褪黑素對動物繁殖的調(diào)控作用機(jī)制研究進(jìn)展

梁錦萍，字向東

（西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

褪黑素（Melatonin，MLT）因可以使兩棲類動物皮膚色澤變淺而得名，最早是從牛的松果腺提取得到，所以也稱為松果腺素。除松果體外，胃[1]、卵巢[2]等組織器官也能分泌少量褪黑素。褪黑素在動物機(jī)體中參與許多生理過程，作用廣泛，如調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動[1]、抗腫瘤作用[3-4]、抗氧化[5]、延緩卵巢衰老[6]、增強(qiáng)免疫力[7]以及調(diào)節(jié)動物生殖機(jī)能[8-10]。本文綜述了褪黑素對動物季節(jié)性繁殖、卵泡發(fā)育、精子發(fā)生、體外受精、早期胚胎發(fā)育和精液冷凍保存的作用及其作用機(jī)制，旨在為畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中褪黑素的使用提供參考。

1 褪黑素概述

1.1 褪黑素的化學(xué)性質(zhì) 褪黑素分子結(jié)構(gòu)為N– 乙酰基–5– 甲氧基色胺，是一種色氨酸衍生物，分子量為232 的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素[11]，是微溶于水、易溶于乙醇等有機(jī)溶劑的淡白色結(jié)晶[12]。

1.2 褪黑素的合成代謝 褪黑素主要由松果腺合成分泌，視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）接收外界的光周期信號之后，傳入松果腺，從而調(diào)節(jié)褪黑素的分泌[13]。褪黑素的分泌節(jié)律表現(xiàn)為明顯的晝夜性和季節(jié)性，主要受到光照的周期調(diào)控，此外也會受到光色、光照強(qiáng)度、溫度、動物種類等因素影響[14]。褪黑素分泌的晝夜節(jié)律表現(xiàn)為白晝低夜晚高，延長光照會顯著降低血清褪黑素水平，而縮短光照則會顯著提升血清褪黑素水平。不同的物種、品種之間以及同一品種不同生理時期的褪黑素分泌也存在差異[15-16]。

早期研究認(rèn)為，褪黑素只能由松果腺合成分泌，后來的研究證明動物體內(nèi)多種組織器官，如胃、卵巢、胎盤、腦、心、肝等也具有分泌褪黑素的功能[1-2,16-20]，但只有松果腺與視網(wǎng)膜能夠進(jìn)行周期性分泌[13]。褪黑素在動物體內(nèi)的合成是由5-羥色胺通過芳基烷胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Action of Arylalkylamine N-acetyltransferase，AANAT）和乙酰5-羥色胺一氧甲基轉(zhuǎn)移酶（Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT）也稱羥吲哚一氧甲基轉(zhuǎn)移酶的順序作用合成[19]。褪黑素在體內(nèi)經(jīng)肝臟降解，細(xì)胞色素P450 酶的亞型對褪黑素進(jìn)行6-羥基化，產(chǎn)生6-羥基褪黑素，進(jìn)一步催化褪黑素中的氧進(jìn)行去甲基化，得到去N-乙酰-血清素（N-乙酰-5-羥色胺），最后被硫酸化或者葡萄糖醛酸化，其代謝產(chǎn)物隨尿液排出[21]。

1.3 褪黑素受體 褪黑素受體1（Melatonin Receptor 1，MT1）和褪黑素受體2（Melatonin Receptor 2，MT2）是褪黑素的2 種亞膜型受體，存在于多種動物中，均屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族。而褪黑素受體3（Melatonin Receptor 3，MT3）是一種胞質(zhì)酶-醌還原酶2，與MT1、MT2 并不相似，與褪黑素的結(jié)合能力更弱。除此之外，褪黑素還具有核受體，即維甲酸Z 受體/維甲酸相關(guān)孤核受體（RZR/ROR）超家族的孤兒核受體，通過核受體途徑也能完成褪黑素的某些生物功能[18]。

MT1、MT2基因在成年母豬的腦、卵巢、腎臟、心臟等器官以及脂肪等組織中均有表達(dá)，并且在卵巢和腦組織中的表達(dá)顯著高于其他器官組織[22]。也有研究發(fā)現(xiàn)，MT1基因在藏綿羊整個發(fā)情周期的下丘腦、垂體、卵巢以及輸卵管和子宮中均有表達(dá)[23-24]。還有研究發(fā)現(xiàn)MT1 和MT2 在妊娠奶山羊卵巢[25-26]表達(dá)，在人的乳房、卵巢、子宮和胎盤[16]以及嚙齒動物腹股溝和附睪脂肪細(xì)胞、人類白色脂肪組織和棕色脂肪組織中都有表達(dá)[27]。

2 褪黑素與動物的季節(jié)性發(fā)情調(diào)控

動物的季節(jié)性繁殖是其長久以來適應(yīng)環(huán)境，使后代在最適宜的季節(jié)中出生，更好地生長發(fā)育而形成的一種節(jié)律性生活特征。光照是引起動物季節(jié)性繁殖的重要因素之一，而光照的周期變化會引起動物體內(nèi)褪黑素的周期性變化。褪黑素能參與多種動物的繁殖調(diào)控，特別是季節(jié)性繁殖動物。季節(jié)性繁殖的動物可以分為長日照型（馬、驢、貓等）和短日照型（綿羊、山羊、鹿等）[14]。長日照型高原鼠兔的腦和血清中的褪黑素水平在非繁殖期極顯著高于繁殖期[28]。褪黑素能夠降低家貓促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）水平，補(bǔ)充外源性褪黑素可以有效抑制母貓卵巢的活性，因此可以通過注射褪黑素給家貓避孕[29]。而短日照型動物則相反，體內(nèi)埋植褪黑素可以提高非發(fā)情季節(jié)的母鹿體內(nèi)的卵泡刺激 素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）和LH 濃度，促進(jìn)其卵泡發(fā)育、發(fā)情排卵[30]。褪黑素在下丘腦-垂 體-性腺軸（Hypothalamus Pituitary Gonad Axis，HPGA）上可以調(diào)節(jié)下丘腦分泌的促性腺素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）的分泌，但是在不同物種上的作用表現(xiàn)不同[31-32]，褪黑素也能直接影響由垂體前葉合成和分泌FSH、LH 及其受體的表達(dá)[30,33]。綜上所述，褪黑素對季節(jié)性繁殖的調(diào)控在不同物種之間存在差異，對長日照動物來說是抑制因子；對短日照動物來說是促進(jìn)因子[34]。

研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜接收季節(jié)性光照光信號的變化后通過SCN 傳遞到松果腺從而調(diào)節(jié)褪黑素的分泌[13]。褪黑素作用于MT1，并通過促甲狀腺激素（Thyroidstimulating Hormone，TSH）-TSH 受體（TSHR）信號通路調(diào)節(jié)和2 型甲狀腺素脫碘酶（Type 2 Iodothyronine Deiodinase，DIO2）和DIO3 的表達(dá)和轉(zhuǎn)換，最終通過甲狀腺素（Thyroid Hormone，TH）作用于HPGA，調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖活動[34-35]。除了通過上述的TH調(diào)控通路外，褪黑素還有可能靶向親吻素（Kisspeptin，Kp）和RF酰胺相關(guān)肽（RF Amide-related Peptide，RFRP）調(diào)節(jié)GnRH 神經(jīng)元的活力，影響GnRH 的分泌，參與動物的季節(jié)性繁殖調(diào)控[36]。在HPGA 中，褪黑素與促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory Hormone，GnIH）對動物繁殖活動的調(diào)控具有協(xié)同作用，但褪黑素如何影響GnIH、在整個繁殖活動中兩者作用之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究[37]。

3 褪黑素對雌性動物生殖機(jī)能的調(diào)控

3.1 褪黑素對卵巢的調(diào)控作用 通過100 μmol/L 褪黑素處理能夠顯著增加體外培養(yǎng)的小鼠卵泡中雄激素和孕酮的產(chǎn)生[38]。褪黑素是通過調(diào)節(jié)大鼠類固醇合成基因（CYP17A1）的表達(dá)來影響卵泡類固醇的產(chǎn)生[39]。而褪黑素可以影響體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞增殖和類固醇生成[40]。褪黑激素通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)FSH及LH 的分泌進(jìn)而影響性腺生殖激素的分泌；也可以通過血液直接作用于卵巢褪黑素受體調(diào)控類固醇性激素分泌[41]。MT1基因敲除小鼠的褪黑素信號通路阻斷，導(dǎo)致瘦素水平降低、類固醇激素分泌減少和產(chǎn)仔數(shù)減少。補(bǔ)充瘦素可以改善MT1基因敲除小鼠的排卵，恢復(fù)類固醇激素水平[27]。豬瘦素缺失不影響褪黑素的合成，但會降低產(chǎn)仔數(shù)和類固醇激素，可以認(rèn)為瘦素是褪黑素調(diào)控小鼠和豬雌性生殖的下游靶點(diǎn)[27]。

卵巢的衰老主要表現(xiàn)在卵巢卵泡和卵母細(xì)胞數(shù)目的減少，具有正常染色體分布的卵母細(xì)胞百分比降低，體外受精后原核形成的持續(xù)時間變長以及卵母細(xì)胞發(fā)育潛力下降。褪黑素處理組雌性ICR 小鼠在10～43 周齡只飲用含褪黑素的水（100 μg/mL），其原始卵泡、初級卵泡和竇狀卵泡以及卵母細(xì)胞數(shù)量都多于對照組[42]。在昆明小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以延緩卵巢衰老導(dǎo)致的卵母細(xì)胞數(shù)量下降，減少因衰老引起的閉鎖卵泡數(shù)量，但是并不能完全阻止卵泡消失[6]。

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損傷卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[43]。已有研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在牛卵巢發(fā)揮抗氧化作用，降低卵巢的氧化應(yīng)激[44]；保護(hù)人類顆粒細(xì)胞[45]和卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[46]；減少小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體和質(zhì)膜中毒氧化應(yīng)激[47]。

3.2 褪黑素對卵泡發(fā)育的調(diào)控 神經(jīng)內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌調(diào)控著卵泡的生長發(fā)育。褪黑素可以通過局部的旁分泌和自分泌影響卵泡生長發(fā)育[18]，也能夠通過影響其他性腺激素的合成與分泌從而調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育。體內(nèi)埋植褪黑素可以加快山羊優(yōu)勢卵泡的生長，從而提高卵泡的發(fā)育能力[48]。此外，褪黑素的抗氧化和抗細(xì)胞凋亡作用也能保護(hù)卵泡在生長發(fā)育過程中免受ROS 等氧化物質(zhì)的損傷。健康卵泡顆粒細(xì)胞中褪黑素受體MT1 和MT2 表達(dá)顯著高于閉鎖卵泡[22]，說明褪黑素及其受體可能在卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

3.3 褪黑素對卵母細(xì)胞體外成熟的影響 卵母細(xì)胞體外成熟（In vitromaturation，IVM）已成為現(xiàn)代胚胎生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一，是體外受精（IVF）、核移植（Nuclear Transfer，NT）等生物技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。褪黑素除了對體內(nèi)的卵母細(xì)胞有益作用外，對卵母細(xì)胞體外成熟也能發(fā)揮作用。褪黑素（10-7mol/L）通過清除ROS 和調(diào)節(jié)類固醇激素的產(chǎn)生，顯著促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的體外成熟，并且可以保護(hù)線粒體，使豬卵母細(xì)胞免受熱應(yīng)激損傷[49]。褪黑素（10-9mol/L）可以顯著降低玻璃化冷凍的牛卵母細(xì)胞的ROS 水平，抑制細(xì)胞凋亡，從而增加其發(fā)育潛力[10]。

褪黑素促進(jìn)人卵母細(xì)胞成熟的抗氧化作用是通過增強(qiáng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（Clathrin-mediated Endocytosis，CME）來實(shí)現(xiàn)的，其表現(xiàn)為包被核和囊泡數(shù)量的增加，同時用于組裝核和囊泡的主要蛋白表達(dá)上調(diào)[50]。在牛卵母細(xì)胞IVM 中，褪黑素通過去甲基化來調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)[51]。這些發(fā)現(xiàn)揭示了褪黑素在IVM 過程中改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的潛在機(jī)制。此外，應(yīng)用褪黑素可以減少百草枯（Paraquat，PQ）對牛卵母細(xì)胞的損傷，顯著減輕PQ 對IVM 卵母細(xì)胞的毒性作用[52]。以上結(jié)果證明，褪黑素可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，并且減少卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，在卵母細(xì)胞IVM中發(fā)揮重要作用[53]。

4 褪黑素對雄性動物的生殖機(jī)能調(diào)控

4.1 褪黑素對精子發(fā)生的調(diào)控 睪丸間質(zhì)細(xì)胞對精子的發(fā)生具有重要作用。褪黑素能夠提高小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力[54]，抑制細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控精子發(fā)生。連續(xù)注射褪黑素拮抗劑，能夠誘導(dǎo)非繁殖時期的高原鼠兔恢復(fù)其生殖細(xì)胞發(fā)育和精子發(fā)生，可以認(rèn)為褪黑素節(jié)律性分泌可以介導(dǎo)調(diào)控高原鼠兔季節(jié)性精子發(fā)生[55]。在體外培養(yǎng)條件下，10-7mol/L 的褪黑素能顯著促進(jìn)薩?？搜虻木?xì)胞分化為功能性單倍體精子細(xì)胞[56]；同時，褪黑素受體普遍存在于精子發(fā)生的各級細(xì)胞中，且在動物受精階段表達(dá)水平最高[57]。這些研究證明褪黑素及其受體參與調(diào)控精子發(fā)生過程以及體外生精細(xì)胞單倍體發(fā)育。

4.2 褪黑素對精子質(zhì)量的影響 高內(nèi)源性褪黑素濃度可以提高人精子質(zhì)量，短期體外的褪黑素處理可改善精子活力[58]；每天補(bǔ)充6 mg 褪黑素可以增加機(jī)體褪黑素水平并減少精子DNA 造成的氧化損傷[59]。10-5mol/L 和10-3mol/L 褪黑素可提高細(xì)胞質(zhì)膜完整性、線粒體活性和頂體完整性，顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，在牛精子獲能過程中發(fā)揮抗氧化性能，改善獲能后的精液品質(zhì)，有助于提高受精率和體外胚胎發(fā)育[60]。褪黑素能夠延長常溫保存的豬精液的有效存活時間[61]。在豬精液稀釋液中添加一定量的褪黑素可以有效緩解熱應(yīng)激引起的精子質(zhì)量下降，但對精子活率并沒有顯著影響[62]。羊精液低溫保存條件下添加適宜濃度褪黑素（20 mg/L）能夠提高精子品質(zhì)，但褪黑素濃度過高（≥80 mg/L）保存效果反而下降[63]。0.003 mmol/L 褪黑素對雞精液保存有明顯作用，但過高濃度的褪黑素對雞精液保存有抑制作用[64]。0.5 mg/mL 褪黑素能提高絨山羊的精子抗氧化能力以及冷凍保存效果[65]。

5 褪黑素對受精與早期胚胎發(fā)育的影響

5.1 褪黑素對受精作用 受精作用的關(guān)鍵在于卵母細(xì)胞和精子的質(zhì)量以及精子的獲能。褪黑素可以通過促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)一步促進(jìn)克隆胚胎和體外受精及其早期胚胎發(fā)育[53]。從被褪黑素處理過的小鼠體內(nèi)取出的卵母細(xì)胞體的外受精率和囊胚率都有所提高[42]。有研究證明，褪黑素可以通過改善細(xì)胞器的正常分布，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和ATP 水平，增強(qiáng)抗氧化基因表達(dá)水平，調(diào)節(jié)受精相關(guān)過程，從而提高牛卵母細(xì)胞的受精能力和發(fā)育能力[51]。精子獲能是順利完成受精中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)。精子在體外獲能的過程中會產(chǎn)生高濃度ROS，造成對精子的氧化應(yīng)激，而褪黑素的抗氧化性質(zhì)恰好可以減少這種傷害，利于精子的體外獲能以及胚胎的早期發(fā)育。褪黑素對精子獲能有直接的調(diào)節(jié)作用，在低劑量（100 pmol/L）時有激活作用，在高劑量（1 μmol/L）時有抑制作用[66]。

5.2 褪黑素對早期胚胎發(fā)育的影響 褪黑素對卵巢、卵母細(xì)胞以及精子的作用，都將進(jìn)一步影響早期胚胎發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，牛孤雌胚胎早期發(fā)育中存在褪黑素受體MT1 蛋白的表達(dá)，并且MT1 在牛孤雌胚胎發(fā)育的各個時期均有表達(dá)，并且呈逐漸增多的趨勢[67]，證明褪黑素通過與MT1 結(jié)合對牛早期胚胎發(fā)育起到重要的調(diào)節(jié)作用[8]，這在豬和羊等動物中也得到了證實(shí)[68]。褪黑素處理（10-3mol/L）牛精子后進(jìn)行體外培養(yǎng)得到的胚胎的囊胚發(fā)育率顯著提高，而囊胚中凋亡細(xì)胞核的發(fā)生率顯著降低[60]。褪黑素預(yù)處理可以抑制PQ 對牛胚胎的氧化損傷，其抗凋亡性有助于穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)從而保護(hù)胚胎活性[69]，這說明褪黑激素可以增強(qiáng)牛胚胎在氧化應(yīng)激條件下的發(fā)育潛力。褪黑素還能提高冷凍小鼠2-細(xì)胞胚胎的體外發(fā)育能力[70]。

6 小 結(jié)

褪黑素及其受體在多種動物的多種器官、組織細(xì)胞中廣泛存在，并且在機(jī)體各個系統(tǒng)中發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)各種生理活動，如褪黑素參與調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖、影響動物內(nèi)分泌。雌性動物褪黑素可以延緩卵巢衰老，調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，抵抗氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。雄性動物褪黑素能調(diào)控精子發(fā)生，提高精子質(zhì)量，改善精液品質(zhì)與提高精液保存的質(zhì)量。褪黑素在卵母細(xì)胞IVM，精液冷凍保存以及精子獲能過程中發(fā)揮著重要作用，提高了IVF 能力以及早期胚胎發(fā)育的潛能。但不同物種的配子、胚胎所需外源褪黑素的適宜濃度不同，仍然需要進(jìn)一步研究確立褪黑素對于各種家畜家禽的有效安全的添加濃度。隨著對褪黑素作用機(jī)理研究的深入，褪黑素在人工授精、體外受精和胚胎移植等生殖工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加重要的作用。