血清Runx2 mRNA表達(dá)與尿毒癥患者動(dòng)脈血管鈣化的關(guān)系研究

胡春燕，劉蘭，張東雪，張園，朱榮芳

目前，慢性腎臟病的發(fā)病率與病死率呈逐年上升趨勢(shì)［1］，而尿毒癥是終末期慢性腎臟病。血管鈣化是尿毒癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［［2-3］。因此，尋找尿毒癥患者動(dòng)脈血管鈣化的危險(xiǎn)因素及評(píng)估預(yù)測(cè)方法十分必要。血管鈣化類似于骨的形成，是由于外源性刺激使血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化［4］。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）是轉(zhuǎn)錄因子Runt家族成員之一。越來(lái)越多的研究顯示Runx2與血管鈣化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在血管鈣化過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用［5-6］。但是，目前尚不確定血清Runx2基因表達(dá)水平是否對(duì)尿毒癥患者動(dòng)脈血管鈣化有診斷預(yù)測(cè)價(jià)值，因此本研究嘗試探討血清Runx2基因表達(dá)在評(píng)估尿毒癥患者血管鈣化中的作用，旨在為血管鈣化相關(guān)疾病的診斷及預(yù)測(cè)提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年1月—2021年2月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺成形術(shù)及自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺切除重造術(shù)的尿毒癥患者78例為研究對(duì)象，其中男47例，女31例，平均年齡（55.13±12.08）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18歲。（2）透析時(shí)間≥8 h∕周且透析齡≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有心臟病、腦卒中、多結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡者。（2）合并急性感染、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者。（3）合并嚴(yán)重肝功能不全、消化及呼吸功能不全者。（4）應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素以及抗癲癇藥物者。（5）臨床資料不全者。根據(jù)硝酸銀染色結(jié)果進(jìn)行鈣化評(píng)分，并將患者分為鈣化組（n=23）和未鈣化組（n=55）。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 PCR引物（中實(shí)同創(chuàng)有限公司，中國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（廣州易錦生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、Runx2抗體（Abcam公司，英國(guó)）、二抗（羅氏，瑞士）。全自動(dòng)免疫組化儀、化學(xué)發(fā)光儀（羅氏，瑞士），高速冷凍離心機(jī)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo，美國(guó)），分光光度計(jì)（EMCLAB公司，德國(guó)），全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫(kù)爾特，美國(guó)）。

1.3 研究方法

1.3.1 資料收集 收集患者的一般資料：性別、年齡、透析齡、血壓、心率、原發(fā)病。患者行動(dòng)靜脈內(nèi)瘺手術(shù)前1 d，抽取清晨空腹8 h的肘正中靜脈血2～4 mL，送本院檢驗(yàn)中心檢測(cè)，包括：血紅蛋白（Hb，庫(kù)爾特原理）、透析前血肌酐（Scr，酶法）、葡萄糖（己糖激酶法）、血鈣（偶氮胂Ⅲ法）、血磷（磷鉬酸紫外終點(diǎn)法）、血鈉（電極法）、全段甲狀旁腺素（iPTH，電化學(xué)發(fā)光法）、白蛋白（溴甲酚綠法）、三酰甘油（酶法）、總膽固醇（酶法）。

在行自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺成形術(shù)及自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺切除重造術(shù)時(shí)收集患者動(dòng)脈血管，要求在保證患者手術(shù)成功的前提下，取動(dòng)脈血管切口部位全層動(dòng)脈血管，盡快放入10%福爾馬林固定24 h，之后進(jìn)行脫水、浸蠟等處理，最終包埋成蠟塊，可長(zhǎng)久保存，需要時(shí)進(jìn)行切片處理。組織玻片進(jìn)行脫蠟處理后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血管硝酸銀染色 將5%硝酸銀滴加到玻片上，紫外光照射1 h，于堿性品紅溶液中復(fù)染，顯微鏡下觀察，鈣鹽沉積呈黑色。0分，無(wú)鈣鹽沉積；1分，點(diǎn)狀鈣鹽沉積；2分，單個(gè)片狀鈣鹽沉積；3分，多個(gè)片狀鈣鹽沉積；4分，彌漫性圍繞管腔的鈣鹽沉積［7］。0分為未鈣化組，評(píng)分≥1分為鈣化組。

1.3.3 免疫組化測(cè)定血管Runx2表達(dá) 使用全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行染色、修復(fù)，呈棕黃色為Runx2陽(yáng)性。隨機(jī)讀取5個(gè)高倍視野，依照細(xì)胞陽(yáng)性染色程度評(píng)分。1分，弱陽(yáng)性；2分，中等強(qiáng)度；3分，強(qiáng)陽(yáng)性。依照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分為：≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～74%為2分，≥75%為3分。陽(yáng)性細(xì)胞和染色強(qiáng)度積分相加為0～6分［8］。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）測(cè)定Runx2 mRNA表達(dá)水平 提取各組患者血清中的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。引物序列Runx2：上游引物5'-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC-3'，下游引物5'-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC-3'，產(chǎn)物大小149 bp；GAPDH：上游引物5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'，產(chǎn) 物 大 小131 bp，GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系20μL，即qPCR Mix 10μL、cDNA 2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、補(bǔ)水至20μL，反應(yīng)條件：95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Runx2 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman法。影響因素采用多元線性回歸分析。受試者工作特征（ROC）曲線用于評(píng)價(jià)Runx2對(duì)血管鈣化的診斷預(yù)測(cè)效能，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管組織鈣化及Runx2表達(dá)情況 硝酸銀染色結(jié)果顯示，鈣化組黑色沉積較未鈣化組顯著增多；免疫組化染色顯示，與未鈣化組相比，鈣化組Runx2棕黃色沉積顯著增多，見(jiàn)圖1。鈣化組鈣化評(píng)分為3.0（2.0，4.0）。未鈣化組和鈣化組Runx2評(píng)分分別為1.00（0.00，1.00）和3.00（2.00，4.00），鈣化組Runx2評(píng)分顯著升高（Z=6.239，P＜0.01）。

Fig.1 Human vascular tissue calcification and Runx2 expression圖1 人血管組織鈣化及Runx2表達(dá)情況

2.2 2組患者的臨床指標(biāo)分析 鈣化組年齡、透析齡、血清Runx2 mRNA水平、血磷、iPTH顯著高于未鈣化組,而血白蛋白和血鈣水平顯著低于未鈣化組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 各臨床指標(biāo)與患者血管鈣化評(píng)分的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清Runx2 mRNA水平、年齡、透析齡、血磷、iPTH、Runx2評(píng)分均與鈣化評(píng)分呈正相關(guān)（rs分別為0.624、0.310、0.640、0.280、0.400和0.685，均P＜0.05）；血白蛋白和血鈣與鈣化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.260和-0.542，均P＜0.01）。

2.4 血管鈣化的多元線性回歸分析 以鈣化評(píng)分為因變量，血清Runx2 mRNA水平、年齡、透析齡、血鈣、血磷、白蛋白、iPTH為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示血清Runx2 mRNA表達(dá)水平升高、高透析齡和低血鈣是血管鈣化的影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.1 Analysis of clinical indicators of the two groups of patients表1 2組患者的臨床各指標(biāo)情況分析

Tab.2 Multiple linear regression analysis of vascular calcification表2 血管鈣化的多元線性回歸分析

2.5 血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣對(duì)血管鈣化的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣三者聯(lián)合診斷時(shí)的曲線下面積（AUC）為0.934，敏感度為95.65%，特異度為76.36%，見(jiàn)表3、圖2。

Tab.3 Predictive efficacy of serum Runx2 mRNA,serum calcium and dialysis age in the diagnosis of vascular calcification表3 血清Runx2 mRNA、血鈣和透析齡對(duì)血管鈣化診斷的預(yù)測(cè)效能

Fig.2 The ROC curve of serum Runx2 mRNA,blood calcium and dialysis age alone and in combination with the detection of vascular calcification圖2 血清Runx2 mRNA、血鈣和透析齡單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)血管鈣化的ROC曲線圖

3 討論

尿毒癥患者動(dòng)脈鈣化程度與病死率呈正相關(guān)［3］。早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，防止血管鈣化的發(fā)生發(fā)展對(duì)于提高尿毒癥患者的生活及生存質(zhì)量至關(guān)重要。尿毒癥患者動(dòng)脈血管鈣化主要表現(xiàn)為血管中膜鈣化，即動(dòng)脈中膜的內(nèi)彈力層出現(xiàn)羥磷灰石晶體鈣的線性沉積，類似于骨的形成［4，9］。尿毒癥患者血管鈣化并非鈣磷被動(dòng)沉積于血管壁，而是由血管平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)的可調(diào)過(guò)程，是由多種調(diào)節(jié)因素參與調(diào)控的類似骨形成的復(fù)雜病理過(guò)程，主要表現(xiàn)為血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞由正常的收縮表型向成骨樣表型轉(zhuǎn)化［10-11］，促進(jìn)成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2等表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)下游一系列骨相關(guān)蛋白表達(dá)［12］，最終導(dǎo)致鈣磷等礦物質(zhì)異常沉積于血管壁。

本研究中2組患者的動(dòng)脈Runx2免疫組化染色顯示，鈣化組血管Runx2表達(dá)升高，表明發(fā)生鈣化的血管成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá)增加。鈣化組血清Runx2 mRNA水平高于未鈣化組，血清中Runx2表達(dá)增加可能誘導(dǎo)動(dòng)脈中膜層的血管平滑肌細(xì)胞鈣化。Patidar等［13］在體外實(shí)驗(yàn)研究中表明，尿毒癥患者血清能夠通過(guò)誘導(dǎo)Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，與本研究結(jié)果一致。有研究證實(shí)，敲低Runx2表達(dá)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型變化，抑制鈣化的發(fā)生，而過(guò)表達(dá)Runx2會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型變化，促進(jìn)鈣化的發(fā)生［14-15］。本研究中血清Runx2 mRNA水平升高是血管鈣化的影響因素，且與鈣化評(píng)分呈正相關(guān)，提示血清Runx2 mRNA水平升高促進(jìn)了血管鈣化的發(fā)生。ROC曲線結(jié)果顯示，血鈣的AUC最小，即血鈣對(duì)模型的影響最小。血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣三者聯(lián)合時(shí)AUC最大，因此血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣水平聯(lián)合對(duì)血管鈣化具有較高的診斷預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究鈣化組的年齡、透析齡、血磷、iPTH顯著高于未鈣化組,與鈣化評(píng)分呈正相關(guān)；而血白蛋白和血鈣水平顯著低于未鈣化組，與鈣化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)?；貧w分析顯示，高透析齡與低血鈣是血管鈣化的影響因素，與Cozzolino等［16］研究結(jié)果一致。高iPTH、高磷血癥、低鈣血癥是尿毒癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，其中高磷血癥是血管鈣化發(fā)生的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)，而隨著年齡增加和透析時(shí)間延長(zhǎng)，高磷血癥的發(fā)生率也增高，可能會(huì)誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，增加尿毒癥患者血管鈣化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［17-19］。所以，糾正高血磷和低血鈣、降低iPTH是臨床預(yù)防血管鈣化的主要措施。也有研究證實(shí)，高磷可通過(guò)鈉依賴性磷酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促使血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致鈣化［20］。有研究表明尿毒癥患者低血白蛋白與高炎癥狀態(tài)密切相關(guān)，而高炎癥狀態(tài)可增加血管鈣化的風(fēng)險(xiǎn)［21］。López-Mejías等［22］研究表明炎性因子白細(xì)胞介素-6可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致血管鈣化。

本研究為單中心的橫斷面研究，樣本量小，不能排除其他混雜性因素的影響，且研究為RNA水平，故具有一定的局限性。今后需擴(kuò)大樣本量并增加對(duì)Runx2蛋白水平的研究，對(duì)本研究的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，血清Runx2 mRNA水平顯著升高是尿毒癥患者發(fā)生血管鈣化的影響因素，其與透析齡、血鈣聯(lián)合用于評(píng)估時(shí)的診斷預(yù)測(cè)效能更高。血清Runx2 mRNA可能成為診斷預(yù)測(cè)尿毒癥患者血管鈣化的生物學(xué)標(biāo)志物，為血管鈣化相關(guān)疾病的診斷及預(yù)測(cè)提供新思路。