濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化

程子珊，易 敏，宋才玲，程強(qiáng)強(qiáng)，黃 若，鄧詔磊，張瑩瑩，張 露

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/江西省森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】濕地松（Pinus elliottiiEngelm）為常綠喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，松脂量高質(zhì)優(yōu)，原產(chǎn)美國(guó)東南部，現(xiàn)已成為我國(guó)南方主要造林樹(shù)種之一[1-3]。目前我國(guó)濕地松良種繁育仍以有性繁殖為主，后代變異大限制良種應(yīng)用[4-5]。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)具有繁殖系數(shù)高，穩(wěn)定性強(qiáng)，周期短等優(yōu)點(diǎn)，是無(wú)性繁殖技術(shù)研究中的熱點(diǎn)，已被證明是優(yōu)良林木大規(guī)模繁殖的有利手段[6-8]。建立高效穩(wěn)定的濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生繁殖技術(shù)對(duì)我國(guó)濕地松良種繁育具有重要意義。體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)包括：誘導(dǎo)、增殖、成熟、萌發(fā)4 個(gè)階段，其中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)階段獲得大量的高質(zhì)量的胚性愈傷組織是實(shí)現(xiàn)濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生的重要前提條件。【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者初步誘導(dǎo)得到了濕地松的胚性愈傷組織并獲得再生植株，但建立高效穩(wěn)定的濕地松體胚發(fā)生技術(shù)體系還需要大量的探究。1989 年Jain 等[9]首次誘導(dǎo)出濕地松的胚性愈傷組織并獲得早期體胚；吳麗君[4]研究培養(yǎng)基、球果采集及冷藏時(shí)間對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，得到最高誘導(dǎo)率為24%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段是分化了的體細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的關(guān)鍵階段，它受多種因素影響，并決定后期體胚發(fā)生能否成功，是體胚發(fā)生研究中非常重要的環(huán)節(jié)[10-11]?，F(xiàn)有研究表明，濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低且胚性不強(qiáng)，極大地限制了濕地松規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化快速繁殖能力[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上，探究合子胚發(fā)育時(shí)期、基因型、內(nèi)源激素、不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源等因子對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選未成熟合子胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳發(fā)育時(shí)期，優(yōu)化濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)，為濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系建立提供技術(shù)支撐，對(duì)推動(dòng)濕地松苗木產(chǎn)業(yè)化具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從江西省峽江林木良種場(chǎng)采集濕地松未成熟球果，冷藏運(yùn)至江西農(nóng)業(yè)大學(xué)森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。球果采取定點(diǎn)定株分批采集的方法。用無(wú)水乙醇消毒球果15 min，無(wú)菌水沖洗干凈后取出種子；在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒種子5 min，無(wú)菌水沖洗后，取出未成熟合子胚作為外植體待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以7月11日采集的16號(hào)基因型未成熟合子胚為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置3 種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、3 種濃度，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表1），得到9 個(gè)處理，每處理重復(fù)6 次，每皿接種10個(gè)未成熟合子胚，以探討最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental design of callus induction L9（34）

1.2.2 采集日期和基因型對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2018年6月27日、7月4日、7月11日、7月18 日、7 月25 日和8 月1 日共6 次時(shí)間采集16 號(hào)基因型球果獲得未成熟合子胚，每皿接種10 個(gè)未成熟合子胚，重復(fù)3 次，探討采集時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的影響；以7 月11 日采集的2 號(hào)、14 號(hào)、16 號(hào)、F-A、F-B 和F-C 6 個(gè)基因型的未成熟合子胚為材料，每皿接種10 個(gè)未成熟合子胚，重復(fù)3 次，探討基因型對(duì)誘導(dǎo)的影響。上述培養(yǎng)均在最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方培養(yǎng)基上進(jìn)行。

1.2.3 碳源對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以7月11日采集的16號(hào)基因型的未成熟合子胚為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置蔗糖、麥芽糖和松三糖等3 種碳源及4 種濃度，即蔗糖濃度（15，30，60，90 g/L），麥芽糖濃度（15，30，60，90 g/L），松三糖濃度（0.5，1.0，1.5，2.0 g/L）。每皿接種8個(gè)未成熟合子胚，重復(fù)4次。

上述實(shí)驗(yàn)均以本課題組前期篩選出DCR為基本培養(yǎng)基，以不同濃度的2，4-D、6-BA、KT為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，添加30 g/L 蔗糖（除碳源實(shí)驗(yàn)外）、3 g/L 結(jié)冷膠、1 g/L 酸水解酪蛋白、100 mg/L 肌醇，pH 調(diào)至5.8，經(jīng)121 ℃滅菌25 min后，稍冷卻加入500 mg/L谷氨酰胺。暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±1）oC。每周觀(guān)察記錄，培養(yǎng)7周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.4 濕地松合子胚發(fā)育階段劃分及內(nèi)源激素變化 以2018 年6 月27 日、7 月4 日、7 月11 日、7 月18日、7 月25 日、8 月1 日共6 次時(shí)間采集16 號(hào)基因型球果的合子胚為材料，在20 倍體視鏡（C-LEDS）下觀(guān)察其發(fā)育階段并拍照，以Pullman 等[12]的火炬松合子胚發(fā)育階段劃分標(biāo)準(zhǔn)為參照劃分濕地松合子胚的發(fā)育階段。

2019年7月4日、7月11日、7月18日、7月25日共4次時(shí)間分別采集1.5代濕地松種子園的F-1和F-2兩個(gè)基因型球果獲得未成熟合子胚材料，3次重復(fù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[13]測(cè)定不同發(fā)育階段合子胚的生長(zhǎng)素（IAA）、細(xì)胞分裂素（ZR）、脫落酸（ABA）和赤霉素（GA3）含量，探討合子胚發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源激素變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2007處理，用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

對(duì)正交試驗(yàn)的9 種處理進(jìn)行方差分析表明（表2）：不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度組合對(duì)濕地松愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生具有重要影響。KT 濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率具有顯著影響，當(dāng)KT 濃度為2.2 mg/L時(shí)，平均誘導(dǎo)率最高，為22.22%；添加不同濃度的2，4-D 和6-BA 胚性愈傷組織誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異。處理2 未能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，處理4 和處理8 的誘導(dǎo)率較高為20%，處理5 得到的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高為30%。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)表和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率Tab.2 Induction rate of embryogenic callus and orthogonal experimen of L9（34）

對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行極差分析（表3），結(jié)果表明在不考慮交互作用的情況下，3 種激素對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響程度依次是KT 濃度>2，4-D 濃度=6-BA 濃度，理想的激素組合為：2.2 mg/L KT+2.2 mg/L 2，4-D+1.1 mg/L 6-BA。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Tab.3 Range analysis of orthogonal test results of L9（34）

2.2 采集日期和基因型對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，6次采集球果獲得的未成熟合子胚接種至相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)7周后得到的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不同。方差分析表明，不同日期采集的球果的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。隨著未成熟合子胚逐漸發(fā)育成熟，胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，7 月4 日和7 月11 日胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到30.00%和33.33%，之后隨著合子胚逐漸發(fā)育成熟，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸降低，直至合子胚完全發(fā)育成熟，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為0%。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，愈傷組織與胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力同步，7月4日和7月11日愈傷組織誘導(dǎo)率也最高。

表4 采集日期和基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different collection dates and the genotype on the induction of embryogenic callus

6 個(gè)基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異（表3），胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最低為0%、最高達(dá)30%。16號(hào)基因型胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且連續(xù)兩年試驗(yàn)均表現(xiàn)較高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，其次是F-A、F-B基因型（圖1）。

圖1 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)Fig.1 Induction of embryogenic callus

2.3 碳源對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同碳源和碳源不同濃度胚性誘導(dǎo)率達(dá)顯著或極顯著差異。如圖2所示，隨著蔗糖和麥芽糖濃度的增加，濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢(shì)。蔗糖濃度為30 g/L 時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為20%；當(dāng)麥芽糖濃度為30 g/L 時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為30%；以松三糖作為碳源時(shí)，各處理間呈極顯著差異，當(dāng)濃度為1.5 g/L 時(shí)，誘導(dǎo)率最高，為40%。添加松三糖的平均誘導(dǎo)率為20%，麥芽糖為18.75%；蔗糖最低，為8.75%。松三糖和麥芽糖作為碳源更有利于提高濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

圖2 不同碳源對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Fig.2 The induction rate of embryogenic callus in Pinus elliottii with different carbon sources

2.4 濕地松合子胚發(fā)育階段劃分及內(nèi)源激素變化

如圖3所示，對(duì)2018年6次時(shí)間采集的16號(hào)基因型的球果合子胚進(jìn)行顯微觀(guān)察，濕地松合子胚發(fā)育時(shí)期可劃分為8 個(gè)階段，即第1 階段為合子胚發(fā)育早期階段；第2 階段為多胚頭階段；第3 階段為裂生多胚階段；第4階段為球形胚階段；第5階段為棒狀胚階段；第6階段為子彈頭階段；第7、8階段合子胚逐漸發(fā)育成熟階段。

圖3 合子胚的發(fā)育階段Fig.3 Developmental stages of zygotic embryos

由表5 可知，對(duì)2019 年4 個(gè)時(shí)間段采集F-1 和F-2 兩個(gè)基因型球果的的未成熟合子胚進(jìn)行顯微觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)F-1合子胚發(fā)育階段集中在1～4階段的早中期發(fā)育時(shí)期，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高；F-2合子胚發(fā)育階段集中在4～8階段的中后期發(fā)育時(shí)期，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低。

表5 不同基因型濕地松的合子胚發(fā)育階段Tab.5 The zygotic embryo development stages of different genotypes of Pinus elliottii

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定結(jié)果如圖4 所示，繪制F-1 和F-2 基因型的4 個(gè)時(shí)期8 個(gè)發(fā)育階段合子胚的4種內(nèi)源激素變化趨勢(shì)圖。IAA含量隨著合子胚發(fā)育成熟呈上升趨勢(shì)，ABA含量在合子胚發(fā)育早期呈上升趨勢(shì)至第3階段達(dá)最高峰147.97 ng/gFW，隨后逐步下降；ZR和GA3的含量較低（4 ng/gFW 左右），隨著合子胚的發(fā)育成熟沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，整體呈平穩(wěn)波動(dòng)狀態(tài)。

圖4 濕地松合子胚發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源激素變化Fig.4 Variation trend of endogenous hormones during zygotic embryo development of Pinus elliottii

3 結(jié)論與討論

3.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)及濃度配比是針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的重要影響因素，在松屬樹(shù)種中，愈傷組織誘導(dǎo)最常用的外源激素為低濃度的2，4-D和6-BA[14]。本研究得到：DCR基本培養(yǎng)基中添加2.2 mg/L KT+2.2 mg/L 2，4-D+2.2 mg/L 6-BA是濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，誘導(dǎo)率平均達(dá)到30%，其中KT的濃度對(duì)誘導(dǎo)率影響最為顯著，得到的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好，不易褐化。齊力旺[15]和徐康等[16]也在研究中添加低濃度KT得到了較高的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

3.2 采集日期和基因型對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

確定適宜的球果采集時(shí)間有利于提高濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率隨著球果采集日期呈先上升后下降的趨勢(shì)，7 月4 日和7 月11 日采集的球果，合子胚發(fā)育階段集中在合子胚發(fā)育的2～4 階段，得到的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高。本研究得到的最適采集日期與吳麗君[19]、徐康等[16]的研究結(jié)果略存在差異，但與張彩云等[20]相近，這可能是因?yàn)槭艿赜颉夂?、家系等因素的影響；而發(fā)育至2～4階段的合子胚適合作為胚性愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的結(jié)論均一致。因此，在確定采集日期范圍后，對(duì)合子胚的發(fā)育階段進(jìn)行檢測(cè)，更能精準(zhǔn)的選擇最適誘導(dǎo)合子胚材料。

基因型是誘導(dǎo)濕地松胚性愈傷組織的重要因素[21-22]，唐巍等[23]發(fā)現(xiàn)不同基因型的火炬松的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率差異顯著，其中誘導(dǎo)率最高達(dá)到81.6%、最低為0%。吳夏雷等[24]驗(yàn)證了前人篩選出的3 個(gè)誘導(dǎo)效果較好的基因型杉木母株，可用于今后的取材選擇。陳士剛等[25]研究發(fā)現(xiàn)紅松5個(gè)不同家系未成熟種子的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不同。本研究篩選出16號(hào)基因型能夠連續(xù)兩年穩(wěn)定保持較高的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，適于進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。另外，通過(guò)顯微觀(guān)察發(fā)現(xiàn)7月11日采集的F-A 和F-B基因型濕地松球果處于合子胚發(fā)育的1～2 階段，還未到球果的最適采集時(shí)間，后續(xù)可采集2～4 階段的合子胚材料進(jìn)一步研究。

同一基因型的不同采集日期的球果，合子胚的發(fā)育時(shí)期不同，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不同，且處于發(fā)育2～4階段合子胚更易誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；不同基因型球果的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著，最佳采集日期也不同。這與梁芬[26]對(duì)黑松的體胚發(fā)生研究的結(jié)果一致。

3.3 碳源對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生與碳源的種類(lèi)和濃度相關(guān)[27]。碳源不僅可以提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓[28]，幫助培養(yǎng)物吸收培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和水分[29]。本研究首次以松三糖作為碳源，最適濃度為1.5 g/L，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到40%，高于吳麗君[4]、胡繼文等[5]的研究結(jié)果，對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)有明顯促進(jìn)作用，但成本較高，不適合應(yīng)用在規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)過(guò)程中。蔗糖和麥芽糖是組織培養(yǎng)中常用的碳源[30]，蔗糖和麥芽糖最適濃度均為30 g/L，麥芽糖最高誘導(dǎo)率為30%，蔗糖最高誘導(dǎo)率僅為20%。但在前期試驗(yàn)中得到蔗糖最適濃度為30 g/L，誘導(dǎo)率可達(dá)30%以上，這可能是受試驗(yàn)材料的影響。麥芽糖和蔗糖的誘導(dǎo)效果可達(dá)到相近，而蔗糖成本更低，因此，本研究中添加30 g/L的蔗糖作為碳源。高芳[31]在紅松愈傷組織誘導(dǎo)中得到蔗糖濃度不僅影響誘導(dǎo)率，還與胚性愈傷組織的褐化有關(guān)，添加35 g/L的蔗糖胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且褐化率最低。

3.4 濕地松合子胚發(fā)育階段劃分及內(nèi)源激素變化

本研究參考火炬松合子胚發(fā)育時(shí)期的劃分方法將濕地松合子胚劃分為8個(gè)發(fā)育時(shí)期，模擬并分析8個(gè)時(shí)期的4 種內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，結(jié)果顯示：隨著濕地松未成熟合子胚逐漸發(fā)育至成熟，ABA 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與紅松[32]和楸樹(shù)[33]的內(nèi)源ABA 含量變化趨勢(shì)一致；IAA 呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)；ZR和GA3的含量較低，呈平穩(wěn)波動(dòng)狀態(tài)。

ABA是一種較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制劑，對(duì)生長(zhǎng)的作用與IAA相反。在種子胚發(fā)育期間，內(nèi)源ABA可促進(jìn)胚正常發(fā)育成熟以及抑制胚過(guò)早萌發(fā)，ABA 在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)貯藏蛋白質(zhì)的合成[34]。在針葉樹(shù)的胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)添加適量的外源ABA，能夠提高胚性愈傷組織的啟動(dòng)速率[12,34]。Yang等[35]也發(fā)現(xiàn)在濕地松誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1～2 mg/L ABA提高了胚性愈傷組織的平均啟動(dòng)速率。本實(shí)驗(yàn)中合子胚內(nèi)源ABA含量與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，推測(cè)可能是因?yàn)锳BA促進(jìn)貯藏蛋白質(zhì)的合成，貯藏蛋白質(zhì)在胚性愈傷組織的形成過(guò)程中有重要作用。

3.5 其他添加物對(duì)濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

另外本研究還發(fā)現(xiàn)：添加3.0 g/L 結(jié)冷膠的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于添加6.0 g/L 結(jié)冷膠。隨著外源添加硝酸銀濃度的增加，濕地松體胚誘導(dǎo)率逐漸下降。這與Jain 等[36]研究結(jié)果一致，在北美云杉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3，明顯降低了胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，還會(huì)抑制體胚的成熟。但與Pullman等[12]觀(guān)點(diǎn)相反。這可能是不同樹(shù)種和外植體導(dǎo)致的差異。

3.6 結(jié)論

在江西中部地區(qū)于7 月中上旬選取處于多胚頭、裂生多胚及球形胚發(fā)育時(shí)期的2～4 階段的濕地松未成熟合子胚作為外植體較好；不同基因型未成熟合子胚同一時(shí)間發(fā)育時(shí)期不同，且在不同發(fā)育時(shí)期合子胚的內(nèi)源激素呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，其中內(nèi)源激素ABA對(duì)濕地松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要調(diào)控作用；外源激素和碳源等因子影響濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)，考慮到成本，以DCR 作為基本培養(yǎng)基，激素水平為2.2 mg/L KT+2.2 mg/L 2，4-D+2.2 mg/L 6-BA，30 g/L蔗糖為碳源，在（23±1）oC溫度條件下培養(yǎng)7周，是濕地松胚性愈傷組織誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)體系。在今后需加強(qiáng)體胚發(fā)生機(jī)理的研究，尤其是胚性細(xì)胞同步化，構(gòu)建濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生的高效穩(wěn)定培養(yǎng)體系。