cAMP 調(diào)節(jié)劑對卵母細胞體外成熟效果的調(diào)節(jié)機制研究進展

齊雅天，房曉歡，李 颯，李俊杰,2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

卵母細胞體外成熟（IVM）是體外胚胎生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，對于人類輔助生殖技術(shù)和優(yōu)良種畜快速擴繁具有重要意義[1]，其成熟效果直接影響著后續(xù)體外受精、體細胞核移植、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細胞與胚胎移植等技術(shù)的效果，對于胚胎基因組激活和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。卵母細胞成熟包括細胞核與細胞質(zhì)成熟2 個方面[2]，但哺乳動物卵母細胞在常規(guī)IVM 培養(yǎng)時，易導(dǎo)致細胞核成熟先于細胞質(zhì)成熟，造成核質(zhì)成熟不同步，影響卵母細胞成熟質(zhì)量[3]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞體內(nèi)成熟時高水平的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是抑制核成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。因此，常在IVM 前增加預(yù)成熟階段升高cAMP，抑制核成熟，使細胞質(zhì)充分發(fā)育，有助于提高卵母細胞發(fā)育能力[5]。Zhang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，使用cAMP 調(diào)節(jié)劑可維持小鼠卵母細胞內(nèi)高cAMP 水平，從而抑制核成熟，提高卵母細胞核質(zhì)同步成熟效果。本文通過對卵母細胞內(nèi)cAMP 的動態(tài)變化、常用cAMP 調(diào)節(jié)劑及其調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的機制進行綜述，以期為提高卵母細胞體外成熟效果提供依據(jù)。

1 卵母細胞成熟過程中cAMP 變化及對卵母細胞體外成熟的影響

哺乳動物卵母細胞來源于胚胎期出現(xiàn)的卵原細胞，卵原細胞經(jīng)多次有絲分裂發(fā)育為初級卵母細胞，后經(jīng)2次減數(shù)分裂得到成熟的卵母細胞。在體內(nèi)，卵母細胞中高濃度的cAMP 使其細胞核停滯于第1 次減數(shù)分裂前期的雙線期，稱為生發(fā)泡階段（GV）[7]。這主要是由于高濃度cAMP 激活了蛋白激酶A（PKA），進而提高了抑制卵母細胞核成熟的細胞周期蛋白依賴激酶1（CDK1）活性[8]。排卵前，在促黃體素作用下，卵丘細胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸（cGMP）濃度下降，經(jīng)縫隙連接，使卵母細胞內(nèi)cAMP 濃度驟降[9-10]，生發(fā)泡破裂（GVBD），恢復(fù)減數(shù)分裂，排出第一極體。這一過程受卵母細胞自分泌與周圍卵丘細胞旁分泌信號的調(diào)節(jié)[11]。然而體外培養(yǎng)時，GV 期卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs）一旦離開母體，卵丘細胞與卵母細胞之間的縫隙連接受損[12]，cAMP和cGMP 合成受阻，使卵母細胞中cAMP 濃度下降進而導(dǎo)致核成熟[2]。因此，卵母細胞體外培養(yǎng)往往由于核質(zhì)發(fā)育不同步的問題造成體外卵母細胞的發(fā)育能力遠不及體內(nèi)[2,9]。

另有研究表明，cAMP 對卵母細胞的代謝水平和抗氧化能力也有影響，如刺激顆粒細胞糖酵解、提高卵母細胞谷胱甘肽水平和線粒體氧化代謝功能[13-15]，這些均有助于提高卵母細胞的體外成熟質(zhì)量。

2 常用cAMP 調(diào)節(jié)劑調(diào)控卵母細胞體外成熟

2.1 常用cAMP 調(diào)節(jié)劑 添加cAMP 調(diào)節(jié)劑模擬體內(nèi)環(huán)境，可維持卵母細胞內(nèi)高水平cAMP 以促使核質(zhì)發(fā)育趨于同步，提高卵母細胞質(zhì)量[16]。常用的調(diào)節(jié)劑有毛喉素（FSK）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、西洛酰胺（CIL）和C 型鈉肽（CNP）。

2.1.1 FSK FSK，又名FK，可有效提高卵母細胞中cAMP 濃度。對牛新鮮卵母細胞和玻璃化冷凍卵母細胞的研究表明，在添加FSK 的IVM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5 h后，新鮮組和玻璃化冷凍組卵母細胞cAMP 水平均有所提高，成熟培養(yǎng)22～26 h 時與對照組相比成熟率低，但30 h 的成熟率與對照組相比無差異，證明FSK 可延遲成熟進程，促進核質(zhì)成熟同步且對成熟率并無不良影響[17]。Park 等[18]將豬COCs 在添加50 μmol/L FSK 的培養(yǎng)基中預(yù)成熟24 h，之后在常規(guī)IVM 培養(yǎng)基中成熟41～44 h，發(fā)現(xiàn)FSK 添加組相比于其他處理組顯著促進了孤雌激活的囊胚形成?？傊現(xiàn)SK 可通過提高cAMP水平促進卵母細胞核質(zhì)同步成熟。

2.1.2 IBMX IBMX 也是一種常用的cAMP 調(diào)節(jié)劑。Kenji 等[17]研究顯示，無論是牛凍融卵母細胞還是新鮮卵母細胞，添加IBMX 培養(yǎng)2、4、8 h 的卵泡破裂率與對照組相比均顯著降低，證明IBMX 可以維持阻滯，提高卵母細胞發(fā)育能力，改善與冷凍保存相關(guān)的卵母細胞減數(shù)分裂和發(fā)育異常。Abdel-Ghani 等[19]將卵母細胞置于含IBMX 的培養(yǎng)基中預(yù)成熟0、5、10 h，結(jié)果顯示預(yù)成熟5 h的卵母細胞卵裂率和囊胚率均高于0、10 h組?？梢姡琁VM 過程中添加適宜的IBMX 對于維持卵母細胞阻滯，改善發(fā)育能力有良好效果。

2.1.3 CIL CIL 提高卵母細胞cAMP 的能力已受到廣泛認可。有報道顯示，1 μmol/L 的CIL 已在小鼠[20]及人[21]卵母細胞中發(fā)揮較好效果。而綿羊IVM 培養(yǎng)液中添加5 μmol/L CIL 也可以延遲核成熟進程并不損害卵母細胞發(fā)育到M II 期的能力[22]。Lee 等[23]在直徑小于3 mm的豬未成熟卵泡中采集COCs，之后置于含有20 μmol/L CIL 的培養(yǎng)基中預(yù)成熟2 d，可顯著增加卵母細胞平均直徑。因此，使用CIL 可維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯，調(diào)節(jié)核成熟進程。

2.1.4 CNP CNP 是一種天然的cAMP 調(diào)節(jié)劑，可由卵泡壁層顆粒細胞產(chǎn)生，受體為鈉尿肽受體2（NPR2）。Soto-Heras 等[24]在牛卵母細胞預(yù)成熟階段分別添加100 nmol/L和200 nmol/L 的CNP，培養(yǎng)6 h 后的COCs 阻滯效果均比對照組更佳。另有研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)成熟培養(yǎng)基中添加CNP 可顯著提高豬卵母細胞體外受精后的卵裂率和囊胚率[25]。同樣，海日汗等[26]用200 nmol/L CNP 預(yù)成熟綿羊COCs 培養(yǎng)4 h 后，囊胚率顯著高于對照組。因此，CNP 可以作為良好的cAMP 調(diào)節(jié)劑促進卵母細胞成熟及隨后的胚胎發(fā)育。

2.2 cAMP 調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用 在預(yù)成熟期同時添加IBMX 和FSK 在一定程度上模擬了體內(nèi)由促性腺激素激增引起的cAMP 水平的升高[27]。近年，針對人類輔助生殖技術(shù)，模擬生理卵母細胞成熟（SPOM）體系成為研究熱點，該體系先在預(yù)成熟階段添加一定濃度的IBMX 和FSK，而后在IVM 期使用CIL，可延緩減數(shù)分裂進程，防止卵母細胞核早熟，顯著提高卵母細胞成熟率[28]。Hashimoto 等[29]在研究牛卵母細胞發(fā)育過程中線粒體的變化時發(fā)現(xiàn)，使用IBMX 和FSK 處理可誘導(dǎo)糖酵解、脂肪酸降解和線粒體電子運輸系統(tǒng)所需基因的表達，改善卵母細胞的線粒體功能和ATP 水平，且不影響成熟率。此外，Soto-Heras 等[24]在牛卵母細胞預(yù)成熟期使用IBMX 和FSK 2 種調(diào)節(jié)劑，能夠顯著提高囊胚率和妊娠率；另外，該團隊聯(lián)合使用CNP 和IBMX 可使90%以上卵母細胞維持阻滯長達6 h，比單獨使用其中任一抑制劑阻滯時間更長。

總之，添加CNP、IBMX、FSK 和CIL 等cAMP 調(diào)節(jié)劑，可以模擬生理卵母細胞成熟過程中出現(xiàn)的一些關(guān)鍵信號因子，通過維持減數(shù)分裂阻滯來改善卵母細胞發(fā)育，提高卵母細胞質(zhì)量[14]。

3 cAMP 調(diào)節(jié)卵母細胞體外成熟的機制

3.1 cAMP 的合成與分解途徑 cAMP 的合成主要由腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化三磷酸腺苷（ATP）生成。哺乳動物卵母細胞內(nèi)cAMP 來源主要有2 個方面。主要途徑是AC 催化卵丘顆粒細胞ATP 生成cAMP，再通過縫隙連接轉(zhuǎn)運至卵母細胞內(nèi)部調(diào)控減數(shù)分裂進程[30]；此外，卵母細胞內(nèi)G 蛋白與受體（GPR）結(jié)合也可激活A(yù)C，通過自身Gs-GPR-AC 級聯(lián)反應(yīng)加強AC 活性，催化ATP 磷酸化，使卵母細胞內(nèi)cAMP 持續(xù)產(chǎn)生[31]。

在分解途徑中，cAMP 可被磷酸二酯酶（PDE）去磷酸化為一磷酸腺苷（AMP），AMP 再經(jīng)腺苷回收途徑轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，實現(xiàn)cAMP 的循環(huán)[27]。哺乳動物體內(nèi)PDE 同工酶有11 種，其中PDE3 僅存于卵母細胞中[18]。研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細胞生成的cGMP 可經(jīng)縫隙連接擴散入卵母細胞，抑制PDE3 活性，阻止cAMP 水解以維持減數(shù)分裂阻滯[6,32]。

3.2 cAMP 調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的機制

3.2.1 AC 激活途徑 FSK 可對AC 的生成起促進作用，是活化cAMP 生成路徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[33]。FSK 可通過激活A(yù)C，加速ATP 轉(zhuǎn)化為cAMP 并使之累積[27]，從而有效抑制卵母細胞核成熟進程。

3.2.2 PDE 抑制途徑 CNP、IBMX、CIL 可通過抑制PDE 調(diào)節(jié)核成熟。其中，CNP 調(diào)控卵母細胞cAMP 的具體途徑隨物種而異。在小鼠中，NPR2 僅分布于卵丘細胞，CNP 只能與卵丘細胞上的NPR2 結(jié)合，產(chǎn)生的cGMP 經(jīng)縫隙連接擴散入卵母細胞內(nèi)[6]。而牛的NPR2在卵丘細胞和卵母細胞表面均有表達[15]。牛壁層顆粒細胞合成的CNP 刺激卵丘細胞NPR2 生成cGMP，通過縫隙連接轉(zhuǎn)移到卵母細胞內(nèi)發(fā)揮作用；同時CNP 也可激活卵母細胞表面的NPR2，直接產(chǎn)生cGMP 抑制卵母細胞PDE 活性，阻止cAMP 水解，維持減數(shù)分裂阻滯[34]?？傊?，哺乳動物的CNP 大多都是經(jīng)由CNP/NPR2-cGMPPDE 通路維持阻滯。IBMX 作為PDE 廣譜抑制劑（PDE8和PDE9 除 外）可以抑制PDE 活 性[35-36]。CIL 不 同于IBMX，其作為PDE3 的特異性抑制劑，通過阻止PDE3 對卵母細胞cAMP 的降解[36]，維持減數(shù)分裂阻滯。

4 存在的問題

IVM 培養(yǎng)基中減數(shù)分裂抑制劑和誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的減數(shù)分裂動力學(xué)變化需嚴格平衡。雖然CNP、IBMX、FSK 和CIL 的作用效果已較為明顯，但IVM 系統(tǒng)極其精細，cAMP 調(diào)節(jié)因子很敏感[37]，操作不當會產(chǎn)生負面影響。例如預(yù)成熟階段使用的IBMX 和FSK，對卵母細胞具有一定的化學(xué)毒性，如未徹底清洗干凈，則會影響卵母細胞的減數(shù)分裂，降低其受精率和胚胎產(chǎn)量[38]。此外，雖然核成熟抑制劑調(diào)節(jié)卵母細胞發(fā)育能力已受廣泛認可，但某些物種體外成熟效果仍有待提高，如劉曉靜等[39]盡管證實100 nmol/L CNP 預(yù)處理12 h 可顯著提高犬卵母細胞體外成熟效果，但成熟率僅為26.9%?？梢?，現(xiàn)有cAMP 調(diào)節(jié)劑對卵母細胞體外成熟效果仍有待深入研究。

5 結(jié) 語

綜上，cAMP 介導(dǎo)的體外成熟法是一種更精細化的卵母細胞體外成熟方法，可維持卵母細胞cAMP 水平，延長核成熟進程，縮小核質(zhì)發(fā)育差距，為提高體外卵母細胞發(fā)育能力提供了實踐依據(jù)。此項技術(shù)的臨床應(yīng)用對于人類和動物來說具有潛在意義，但不同物種的適宜用量及處理時長等仍有待探索。