同，本研究以U251和U87 MG細胞系作為研究對象，結果顯示，20～160μmol∕L的UC可以抑制U251細胞的增殖，20μmol∕L的UC對U87 MG細胞增殖的抑制作用較弱；48 h時，UC對U251和U87 MG細胞的IC50分別為20.69和52.76μmol∕L，表明UC對U251細胞增殖的抑制作用比對U87 MG細胞的抑制作用強，考慮原因可能是U87 MG比U251惡性程度更高且對UC的敏感度低所致?？寺⌒纬蓪嶒炓彩菧y定細胞增殖能力的有效方法之一，本研究顯示UC可明顯抑制U251和U87 MG細胞的克隆形成率，進一步驗證了UC對細胞增殖能力的抑制作用。因此，筆者認為UC具有良好的抗GBM活性。

Fig.6 The protein expression level detected by Western blot assay圖6 各組U251和U87 MG細胞蛋白表達水平Western blot檢測結果

Tab.7 Expression levels of AMPK,ERK and p38 MAPK of U251 and U87 MG cells in the four groups表7各組U251和U87 MG細胞AMPK、ERK、p38 MAPK蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.7 Expression levels of AMPK,ERK and p38 MAPK of U251 and U87 MG cells in the four groups表7各組U251和U87 MG細胞AMPK、ERK、p38 MAPK蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U251 p-AMPK 1.00±0.041.59±0.05a 4.09±0.07ab 4.20±0.05ab 892.000**p-ERK 1.00±0.021.03±0.011.20±0.01ab 1.23±0.01ab 61.680**p-p38 MAPK 1.00±0.041.23±0.02a 1.39±0.02ab 1.37±0.02ab 48.120**組別0μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組120μmol∕L組F U87 MG p-AMPK 1.00±0.112.22±0.06a 3.89±0.27ab 4.14±0.20ab 67.250**p-ERK 1.00±0.060.94±0.021.14±0.061.51±0.04abc 27.660**p-p38 MAPK 1.00±0.071.42±0.05a 1.67±0.05ab 2.04±0.05abc 65.940**

GBM是侵襲性最強的原發(fā)腦腫瘤，其侵襲能力阻礙了膠質瘤的治療。研究表明，UA可抑制胰腺癌細胞的遷移［12］，亦可通過細胞自噬死亡抑制結直腸癌細胞的轉移［13］。本研究結果顯示，40、80和120μmol∕L的UC均可明顯抑制GBM的遷移和侵襲能力，表明UC具有抑制膠質瘤細胞轉移的能力。

細胞凋亡和細胞周期阻滯是細胞生長抑制的2個主要原因。研究顯示，UA可誘導結直腸癌細胞凋亡 及G2∕M期 細 胞 周 期 阻 滯［14］，誘 導 前 列 腺 癌caspase依賴性細胞凋亡［15-16］，誘導子宮內膜癌細胞G2∕M期細胞周期阻滯［17］。UB可通過誘導細胞凋亡及G0∕G1期細胞周期阻滯而抑制肝細胞癌的增殖［9］。UC可誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12的凋亡及S期細胞周期阻滯［18］。本研究結果顯示，與0μmol∕L組比較，40、80、120μmol∕L UC可誘導S期細胞周期阻滯。UC對細胞周期的阻滯作用與UA和UB不同，可能緣于三者作用的細胞周期相關信號通路不同。低濃度的UC對細胞S期的阻滯作用更顯著，40μmol∕L的UC促進GBM細胞由G0∕G1期進入S期，對S期向G2∕M期過度的影響較小。隨著UC濃度的升高，UC對GBM細胞G0∕G1期到S期的進程影響減小，對S期向G2∕M期過度的抑制作用增強。UC可同時靶向多條信號通路，濃度不同時，其影響的通路的功能不同，導致兩細胞系在不同濃度下細胞周期變化不同。以上結果表明UC可能通過誘導凋亡和阻滯細胞周期而抑制細胞增殖。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號是腫瘤生物學中最明確的信號通路之一，ERK和p38 MAPK均是MAPK信號通路成員，MAPK信號通路可以抑制AMPK表達以促進癌變，AMPK也可通過磷酸化MAPK可逆地調控MAPK信號，影響癌癥發(fā)生和發(fā)展［19］。AMPK∕ERK信號通路參與調控細胞的增殖、遷移和凋亡等功能［20-22］。UA和UB可通過增強AMPK的磷酸化水平，降低ERK和p38 MAPK磷酸化水平來發(fā)揮抗炎和抗氧化作用［6,23］。UC可促進葡萄糖誘導的ERK激活［24］。本研究結果顯示，40、80和120μmol∕L UC組AMPK和p38 MAPK蛋白的磷酸化水平升高，推測UC可能通過激活AMPK和p38 MAPK以調控GBM細胞的生物學行為。另外，UC在較高濃度（80或120μmol∕L）時，GBM細胞中ERK磷酸化水平升高，筆者結合細胞凋亡結果推測，ERK信號通路的激活需要較高濃度的UC，進而誘導腫瘤細胞凋亡。因此，筆者認為，UC可能通過提高AMPK、ERK和p38 MAPK磷酸化水平而發(fā)揮抗膠質瘤作用。

綜上所述，一定濃度的UC可通過激活AMPK∕ERK∕p38 MAPK信號通路而抑制GBM細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時誘導腫瘤細胞的凋亡和細胞周期阻滯而發(fā)揮抗癌作用。