膿腫分枝桿菌復合群藥敏試驗及耐藥機制研究進展

郭明日，朱彧，孫海柏

近年來，由非結核分枝桿菌（non-tuberculosis mycobacterium，NTM）感染所引起的NTM病呈增加趨勢［1-2］。膿腫分枝桿菌復合群（Mycobacterium abscessuscomplex，MABC）是最常見的NTM菌種。MABC對絕大多數(shù)抗結核藥物及大部分普通抗生素均有耐藥性，治療MABC感染所致的NTM病非常困難［3］。目前，臨床用于治療MABC感染的藥物以克拉霉素為代表的大環(huán)內酯類抗生素為主，阿米卡星、頭孢西丁、亞胺培南及喹諾酮類等抗生素效果有限。另外，MABC不同亞種對克拉霉素等藥物治療反應存在異質性，精準的MABC亞種鑒定對確定聯(lián)合用藥方案具有重要參考價值［4-5］。然而，目前國內上市的商品化試劑盒僅能鑒定到MABC，僅有少數(shù)實驗室可鑒定MABC亞種?，F(xiàn)就MABC的體外藥敏試驗及目前用于治療MABC感染所致NTM病主要藥物耐藥機制的研究進展進行綜述，以期為相關研究提供參考。

1 MABC的亞種分型

NTM分為快速生長型和緩慢生長型。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d肉眼可見菌落的為快速生長型，需要7 d以上才可見菌落的為緩慢生長型［1］。MABC是最常見的快速生長型NTM，在快速生長型NTM肺病中分離率為65%～80%，占第1位［3］。MABC主要引起皮膚、軟組織及肺部的感染，人體所有器官均可受累［4，6］。同源基因序列差異鑒定是菌種鑒定的“金標準”。目前，NTM菌種鑒定最常用的同源序列包括16 S rRNA（small subunit ribosomal RNA，rrs）、16 S-23 S rRNA基因間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、RNA聚 合 酶 的 亞 基B（RNA polymerase subunit，rpoB）、熱休克蛋白65（hot shock protein 65，hsp65）和紅霉素核糖體甲基化酶（41）［erythromycin ribosome methyltransferase，erm（41）］［7］。聯(lián)合使用上述5個同源序列進行MABC鑒定可將其分為膿腫亞種（M.abscessussubsp.abscessus）、馬賽亞種（M.abscessussubsp.massiliense）和bolletii亞 種（M.abscessussubsp.bolletii）［6］。MABC的亞種分型經(jīng)歷了3次改變：2006年首次將其分為膿腫分枝桿菌（M.abscessus）、馬賽分枝桿菌（M.massiliense）和bolletii分枝桿菌（M.bolletii）；2011年合并為MABC膿腫亞種和MABCbolletii亞種；2013年重新將其分類為膿腫亞種、馬賽亞種和bolletii亞種［6］。2015年美國胸科協(xié)會最終建議將MABC分為膿腫亞種、馬賽亞種和bolletii亞種［8］。

2 MABC的體外藥敏試驗

《臨床微生物手冊（第12版）》、美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的分枝桿菌藥敏試驗標準（2018版）推薦微量肉湯稀釋法用于快速生長型NTM的藥敏試驗，快速生長型NTM需測試藥物包括阿米卡星、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、克拉霉素、多西環(huán)素（或米諾環(huán)素）、亞胺培南、利奈唑胺、莫西沙星、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑和妥布霉素［9-10］。MABC屬于快速生長型NTM中最常見的菌種，需進行上述除妥布霉素之外其他藥物的藥敏試驗［10］。CLSI標準規(guī)程推薦使用陽離子調節(jié)后的MH肉湯（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB）培養(yǎng)基進行快速生長型NTM（包括MABC）的藥敏試驗，判讀標準見表1；質控菌株及其最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）值參考范圍，見表2［10］。

Tab.1 Criteria for drug sensitivity test of fast growing mycobacterium by broth microdilution method表1 快速生長型分枝桿菌微量肉湯稀釋法藥敏試驗判斷標準

我國《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南（2020年版）》指出，大環(huán)內酯類和阿米卡星耐藥與MABC肺病治療失敗有關，頭孢西丁、阿米卡星、復方新諾明等耐藥與肺外MABC病治療失敗有關［1］。因此，對于實驗室鑒定為MABC的NTM病患者進行上述8～10種藥敏試驗極為重要，其中克拉霉素、阿米卡星和頭孢西丁體外抗菌活性最高［10-11］。MABC藥敏試驗時，為了適合MABC的生長，MH肉湯培養(yǎng)基需采用Ca2+和Mg2+進行調節(jié)，藥物濃度采取倍比稀釋，接種細菌數(shù)量通常建議為1×104～5×104CFU∕孔，接種體積為0.1 mL∕孔，在28～30℃環(huán)境下培養(yǎng)72 h后開始觀察其生長情況。當藥敏板對照孔中質控菌株生長至出現(xiàn)明顯混濁或塊狀菌落、實驗孔出現(xiàn)渾濁或孔底有細菌沉積時，開始記錄其藥物MIC值，否則需繼續(xù)培養(yǎng)直至第5天；但若第5天時對照孔細菌生長仍不明顯則需重新進行試驗。所測試藥物中除克拉霉素外，讀取MIC值時間不能超過5 d［10］。

3 MABC對常用抗生素的耐藥機制

3.1 大環(huán)內酯類藥物 目前，臨床上用于治療MABC感染的大環(huán)內酯類藥物主要是14元環(huán)大環(huán)內酯類的克拉霉素和15元環(huán)大環(huán)內酯類的阿奇霉素，2種藥物均通過不可逆地結合到細菌核糖體50 S大亞基上，抑制蛋白質的合成而發(fā)揮抑菌作用［12］?？死顾乜筂ABC的MIC為0.25～64.00 mg∕L，阿奇霉素為0.125～128.000 mg∕L。23 S rRNA（large subunit ribosomal RNA，rrl）為細菌核糖體50 S大亞基成分，rrl基因突變與MABC對克拉霉素的獲得性耐藥有關，rrl基因2058位和2059位的A堿基突變可導致克拉霉素與核糖體的結合位點發(fā)生改變，從而產(chǎn)生耐藥［13］。此外，Vester等［14］研究認為，rrl基因的2057位、2611位的A堿基點突變與MABC對克拉霉素的中低水平耐藥有關。然而，Luo等［4］研究發(fā)現(xiàn)，一株MABC膿腫亞種中rrl基因2057位點突變，但對克拉霉素產(chǎn)生了高水平耐藥，MIC＞256 mg∕L。因此，關于rrl基因突變位點與克拉霉素的耐藥水平的關系仍不明確。

Tab.2 Reference ranges of MIC value of quality control strains in drug sensitivity test of fast growing mycobacterium表2 快速生長型分枝桿菌藥敏試驗質控菌株MIC值參考范圍 （mg∕L）

研究發(fā)現(xiàn)，erm（41）與MABC對大環(huán)內酯類抗生素的誘導性耐藥有關［15］。MABC膿腫亞種和bolletii亞種的erm（41）基因序列第28位堿基存在多態(tài)性，多態(tài)性包括T28序列型和C28序列型，只有T28序列型與克拉霉素誘導性耐藥有關，erm（41）的C28序列型則與克拉霉素敏感有關［15］。馬賽亞種的erm（41）基因由于存在64位點、65位點和276 bp片段的缺失，erm（41）基因不能正常發(fā)揮作用，其對大環(huán)內酯類抗生素無誘導性耐藥現(xiàn)象［15］。Yoshida等［16］對55例MABC患者的分析發(fā)現(xiàn)，患者中攜帶膿腫亞種28例，其中T28序列型25例（89.2%）、C28序列型3例（10.8%）；馬賽亞種25例，全部為T28序列型；bolletii亞種2例，全部為T28序列型；該研究結果顯示，51株菌在第3天時對克拉霉素敏感，全部菌株培養(yǎng)至14 d時，膿腫亞種的25株T28序列型發(fā)生耐藥，而3株C28序列型的膿腫亞種及25株馬賽亞種均未對克拉霉發(fā)生耐藥現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，whiB7轉錄因子在MABC對克拉霉素的erm（41）相關誘導性耐藥中發(fā)揮關鍵調控作用，whiB7可正向調控erm（41）表達，敲除whiB7可使MABC對克拉霉素由耐藥轉為敏感［17］。因此，whiB7有望成為MABC的一個潛在靶標用于新藥設計。

3.2 氨基糖苷類藥物 臨床上氨基糖苷類抗生素主要用于需氧革蘭陰性桿菌所致全身感染的治療，其中阿米卡星是治療NTM病常用且有效的藥物。阿米卡星通過抑制NTM蛋白質的合成而產(chǎn)生殺菌作用。阿米卡星抗MABC的MIC為8～16 mg∕L，MABC的16 S rRNA基因位點突變T1406A、A1408G、C1409T及G1491T與MABC對阿米卡星耐藥有關［11］。此外，whiB7過表達可使核糖體蛋白S12基因（ribosomal protein S12，rpsL）、阿米卡星耐藥相關N-乙酰轉移酶2基因（amikacin resistance N-acetyltransferase，eis2）及多藥外排轉運體基因（multidrug-efflux transporter，tap）表達增加，從而引起MABC對阿米卡星產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象［2］。

MABC所致NTM病的治療用藥不規(guī)范也是導致耐藥的重要原因。采用亞抑菌濃度的阿米卡星作用于MABC后，MABC菌落形態(tài)由光滑型轉為粗糙型，聚集性和黏附性增加，抵抗巨噬細胞吞噬能力增強，被吞噬入巨噬細胞的MABC生存及增殖能力增強，巨噬細胞釋放炎性細胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）能力增強，從而加劇了炎癥反應［18］。該研究提示，臨床在治療MABC感染時，需使用足夠劑量的氨基糖苷類抗生素。

3.3 喹諾酮類藥物 喹諾酮類藥物按照研發(fā)先后順序及抗菌性能分為4代，其中第1、2代因療效差和不良反應較多，臨床上已很少用。目前，臨床上應用于NTM病治療的喹諾酮類藥物主要是第3代的環(huán)丙沙星和第4代的莫西沙星，2種藥可抑制細菌DNA旋轉酶A亞單位而阻止DNA復制、轉錄，從而產(chǎn)生殺菌效果。環(huán)丙沙星和莫西沙星對鳥-胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等緩慢生長型NTM作用較強，而對快速生長型NTM如MABC抗菌活性較弱，抗MABC的MIC為0.06～32.00 mg∕L［1］。對大環(huán)內酯類如克拉霉素耐藥的MABC肺病患者推薦使用喹諾酮類藥物，如莫西沙星［19］。研究表明，編碼DNA旋轉酶A亞單位（DNA gyrase subunit A，gyrA）和B亞單位（DNA gyrase subunit B，gyrB）基因突變，以及拓撲異構酶Ⅳ的A亞單位編碼基因parC和B亞單位編碼基因parE發(fā)生突變?yōu)榧毦鷮︵Z酮類藥物產(chǎn)生耐藥的主要機制，其中gyrA和parC的喹諾酮耐藥決定區(qū)域（QRDR）突變可導致喹諾酮類藥物作用靶點改變而不能發(fā)揮殺菌作用；gyrA亞單位第90、96位氨基酸和gyrB亞單位第492位氨基酸發(fā)生突變參與了MABC對環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物的耐藥［20］。然而，另一項研究顯示，膿腫分枝桿菌gyrA和gyrB基因的突變形式與左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥沒有明確的相關性，僅4%對喹諾酮耐藥的膿腫亞種分離株和5%的馬賽亞種分離株存在gyrA和gyrB基因突變［21］。因此，MABC及其他NTM對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制仍不明確。

3.4 四環(huán)素類藥物 四環(huán)素類藥物主要有天然類和半合成類，其中天然類四環(huán)素類藥物基本已淘汰，半合成類的四環(huán)素類藥物如米諾環(huán)素和多西環(huán)素（又名強力霉素）對MABC有較強的抗菌活性。其通過與細菌核糖體30 S小亞基結合，阻止氨基酰-轉運RNA（transfer RNA，tRNA）與小亞基結合，從而阻斷蛋白質合成。既往臨床常用的四環(huán)素類藥物之一替加環(huán)素對MABC有較強的抗菌活性，MIC為≤0.5～4.0 mg∕L，但 多 數(shù)MABC對 多 西 環(huán) 素 耐 藥［22-23］。MABC對多西環(huán)素的耐藥是由于MABC單加氧酶（MabTetX）滅活了多西環(huán)素，但替加環(huán)素不是MabTetX作用的底物。研究顯示，脫水四環(huán)素（anhydrotetracycline，ATc）可潛在抑制MabTetX，從而降低多西環(huán)素對MABC的MIC值［24］。因此，設計可抑制MabTetX活性的化合物可降低MABC對多西環(huán)素的耐藥性。盡管替加環(huán)素體外對MABC有較強的抗菌活性，但使用替加環(huán)素者經(jīng)常會出現(xiàn)惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道不良反應，甚至多器官功能衰竭［24］。最近，新發(fā)現(xiàn)了2個四環(huán)素類似物奧瑪達環(huán)素（omadacycline）和艾拉環(huán)素（eravacycline），前者對MABC標準株ATCC19977的MIC值近似于替加環(huán)素，為1 mg∕L，艾拉環(huán)素MIC值為0.5 mg∕L［22］。相較替加環(huán)素，奧瑪達環(huán)素和艾拉環(huán)素致惡心嘔吐等胃腸道不良反應明顯減少［25］。因此，這2個四環(huán)素新類似物有望更多地應用于MABC肺病的治療中。

3.5 β內酰胺類藥物 目前，用于MABC病治療的β內酰胺類藥物主要為亞胺培南-西司他丁復方制劑、頭孢西丁等，其作用機制為與多種青霉素結合蛋白（penicillin binding protein，PBP）結合，抑制細菌細胞壁合成，導致細菌死亡。β內酰胺類藥物耐藥主要通過產(chǎn)生β內酰胺酶、PBP的改變和細胞外膜通透性改變這3種機制發(fā)生［12］。MABC對亞胺培南的耐藥問題值得廣泛重視。部分研究顯示，亞胺培南耐藥率超過了60%［26-27］。亞胺培南和β內酰胺酶抑制劑聯(lián)合用藥可降低其耐藥率。新近發(fā)現(xiàn)了一種新的β內酰胺酶抑制劑—N，N，N'，N'-四（2-吡啶甲基）乙二胺［N，N，N'，N'-tetrakis（2-pyridylmethyl）ethane-1，2-diamine，TPEN］，其與亞胺培南的聯(lián)合抑菌試驗顯示，100%的亞胺培南耐藥菌株和79.2%的中介菌株轉為對亞胺培南敏感，亞胺培南的50%最低抑菌濃度（50% minimun inhibitory concentration，MIC50）由16 mg∕L降 至4 mg∕L，90%最 低 抑 菌 濃度（90% minimun inhibitory concentration，MIC90）由64 mg∕L降至8 mg∕L［26］。此外，亞胺培南對MABC的MIC值即使超過了CLSI所規(guī)定的敏感∕中介臨界值，并不意味著其不能用于臨床，因為亞胺培南聯(lián)合β內酰胺酶抑制劑可提高其療效，且亞胺培南與阿米卡星、阿維巴坦（avibactam）、利福布丁等藥聯(lián)合應用時具有協(xié)同或相加抗菌效應［28］。因此，亞胺培南體外藥敏試驗耐藥并不影響其在MABC感染治療中應用。

此外，某些β內酰胺類藥物之間對MABC也具有協(xié)同抑菌作用。體外實驗顯示，頭孢他啶與頭孢洛林或亞胺培南聯(lián)用后，頭孢洛林抗MABC的MIC90和MIC50分別為32和16 mg∕L，亞胺培南抗MABC的MIC90和MIC50分別為8和2 mg∕L，頭孢洛林聯(lián)用頭孢他啶后MIC90和MIC50降為1和0.25 mg∕L，亞胺培南聯(lián)用頭孢他啶后MIC90和MIC50降為2和0.5 mg∕L，說明頭孢他啶與頭孢洛林或亞胺培南聯(lián)用具有較好的對MABC的協(xié)同抑菌效應［29］。因此，β內酰胺類藥物在MABC病治療中具有重要價值。

3.6 MABC病其他治療藥物及其耐藥機制 利福布丁是由利福霉素-S衍生而來的半合成抗生素，其不僅可與其他抗結核藥物聯(lián)合用于治療各型結核病，也可用于NTM病的治療。利福布丁對MABC 3個亞種的殺菌試驗顯示，MIC90介于3～5 mg∕L，而90%最低殺菌濃度（90% minimum bactericidal concentration，MBC90）約為MIC90的2倍，其殺菌活性接近甚至優(yōu)于克拉霉素，且MABC未發(fā)生誘導性耐藥現(xiàn)象，提示利福布丁可作為潛在的MABC抗菌藥物［30］。另外的幾項研究也證實，利福布丁在體內和體外實驗中對MABC均具有較好的抗菌活性，對MABC的粗糙型菌落較光滑型菌落具有更好的抗菌活性，且對于克拉霉素耐藥的MABC菌株仍然有效［31-33］。此外，利福布丁與克拉霉素、替加環(huán)素具有協(xié)同抑菌作用，三者同時使用可使利福布丁的MIC值下降近80%，克拉霉素和替加環(huán)素的MIC值也有40%～80%的下降，提示在MABC病治療時需充分考慮不同藥物的協(xié)同作用，使其能達到最佳治療效果［33］。利福布丁和克拉霉素體外協(xié)同抑菌試驗研究顯示，利福布丁可通過抑制whiB7和erm（41）基因的表達，從而抑制MABC對克拉霉素的誘導性耐藥［34］。因此，利福布丁與克拉霉素聯(lián)用有可能將克拉霉素耐藥株轉為敏感株，不過體內是否也具有同樣的效果尚需進行相關研究。

目前，貝達喹啉主要用于耐多藥肺結核的治療，對非增殖期的結核分枝桿菌具有殺菌作用，臨床應用可縮短化療療程［35］。最近有研究顯示，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）環(huán)境中放置MABC 14 d可使MABC處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)，從而模擬出MABC的非增殖期狀態(tài)；采用MABC在CAMHB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式可模擬出MABC的增殖期狀態(tài)［36］。在MABC非增殖期和增殖期不同狀態(tài)下，貝達喹啉和利福布丁各自單獨使用時，貝達喹啉僅對非增殖期MABC具有殺菌活性，利福布丁僅對增殖期的MABC具有殺菌活性，但當兩者聯(lián)合使用時，對非增殖期和增殖期的MABC均具有殺菌活性。此外，阿米卡星、貝達喹啉與利福布丁三藥聯(lián)用時可進一步增強貝達喹啉和利福布丁兩藥聯(lián)用時對非增殖期MABC的殺菌活性［36］。TetR是一個在多種細菌中普遍存在的轉錄調節(jié)因子家族，TetR家族的轉錄調節(jié)因子MAB_2299c參與調控了2個外排泵蛋白（Mycobacterial membrane protein，Mmp）的mmpS和mmpL基因表達，進而參與了MABC對氯法齊明和貝達喹啉的交叉耐藥，敲除mmpS和mmpL基因后MABC對2種藥物的敏感性提高［37］。另一項研究也顯示，采用細菌膜外排泵抑制劑維拉帕米（verapamil）和利血平（reserpine）可分別使100%和54.8%的MABC分離株對貝達喹啉的敏感性提高，認為維拉帕米和利血平對貝達喹啉治療MABC感染可能具有輔助價值［38］。

4 結語

目前，MABC是已知快速生長型NTM中對多種藥物耐藥率最高的菌種，隨著近些年對MABC亞種分型重要性的認識及同源序列測序用于亞種鑒定技術的成熟，未來針對MABC不同亞種的精準診療勢在必行。目前，NTM的藥敏試驗尚未在國內多數(shù)實驗室開展，專門針對快速生長型NTM開展的藥敏試驗更是鮮見，這也加劇了MABC病治療的難度。按照CLSI藥敏試驗標準及我國NTM病診斷和治療指南（2020版）進行MABC藥敏試驗，對疾病的治療具有重要價值。MABC的多種藥物聯(lián)合藥敏試驗結果顯示多種藥物聯(lián)合使用具有較好的協(xié)同抑菌作用，但在臨床實際使用效果尚不明確。隨著一些耐藥結核病治療的藥物及新開發(fā)的一些抗生素應用于MABC病的治療，有必要進一步闡明MABC對多種藥物的耐藥機制，為MABC感染所致NTM病的治療、預防和藥物的研發(fā)提供幫助。