大孔樹脂純化裸花紫珠總?cè)乒に囇芯?/h1>
2021-11-18 13:23:56柯春山吳少福李書飛洪艷平
江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2021年5期
柯春山，吳少福，彭 鵬，李 麟，李書飛，洪艷平*
（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/江西省畜禽疫病診斷與防控重點實驗室，江西 南昌 330045）
【研究意義】裸花紫珠（Callicarpa nudifloraHook.et Arn.）為馬鞭草科紫珠屬植物，常為灌木或小喬木，國內(nèi)主要分布于海南、廣西、廣東等地，國外主要分布在新加坡、中南半島、馬來半島和印度等地，是一種海南大宗性地道藥材，同時也是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一[1]。據(jù)《本草拾遺》記載，裸花紫珠以干燥入藥，具有止血鎮(zhèn)痛、散瘀消腫、抗菌消炎和驅(qū)風(fēng)等功效而用于治療癰疽、喉痹和毒腫等病癥，主治急性傳染性肝炎、呼吸道及消化道出血、創(chuàng)傷出血以及化膿性炎癥等，外用治療外傷出血及燒、燙傷等[2-3]。三萜是由30 個碳原子組成的萜類化合物，這些化合物廣泛分布于自然界中的蕨類植物、真菌、雙子葉植物、單子葉植物、動物以及海洋生物中。三萜類化合物根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異分為五環(huán)三萜、四環(huán)三萜、三環(huán)三萜、雙環(huán)三萜、單環(huán)三萜以及鏈狀三萜等。三萜類化合物具有抗病毒、防治疾病、抗癌、抗過敏和降血糖等重要的生物活性[4-5]，因此被廣泛應(yīng)用于功能性食品和藥品之中。迄今為止，對裸花紫珠所含單體成分的研究顯示，其主要化學(xué)成分為黃酮和三萜及其苷、環(huán)烯醚萜和苯丙素苷等。其中，三萜化合物以齊墩果烷型和烏蘇烷型三萜為基本骨架的五環(huán)三萜酸及其苷類較多[6-9]，如齊墩果酸、熊果酸、科羅索酸、2α,3α,19α-三羥基-烏索烷-12-烯-28-酸、烏蘇-12-烯-3β-醇、2α,3α,24-三羥基-齊墩果烷-12-烯-28-酸、2α,3α,19α-三羥基-烏索烷-12-烯-28-O-β-D-葡萄糖苷、2α,3α,19α,23-四羥基-齊墩果烷-12-烯-28-O-β-D-葡萄糖苷等。【前人研究進(jìn)展】近年來，大孔吸附樹脂成為實驗室和工業(yè)上中草藥粗提物分離純化的熱點分離材料，被廣泛應(yīng)用于黃酮、多酚及三萜等天然活性化合物的分離純化[10]。大孔吸附樹脂屬高分子吸附劑，是一類不帶離子交換基團(tuán)而且具有大孔結(jié)構(gòu)的多孔性交聯(lián)聚合物，有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及較高的比表面積，它通過分子間作用力或者氫鍵等作用實現(xiàn)被分離活性成分的選擇性吸附，然后在一定條件下洗脫而達(dá)到分離純化的目的[11-12]。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、有效成分損失少、成本低、雜質(zhì)去除率高、吸附速度快、選擇性強、易再生、機(jī)械強度大等優(yōu)點[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，文獻(xiàn)調(diào)研顯示，有裸花紫珠中化學(xué)成分及藥理作用[15]和裸花紫珠總黃酮分離純化[16]以及裸花紫珠總皂苷的提取工藝[17]等方面的研究，但針對裸花紫珠總?cè)频姆蛛x純化研究卻鮮有報道；大孔樹脂用于分離純化天然產(chǎn)物時可用靜態(tài)、動態(tài)吸附解吸進(jìn)行，且二者的分離純化效果有明顯差異。本試驗借鑒課題組前期開展的天然活性成分分離純化的工作經(jīng)驗，通過考察多種大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸率大小，篩選確定純化總?cè)频淖钸m工作樹脂；利用篩選的最適樹脂進(jìn)行裸花紫珠總?cè)旗o動態(tài)分離純化工藝研究，確定AB-8 大孔樹脂分離純化裸花紫珠總?cè)频淖罴压に嚄l件?！緮M解決的關(guān)鍵問題】大孔樹脂被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化，在實際的應(yīng)用過程中，樹脂的純化效果常因樹脂自身性質(zhì)、使用條件不同及被純化成分性質(zhì)的差異而受到影響，因此合適工作樹脂的優(yōu)選并獲得其最佳的純化工藝條件對于裸花紫珠總?cè)频臐撛趹?yīng)用具有一定的理論參考價值。
1 材料與方法
1.1 儀器設(shè)備與試驗材料
裸花紫珠葉為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育。試驗藥品：氫氧化鈉、鹽酸、高氯酸、冰醋酸、香草醛、無水乙醇皆為分析純，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)對照品（純度為98%，上海金穗生物科技有限公司），D-101、DM-21、HPD725、DM-2、X-5、AB-8、DM-21D、DM130、HPD-1000、DM-20、聚酰胺等樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司），可見光分光光度計（上海卓光儀器科技有限公司），電子天平（季爾國際貿(mào)易（上海）有限公司），數(shù)顯水浴鍋（國華電器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），pH 計（上海勇懿儀器儀表有限公司），高速粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）。
1.2 試驗方法
1.2.1 裸花紫珠總?cè)拼痔嵋旱闹苽?將裸花紫珠放入烘箱以70 ℃干燥一定時間，用高速粉碎機(jī)粉碎。準(zhǔn)確稱取一定量的粉碎的裸花紫珠葉于圓底燒瓶中，以料液比1∶14 加入無水乙醇，在80 ℃下水浴3 h，浸提2次。收集浸提液，減壓濃縮，干燥，備用。
1.2.2 裸花紫珠總?cè)坪繙y定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
精確稱取4.0 mg齊墩果酸標(biāo)品，無水乙醇定容至50 mL（質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL）。分別準(zhǔn)確移取一定量對照品溶液于試管中，加入0.2 mL新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸充分搖勻，與試管架一并置于恒溫水浴鍋中60 ℃水浴加熱15 min，待冷卻至室溫后加入冰乙酸并定容至5 mL搖勻待測[18]。分光光度計掃描顯示齊墩果酸最大吸收波長在560 nm 處[19]。而后分別準(zhǔn)確移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 對照品溶液于試管中按上述方法處理，空白對照為不加對照品溶液的平行試管，分光光度計設(shè)定560 nm 并分別測定各試管溶液吸光度，分別以吸光度（A）和齊墩果酸質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為：y=0.104 6x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，齊墩果酸在0.016～0.096 mg質(zhì)量范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
（2）總?cè)坪康挠嬎恪?/p>
按下列計算公式稱取m 克裸花紫珠提取化合物用40%乙醇溶液定容至100 mL，精確量取V mL 按1.2.2（1）中方法顯色，在560 nm處測定其吸光度A，根據(jù)回歸方程計算三萜含量。
1.2.3 不同型號大孔樹脂吸附解吸性能研究（1）樹脂的預(yù)處理。將大孔樹脂D-101、HPD-725、AB-8、DM-21、DM-130、DM21D、HPD-1000、DM-2、X-5、聚酰胺和DM20用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸泡24 h后用蒸餾水沖洗直至無醇味。然后經(jīng)5%的氫氧化鈉溶液浸泡后用蒸餾水洗至中性，再用4%的鹽酸溶液浸泡并用蒸餾水洗至中性，備用。
（2）最佳實驗樹脂的選擇。分別稱取活化處理后的大孔樹脂（D-101、HPD-725、AB-8、DM-21、DM-130、DM21D、HPD-1000、DM-2、X-5、聚酰胺、DM20）4 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入pH 4.0吸光值A(chǔ)0裸花紫珠粗提液20 mL蓋緊瓶塞。在搖床中放置24 h，吸取上清液測定其吸光值A(chǔ)1。將充分吸飽的樹脂抽濾至干，各稱取5 g 置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL pH 4.0 的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液在搖床中解吸24 h，吸取上清液測定其吸光值A(chǔ)2，按下列公式計算各樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率。
1.2.4 AB-8 型大孔樹脂靜態(tài)純化工藝研究（1）靜態(tài)吸附。稱取4 g AB-8 樹脂于250 mL 具塞三角瓶中，加入20 mL 濃度相同的三萜粗提液，在不同溫度和不同pH 條件下，在搖床中放置不同時間后測定溶液中的三萜含量，按1.2.3（2）中方法計算吸附率。通過單因素實驗分別研究溫度、pH 以及吸附時間對AB-8樹脂靜態(tài)吸附效果的影響。
（2）靜態(tài)解吸。稱取吸附飽和的AB-8 樹脂4 g 于250 mL 具塞三角瓶中，加入20 mL 不同濃度乙醇溶液，在不同溫度和pH 條件下，置于搖床中靜態(tài)解吸不同時間后測定溶液中的三萜含量，計算解吸率。通過單因素實驗分別研究溫度、pH、解吸時間以及乙醇濃度對AB-8靜態(tài)解吸效果的影響。
（3）正交試驗。在上述單因素試驗基礎(chǔ)上按L9（33）設(shè)計進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出AB-8 吸附總?cè)频墓に嚄l件，因素水平分別見表1和表2。
表1 總?cè)旗o態(tài)吸附正交試驗因素水平Tab.1 Factors of the orthogonal test applied in static adsorption of total triterpenes
表2 總?cè)旗o態(tài)解吸正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal test applied in static desorption of total triterpenes
1.2.5 AB-8大孔樹脂動態(tài)純化工藝研究（1）動態(tài)吸附。稱取10 g AB-8樹脂濕法裝柱，在室溫下以不同濃度及不同流速的裸花紫珠三萜溶液上樣吸附，定量收集三萜流出液，并測定三萜流出液濃度，通過單因素試驗分別研究上樣液濃度、流速對AB-8樹脂動態(tài)吸附效果的影響。
（2）動態(tài)解吸。稱取10 g 吸附飽和的AB-8 樹脂濕法上柱，在室溫下用不同濃度的乙醇溶液以不同流速進(jìn)行解吸，定量收集解吸液，并測定解吸液濃度，當(dāng)前后解吸液濃度基本不變時定為洗脫終點。通過單因素實驗分別研究乙醇濃度和流速對AB-8樹脂動態(tài)解吸效果的影響。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
分光光度計掃描顯示齊墩果酸最大吸收波長為560 nm，線性回歸方程為：y=0.104 6x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，齊墩果酸在0.016～0.096 mg內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1）。
圖1 齊墩果酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the reference oleanolic acid
2.2 最佳樹脂的選擇
由表3可知11種樹脂對三萜均有一定的吸附性能，其中AB-8和DM-21相對其他樹脂而言，其吸附率較高，但綜合考慮其解吸率，AB-8 樹脂對三萜的解吸率高于DM21，故選擇AB-8為本試驗的最佳吸附樹脂。
表3 11種樹脂對裸花紫珠總?cè)旗o態(tài)吸附和解吸特性Tab.3 Static adsorption and desorption characteristics of 11 kinds of resins for the total triterpenes of Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.
2.3 AB-8型樹脂對裸花紫珠三萜靜態(tài)吸附與解吸特性
2.3.1 靜態(tài)吸附 由圖2 可知，隨時間的延長三萜吸附率不斷增大，在6 h后吸附率基本不變，由此可知大孔樹脂已基本達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，故選擇6 h為較適合的吸附時間。
圖2 吸附時間對吸附效果的影響圖Fig.2 Effect of adsorption time on adsorption of total triterpenes
大多數(shù)五環(huán)三萜苷元因其結(jié)構(gòu)骨架中含有羧基而呈現(xiàn)出一定的酸性，因此隨著pH 的上升，三萜類化合物在水中的溶解性增大，物質(zhì)在溶液中以不同的形式（中性分子或離子）存在最終影響其在大孔樹脂中的擴(kuò)散速度，從而導(dǎo)致吸附效果產(chǎn)生變化[20]。結(jié)果如圖3 所示，在pH 低于7 的范圍內(nèi)，隨著pH 的增大，AB-8 型樹脂對三萜的吸附率呈先上升后下降的趨勢，在溶液pH=6 時達(dá)到較佳吸附，故確定溶液pH=6 時為較佳吸附pH值。
圖3 溶液pH對吸附效果的影響Fig.3 Effect of pH on adsorption of total triterpenes
圖4結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)厣邷囟扔欣跇渲瑢θ频奈?，但溫度過高時反而降低樹脂對三萜的吸附性能，原因可能為：其一，較高溫度下皂苷分子的運動加劇，導(dǎo)致分子難以吸附在樹脂表面而使三萜吸附下降；第二，溫度升高相應(yīng)地增大了溶液中三萜的溶解度，從而導(dǎo)致樹脂對三萜的吸附效果下降。因此，在本試驗的吸附過程中，在35 ℃吸附效果較好。
圖4 吸附溫度對吸附效果的影響Fig.4 Effect of temperature on adsorption of total triterpenes
2.3.2 靜態(tài)解吸 如圖5 結(jié)果顯示，隨著解吸時間的增加，解吸液的吸光度不斷增大，當(dāng)解吸時間超過6 h后，吸光度有微弱的下降。由此可知，解吸6 h時已達(dá)最大解吸率，故選擇解吸最佳解吸時間為6 h。
圖5 解吸時間對解吸效果的影響Fig.5 Effect of time on the desorption of total triterpenes
由圖6 可知，解吸液的吸光度隨解吸溫度的升高而增大，但當(dāng)溫度超過55 ℃時，解吸液吸光度呈下降趨勢。原因可能是溫度的升高使吸附在樹脂上非三萜成分被解吸，導(dǎo)致單位體積溶液中三萜含量降低，使得吸光度呈下降趨勢。由此認(rèn)為55 ℃為最佳解吸溫度。
圖6 解吸溫度對解吸效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the desorption of total triterpenes
如圖7 所示，隨著溶液pH 的增大，吸光度逐漸減小，說明隨著pH的增大解吸效果減弱。因此確定最佳解吸液pH為2。
圖7 pH對解吸效果的影響Fig.7 Effect of pH on the desorption of total triterpenes
由圖8 結(jié)果表明，解吸液吸光度與乙醇濃度呈正相關(guān)，說明乙醇濃度的升高有利于醇溶性三萜化合物的解吸，也說明裸花紫珠中三萜化合物的存在形式主要為油溶性較好的三萜皂苷元。故確定最佳解吸液乙醇濃度為100%。
圖8 乙醇濃度對解吸效果的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the desorption of total triterpenes
2.3.3 正交試驗（1）靜態(tài)吸附正交試驗。由表4極差分析可知，各因素對樹脂吸附效果影響程度由大到小依次為溫度，時間和溶液pH，表5 方差分析結(jié)果表明，各因素之間差異不顯著，綜合極差分析、方差分析分析結(jié)果，AB-8 對裸花紫珠總?cè)频淖罴盐綏l件為A2B1C3。由此綜合考慮，確定AB-8 型樹脂最佳靜態(tài)吸附條件時間8 h，溶液pH為5，溫度35 ℃。
表4 靜態(tài)吸附正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理Tab.4 Orthogonal experimental design and data processing of static adsorption
表5 靜態(tài)吸附正交設(shè)計方差分析Tab.5 Variance analysis of static adsorption based on the orthogonal design
（2）靜態(tài)解吸正交試驗。由表6、7分析可知，各因素對樹脂解吸效果影響的程度由大到小依次為解吸溫度，溶液pH和解吸時間。綜合極差分析、方差分析結(jié)果可知，AB-8對裸花紫珠總?cè)频淖罴盐綏l件為A2B1C3，但考慮解吸時間對總?cè)平馕挠绊懽钚?，同時縮短時間有利于分離效率的提高，由此確定AB-8型樹脂最佳靜態(tài)解吸條件為A2B1C1，即：解吸時間4 h，解吸溶液pH為2，解吸溫度55 ℃，乙醇濃度100%。
表6 靜態(tài)解吸正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理Tab.6 Orthogonal experimental design and data processing of static desorption
表7 靜態(tài)解吸正交設(shè)計方差分析Tab.7 Variance analysis of static desorption based on orthogonal design
2.4 AB-8型樹脂對裸花紫珠總?cè)苿討B(tài)吸附與解吸特性
2.4.1 上樣液濃度對AB-8 型樹脂動態(tài)吸附性能的影響 由表8 可知，不同濃度的總?cè)埔掖既芤海╒乙醇∶V水=2∶3）以2 mL/min 流速流過樹脂柱后，泄漏點分別在18、32、54、90、180 mL 處。隨著上樣液濃度升高，泄露時間逐漸變短，且上樣液濃度較低時，泄露時間較長，樹脂吸收效果越好。但若上樣液濃度過高，泄露過早，會使上樣液處理量減少，不利于樹脂吸收；而當(dāng)上樣液濃度過低則導(dǎo)致工作效率下降。當(dāng)上樣液濃度為1.5 mg/mL 時，吸附泄漏點和泄露時間較為合理，故確定最佳上樣液濃度為1.5 mg/mL。
表8 上樣液濃度對AB-8型樹脂動態(tài)吸附性能的影響Tab.8 Effect of sample concentration on the dynamic adsorption of total triterpenes on AB-8 resin
2.4.2 上樣液流速對AB-8 型樹脂動態(tài)吸附性能的影響 由表9 可得，上樣流速為1 mL/min 時，泄漏點出現(xiàn)最晚，處理量最大；流速為2、3 和4 mL/min 時，泄漏點和處理量居中；流速為5 mL/min 時，泄漏點出現(xiàn)最早，處理量最小。這是由于流速小時，原液能夠更充分地與樹脂接觸，從而有利于樹脂吸附，提高吸附效果，因此流速較慢的上樣流速更有利于樹脂吸附，但流速過小則導(dǎo)致工作時間過長，分離效率低，綜合考慮吸附效果與工作效率，故選定3 mL/min為最佳上樣流速。
表9 上樣液流速對AB-8型樹脂動態(tài)吸附性能的影響Tab.9 Effect of sample flow rate on dynamic adsorption of total triterpenes on AB-8 resin
2.4.3 乙醇濃度對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響 由圖9可知，當(dāng)洗脫劑乙醇濃度為100%時，洗脫效果最好，隨著洗脫劑乙醇濃度的下降，洗脫效果逐漸減弱，當(dāng)乙醇濃度下降至60%時，洗脫能力較弱，洗脫中后期所得三萜洗脫液濃度基本不變。故選用100%的乙醇為最佳洗脫劑。
圖9 洗脫劑乙醇濃度對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響Fig.9 Effect of ethanol concentration on dynamic desorption of total triterpenes from AB-8 resin
2.4.4 洗脫劑流速對AB-8 型樹脂動態(tài)解吸性能的影響 由表10 所示，洗脫劑流速的變化對洗脫終點的影響并非十分顯著，洗脫劑流速過大使洗脫劑不能充分與樹脂吸附的三萜化合物發(fā)生物質(zhì)交換，從而使洗脫終點提前，解吸效果減弱；流速過小會導(dǎo)致洗脫時間過長、工作效率降低，且對洗脫效果的提升并不顯著。綜合考慮洗脫效果與工作效率，確定3 mL/min 為最佳洗脫劑流速。
表10 洗脫劑流速對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響Tab10 Effect of eluent flow rate on dynamic desorption of total triterpenes from AB-8 resin
3 結(jié)論
通過對所選11 種樹脂對裸花紫珠三萜吸附與解吸性能進(jìn)行優(yōu)選，篩選出最適于裸花紫珠三萜化合物吸附與解吸的樹脂為AB-8，靜態(tài)吸附率為43.17%，靜態(tài)解吸率為81.15%。在優(yōu)選出影響AB-8樹脂靜動態(tài)吸附與解吸裸花紫珠三萜單因素條件下進(jìn)行正交試驗，確定AB-8樹脂純化裸花紫珠三萜的最佳工藝條件為：（1）靜態(tài)吸附：吸附pH5，吸附溫度35 ℃、吸附時間8 h；（2）靜態(tài)解吸：洗脫時間4 h，洗脫溫度55 ℃，pH2的無水乙醇；（3）動態(tài)吸附：濃度1.5 mg/mL 40%的乙醇溶液，流速3 mL/min上樣；（4）動態(tài)解吸：流速3 mL/min 的無水乙醇洗脫。在此條件下純化，靜態(tài)純化后所得固形物中總?cè)坪浚?8.11%）較純化前提高3.96倍，動態(tài)純化后所得固形物中總?cè)坪浚?1.33%）較純化前提高4.42 倍，且純化前后溶液由渾濁變?yōu)槌吻澹▓D10）。說明AB-8型大孔樹脂對裸花紫珠三萜具有一定的純化作用，具備一定的應(yīng)用前景。
圖10 三萜溶液純化前（a）及純化后（b）的顏色對比Fig.10 Colorof untreated triterpene solution（a）with respect to the purified one（b）
猜你喜歡
米諾環(huán)素聯(lián)合裸花紫珠治療痤瘡的療效及不良反應(yīng)分析皮膚病與性病(2021年3期)2021-07-30 08:07:50 澤瀉原三萜、降三萜和倍半萜的分離及其抗炎活性研究世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:31:28 HS-SPME-GC-MS法分析裸花紫珠不同部位揮發(fā)性成分中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:24 響應(yīng)面法優(yōu)化裸花紫珠葉中苯乙醇苷的醇提取工藝天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年3期)2018-05-07 06:38:54 佩氏靈芝中三個新三萜天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2016年1期)2016-06-05 10:29:25 茯苓皮總?cè)频瓮柚苽涔に嚨膬?yōu)化中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:08:05 刺梨三萜對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響食品科學(xué)(2013年13期)2013-03-11 18:24:34 裸花紫珠片致過敏反應(yīng)1例長江大學(xué)學(xué)報(自科版)(2013年33期)2013-03-11 15:08:24 裸花紫珠、大葉紫珠和廣東紫珠的研究進(jìn)展中國醫(yī)藥導(dǎo)報(2011年29期)2011-02-21 09:22:19 錫類散外敷合裸花紫珠片內(nèi)服治療小兒鼻出血１２０例浙江中醫(yī)雜志(2004年5期)2004-03-09 08:31:02
柯春山，吳少福，彭 鵬，李 麟，李書飛，洪艷平*
（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/江西省畜禽疫病診斷與防控重點實驗室，江西 南昌 330045）
【研究意義】裸花紫珠（Callicarpa nudifloraHook.et Arn.）為馬鞭草科紫珠屬植物，常為灌木或小喬木，國內(nèi)主要分布于海南、廣西、廣東等地，國外主要分布在新加坡、中南半島、馬來半島和印度等地，是一種海南大宗性地道藥材，同時也是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一[1]。據(jù)《本草拾遺》記載，裸花紫珠以干燥入藥，具有止血鎮(zhèn)痛、散瘀消腫、抗菌消炎和驅(qū)風(fēng)等功效而用于治療癰疽、喉痹和毒腫等病癥，主治急性傳染性肝炎、呼吸道及消化道出血、創(chuàng)傷出血以及化膿性炎癥等，外用治療外傷出血及燒、燙傷等[2-3]。三萜是由30 個碳原子組成的萜類化合物，這些化合物廣泛分布于自然界中的蕨類植物、真菌、雙子葉植物、單子葉植物、動物以及海洋生物中。三萜類化合物根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異分為五環(huán)三萜、四環(huán)三萜、三環(huán)三萜、雙環(huán)三萜、單環(huán)三萜以及鏈狀三萜等。三萜類化合物具有抗病毒、防治疾病、抗癌、抗過敏和降血糖等重要的生物活性[4-5]，因此被廣泛應(yīng)用于功能性食品和藥品之中。迄今為止，對裸花紫珠所含單體成分的研究顯示，其主要化學(xué)成分為黃酮和三萜及其苷、環(huán)烯醚萜和苯丙素苷等。其中，三萜化合物以齊墩果烷型和烏蘇烷型三萜為基本骨架的五環(huán)三萜酸及其苷類較多[6-9]，如齊墩果酸、熊果酸、科羅索酸、2α,3α,19α-三羥基-烏索烷-12-烯-28-酸、烏蘇-12-烯-3β-醇、2α,3α,24-三羥基-齊墩果烷-12-烯-28-酸、2α,3α,19α-三羥基-烏索烷-12-烯-28-O-β-D-葡萄糖苷、2α,3α,19α,23-四羥基-齊墩果烷-12-烯-28-O-β-D-葡萄糖苷等。【前人研究進(jìn)展】近年來，大孔吸附樹脂成為實驗室和工業(yè)上中草藥粗提物分離純化的熱點分離材料，被廣泛應(yīng)用于黃酮、多酚及三萜等天然活性化合物的分離純化[10]。大孔吸附樹脂屬高分子吸附劑，是一類不帶離子交換基團(tuán)而且具有大孔結(jié)構(gòu)的多孔性交聯(lián)聚合物，有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及較高的比表面積，它通過分子間作用力或者氫鍵等作用實現(xiàn)被分離活性成分的選擇性吸附，然后在一定條件下洗脫而達(dá)到分離純化的目的[11-12]。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、有效成分損失少、成本低、雜質(zhì)去除率高、吸附速度快、選擇性強、易再生、機(jī)械強度大等優(yōu)點[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，文獻(xiàn)調(diào)研顯示，有裸花紫珠中化學(xué)成分及藥理作用[15]和裸花紫珠總黃酮分離純化[16]以及裸花紫珠總皂苷的提取工藝[17]等方面的研究，但針對裸花紫珠總?cè)频姆蛛x純化研究卻鮮有報道；大孔樹脂用于分離純化天然產(chǎn)物時可用靜態(tài)、動態(tài)吸附解吸進(jìn)行，且二者的分離純化效果有明顯差異。本試驗借鑒課題組前期開展的天然活性成分分離純化的工作經(jīng)驗，通過考察多種大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸率大小，篩選確定純化總?cè)频淖钸m工作樹脂；利用篩選的最適樹脂進(jìn)行裸花紫珠總?cè)旗o動態(tài)分離純化工藝研究，確定AB-8 大孔樹脂分離純化裸花紫珠總?cè)频淖罴压に嚄l件?！緮M解決的關(guān)鍵問題】大孔樹脂被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化，在實際的應(yīng)用過程中，樹脂的純化效果常因樹脂自身性質(zhì)、使用條件不同及被純化成分性質(zhì)的差異而受到影響，因此合適工作樹脂的優(yōu)選并獲得其最佳的純化工藝條件對于裸花紫珠總?cè)频臐撛趹?yīng)用具有一定的理論參考價值。
1 材料與方法
1.1 儀器設(shè)備與試驗材料
裸花紫珠葉為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育。試驗藥品：氫氧化鈉、鹽酸、高氯酸、冰醋酸、香草醛、無水乙醇皆為分析純，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)對照品（純度為98%，上海金穗生物科技有限公司），D-101、DM-21、HPD725、DM-2、X-5、AB-8、DM-21D、DM130、HPD-1000、DM-20、聚酰胺等樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司），可見光分光光度計（上海卓光儀器科技有限公司），電子天平（季爾國際貿(mào)易（上海）有限公司），數(shù)顯水浴鍋（國華電器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），pH 計（上海勇懿儀器儀表有限公司），高速粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）。
1.2 試驗方法
1.2.1 裸花紫珠總?cè)拼痔嵋旱闹苽?將裸花紫珠放入烘箱以70 ℃干燥一定時間，用高速粉碎機(jī)粉碎。準(zhǔn)確稱取一定量的粉碎的裸花紫珠葉于圓底燒瓶中，以料液比1∶14 加入無水乙醇，在80 ℃下水浴3 h，浸提2次。收集浸提液，減壓濃縮，干燥，備用。
1.2.2 裸花紫珠總?cè)坪繙y定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
精確稱取4.0 mg齊墩果酸標(biāo)品，無水乙醇定容至50 mL（質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL）。分別準(zhǔn)確移取一定量對照品溶液于試管中，加入0.2 mL新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸充分搖勻，與試管架一并置于恒溫水浴鍋中60 ℃水浴加熱15 min，待冷卻至室溫后加入冰乙酸并定容至5 mL搖勻待測[18]。分光光度計掃描顯示齊墩果酸最大吸收波長在560 nm 處[19]。而后分別準(zhǔn)確移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 對照品溶液于試管中按上述方法處理，空白對照為不加對照品溶液的平行試管，分光光度計設(shè)定560 nm 并分別測定各試管溶液吸光度，分別以吸光度（A）和齊墩果酸質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為：y=0.104 6x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，齊墩果酸在0.016～0.096 mg質(zhì)量范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
（2）總?cè)坪康挠嬎恪?/p>
按下列計算公式稱取m 克裸花紫珠提取化合物用40%乙醇溶液定容至100 mL，精確量取V mL 按1.2.2（1）中方法顯色，在560 nm處測定其吸光度A，根據(jù)回歸方程計算三萜含量。
1.2.3 不同型號大孔樹脂吸附解吸性能研究（1）樹脂的預(yù)處理。將大孔樹脂D-101、HPD-725、AB-8、DM-21、DM-130、DM21D、HPD-1000、DM-2、X-5、聚酰胺和DM20用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸泡24 h后用蒸餾水沖洗直至無醇味。然后經(jīng)5%的氫氧化鈉溶液浸泡后用蒸餾水洗至中性，再用4%的鹽酸溶液浸泡并用蒸餾水洗至中性，備用。
（2）最佳實驗樹脂的選擇。分別稱取活化處理后的大孔樹脂（D-101、HPD-725、AB-8、DM-21、DM-130、DM21D、HPD-1000、DM-2、X-5、聚酰胺、DM20）4 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入pH 4.0吸光值A(chǔ)0裸花紫珠粗提液20 mL蓋緊瓶塞。在搖床中放置24 h，吸取上清液測定其吸光值A(chǔ)1。將充分吸飽的樹脂抽濾至干，各稱取5 g 置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL pH 4.0 的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液在搖床中解吸24 h，吸取上清液測定其吸光值A(chǔ)2，按下列公式計算各樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率。
1.2.4 AB-8 型大孔樹脂靜態(tài)純化工藝研究（1）靜態(tài)吸附。稱取4 g AB-8 樹脂于250 mL 具塞三角瓶中，加入20 mL 濃度相同的三萜粗提液，在不同溫度和不同pH 條件下，在搖床中放置不同時間后測定溶液中的三萜含量，按1.2.3（2）中方法計算吸附率。通過單因素實驗分別研究溫度、pH 以及吸附時間對AB-8樹脂靜態(tài)吸附效果的影響。
（2）靜態(tài)解吸。稱取吸附飽和的AB-8 樹脂4 g 于250 mL 具塞三角瓶中，加入20 mL 不同濃度乙醇溶液，在不同溫度和pH 條件下，置于搖床中靜態(tài)解吸不同時間后測定溶液中的三萜含量，計算解吸率。通過單因素實驗分別研究溫度、pH、解吸時間以及乙醇濃度對AB-8靜態(tài)解吸效果的影響。
（3）正交試驗。在上述單因素試驗基礎(chǔ)上按L9（33）設(shè)計進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出AB-8 吸附總?cè)频墓に嚄l件，因素水平分別見表1和表2。
表1 總?cè)旗o態(tài)吸附正交試驗因素水平Tab.1 Factors of the orthogonal test applied in static adsorption of total triterpenes
表2 總?cè)旗o態(tài)解吸正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal test applied in static desorption of total triterpenes
1.2.5 AB-8大孔樹脂動態(tài)純化工藝研究（1）動態(tài)吸附。稱取10 g AB-8樹脂濕法裝柱，在室溫下以不同濃度及不同流速的裸花紫珠三萜溶液上樣吸附，定量收集三萜流出液，并測定三萜流出液濃度，通過單因素試驗分別研究上樣液濃度、流速對AB-8樹脂動態(tài)吸附效果的影響。
（2）動態(tài)解吸。稱取10 g 吸附飽和的AB-8 樹脂濕法上柱，在室溫下用不同濃度的乙醇溶液以不同流速進(jìn)行解吸，定量收集解吸液，并測定解吸液濃度，當(dāng)前后解吸液濃度基本不變時定為洗脫終點。通過單因素實驗分別研究乙醇濃度和流速對AB-8樹脂動態(tài)解吸效果的影響。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
分光光度計掃描顯示齊墩果酸最大吸收波長為560 nm，線性回歸方程為：y=0.104 6x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，齊墩果酸在0.016～0.096 mg內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1）。
圖1 齊墩果酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the reference oleanolic acid
2.2 最佳樹脂的選擇
由表3可知11種樹脂對三萜均有一定的吸附性能，其中AB-8和DM-21相對其他樹脂而言，其吸附率較高，但綜合考慮其解吸率，AB-8 樹脂對三萜的解吸率高于DM21，故選擇AB-8為本試驗的最佳吸附樹脂。
表3 11種樹脂對裸花紫珠總?cè)旗o態(tài)吸附和解吸特性Tab.3 Static adsorption and desorption characteristics of 11 kinds of resins for the total triterpenes of Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.
2.3 AB-8型樹脂對裸花紫珠三萜靜態(tài)吸附與解吸特性
2.3.1 靜態(tài)吸附 由圖2 可知，隨時間的延長三萜吸附率不斷增大，在6 h后吸附率基本不變，由此可知大孔樹脂已基本達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，故選擇6 h為較適合的吸附時間。
圖2 吸附時間對吸附效果的影響圖Fig.2 Effect of adsorption time on adsorption of total triterpenes
大多數(shù)五環(huán)三萜苷元因其結(jié)構(gòu)骨架中含有羧基而呈現(xiàn)出一定的酸性，因此隨著pH 的上升，三萜類化合物在水中的溶解性增大，物質(zhì)在溶液中以不同的形式（中性分子或離子）存在最終影響其在大孔樹脂中的擴(kuò)散速度，從而導(dǎo)致吸附效果產(chǎn)生變化[20]。結(jié)果如圖3 所示，在pH 低于7 的范圍內(nèi)，隨著pH 的增大，AB-8 型樹脂對三萜的吸附率呈先上升后下降的趨勢，在溶液pH=6 時達(dá)到較佳吸附，故確定溶液pH=6 時為較佳吸附pH值。
圖3 溶液pH對吸附效果的影響Fig.3 Effect of pH on adsorption of total triterpenes
圖4結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)厣邷囟扔欣跇渲瑢θ频奈?，但溫度過高時反而降低樹脂對三萜的吸附性能，原因可能為：其一，較高溫度下皂苷分子的運動加劇，導(dǎo)致分子難以吸附在樹脂表面而使三萜吸附下降；第二，溫度升高相應(yīng)地增大了溶液中三萜的溶解度，從而導(dǎo)致樹脂對三萜的吸附效果下降。因此，在本試驗的吸附過程中，在35 ℃吸附效果較好。
圖4 吸附溫度對吸附效果的影響Fig.4 Effect of temperature on adsorption of total triterpenes
2.3.2 靜態(tài)解吸 如圖5 結(jié)果顯示，隨著解吸時間的增加，解吸液的吸光度不斷增大，當(dāng)解吸時間超過6 h后，吸光度有微弱的下降。由此可知，解吸6 h時已達(dá)最大解吸率，故選擇解吸最佳解吸時間為6 h。
圖5 解吸時間對解吸效果的影響Fig.5 Effect of time on the desorption of total triterpenes
由圖6 可知，解吸液的吸光度隨解吸溫度的升高而增大，但當(dāng)溫度超過55 ℃時，解吸液吸光度呈下降趨勢。原因可能是溫度的升高使吸附在樹脂上非三萜成分被解吸，導(dǎo)致單位體積溶液中三萜含量降低，使得吸光度呈下降趨勢。由此認(rèn)為55 ℃為最佳解吸溫度。
圖6 解吸溫度對解吸效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the desorption of total triterpenes
如圖7 所示，隨著溶液pH 的增大，吸光度逐漸減小，說明隨著pH的增大解吸效果減弱。因此確定最佳解吸液pH為2。
圖7 pH對解吸效果的影響Fig.7 Effect of pH on the desorption of total triterpenes
由圖8 結(jié)果表明，解吸液吸光度與乙醇濃度呈正相關(guān)，說明乙醇濃度的升高有利于醇溶性三萜化合物的解吸，也說明裸花紫珠中三萜化合物的存在形式主要為油溶性較好的三萜皂苷元。故確定最佳解吸液乙醇濃度為100%。
圖8 乙醇濃度對解吸效果的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the desorption of total triterpenes
2.3.3 正交試驗（1）靜態(tài)吸附正交試驗。由表4極差分析可知，各因素對樹脂吸附效果影響程度由大到小依次為溫度，時間和溶液pH，表5 方差分析結(jié)果表明，各因素之間差異不顯著，綜合極差分析、方差分析分析結(jié)果，AB-8 對裸花紫珠總?cè)频淖罴盐綏l件為A2B1C3。由此綜合考慮，確定AB-8 型樹脂最佳靜態(tài)吸附條件時間8 h，溶液pH為5，溫度35 ℃。
表4 靜態(tài)吸附正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理Tab.4 Orthogonal experimental design and data processing of static adsorption
表5 靜態(tài)吸附正交設(shè)計方差分析Tab.5 Variance analysis of static adsorption based on the orthogonal design
（2）靜態(tài)解吸正交試驗。由表6、7分析可知，各因素對樹脂解吸效果影響的程度由大到小依次為解吸溫度，溶液pH和解吸時間。綜合極差分析、方差分析結(jié)果可知，AB-8對裸花紫珠總?cè)频淖罴盐綏l件為A2B1C3，但考慮解吸時間對總?cè)平馕挠绊懽钚?，同時縮短時間有利于分離效率的提高，由此確定AB-8型樹脂最佳靜態(tài)解吸條件為A2B1C1，即：解吸時間4 h，解吸溶液pH為2，解吸溫度55 ℃，乙醇濃度100%。
表6 靜態(tài)解吸正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理Tab.6 Orthogonal experimental design and data processing of static desorption
表7 靜態(tài)解吸正交設(shè)計方差分析Tab.7 Variance analysis of static desorption based on orthogonal design
2.4 AB-8型樹脂對裸花紫珠總?cè)苿討B(tài)吸附與解吸特性
2.4.1 上樣液濃度對AB-8 型樹脂動態(tài)吸附性能的影響 由表8 可知，不同濃度的總?cè)埔掖既芤海╒乙醇∶V水=2∶3）以2 mL/min 流速流過樹脂柱后，泄漏點分別在18、32、54、90、180 mL 處。隨著上樣液濃度升高，泄露時間逐漸變短，且上樣液濃度較低時，泄露時間較長，樹脂吸收效果越好。但若上樣液濃度過高，泄露過早，會使上樣液處理量減少，不利于樹脂吸收；而當(dāng)上樣液濃度過低則導(dǎo)致工作效率下降。當(dāng)上樣液濃度為1.5 mg/mL 時，吸附泄漏點和泄露時間較為合理，故確定最佳上樣液濃度為1.5 mg/mL。
表8 上樣液濃度對AB-8型樹脂動態(tài)吸附性能的影響Tab.8 Effect of sample concentration on the dynamic adsorption of total triterpenes on AB-8 resin
2.4.2 上樣液流速對AB-8 型樹脂動態(tài)吸附性能的影響 由表9 可得，上樣流速為1 mL/min 時，泄漏點出現(xiàn)最晚，處理量最大；流速為2、3 和4 mL/min 時，泄漏點和處理量居中；流速為5 mL/min 時，泄漏點出現(xiàn)最早，處理量最小。這是由于流速小時，原液能夠更充分地與樹脂接觸，從而有利于樹脂吸附，提高吸附效果，因此流速較慢的上樣流速更有利于樹脂吸附，但流速過小則導(dǎo)致工作時間過長，分離效率低，綜合考慮吸附效果與工作效率，故選定3 mL/min為最佳上樣流速。
表9 上樣液流速對AB-8型樹脂動態(tài)吸附性能的影響Tab.9 Effect of sample flow rate on dynamic adsorption of total triterpenes on AB-8 resin
2.4.3 乙醇濃度對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響 由圖9可知，當(dāng)洗脫劑乙醇濃度為100%時，洗脫效果最好，隨著洗脫劑乙醇濃度的下降，洗脫效果逐漸減弱，當(dāng)乙醇濃度下降至60%時，洗脫能力較弱，洗脫中后期所得三萜洗脫液濃度基本不變。故選用100%的乙醇為最佳洗脫劑。
圖9 洗脫劑乙醇濃度對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響Fig.9 Effect of ethanol concentration on dynamic desorption of total triterpenes from AB-8 resin
2.4.4 洗脫劑流速對AB-8 型樹脂動態(tài)解吸性能的影響 由表10 所示，洗脫劑流速的變化對洗脫終點的影響并非十分顯著，洗脫劑流速過大使洗脫劑不能充分與樹脂吸附的三萜化合物發(fā)生物質(zhì)交換，從而使洗脫終點提前，解吸效果減弱；流速過小會導(dǎo)致洗脫時間過長、工作效率降低，且對洗脫效果的提升并不顯著。綜合考慮洗脫效果與工作效率，確定3 mL/min 為最佳洗脫劑流速。
表10 洗脫劑流速對AB-8型樹脂動態(tài)解吸性能的影響Tab10 Effect of eluent flow rate on dynamic desorption of total triterpenes from AB-8 resin
3 結(jié)論
通過對所選11 種樹脂對裸花紫珠三萜吸附與解吸性能進(jìn)行優(yōu)選，篩選出最適于裸花紫珠三萜化合物吸附與解吸的樹脂為AB-8，靜態(tài)吸附率為43.17%，靜態(tài)解吸率為81.15%。在優(yōu)選出影響AB-8樹脂靜動態(tài)吸附與解吸裸花紫珠三萜單因素條件下進(jìn)行正交試驗，確定AB-8樹脂純化裸花紫珠三萜的最佳工藝條件為：（1）靜態(tài)吸附：吸附pH5，吸附溫度35 ℃、吸附時間8 h；（2）靜態(tài)解吸：洗脫時間4 h，洗脫溫度55 ℃，pH2的無水乙醇；（3）動態(tài)吸附：濃度1.5 mg/mL 40%的乙醇溶液，流速3 mL/min上樣；（4）動態(tài)解吸：流速3 mL/min 的無水乙醇洗脫。在此條件下純化，靜態(tài)純化后所得固形物中總?cè)坪浚?8.11%）較純化前提高3.96倍，動態(tài)純化后所得固形物中總?cè)坪浚?1.33%）較純化前提高4.42 倍，且純化前后溶液由渾濁變?yōu)槌吻澹▓D10）。說明AB-8型大孔樹脂對裸花紫珠三萜具有一定的純化作用，具備一定的應(yīng)用前景。
圖10 三萜溶液純化前（a）及純化后（b）的顏色對比Fig.10 Colorof untreated triterpene solution（a）with respect to the purified one（b）
猜你喜歡
皮膚病與性病(2021年3期)2021-07-30 08:07:50
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:31:28
中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:24
天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2018年3期)2018-05-07 06:38:54
天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(2016年1期)2016-06-05 10:29:25
中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:08:05
食品科學(xué)(2013年13期)2013-03-11 18:24:34
長江大學(xué)學(xué)報(自科版)(2013年33期)2013-03-11 15:08:24
中國醫(yī)藥導(dǎo)報(2011年29期)2011-02-21 09:22:19
浙江中醫(yī)雜志(2004年5期)2004-03-09 08:31:02
