梔子栽培品種與近緣種的ITS2序列分析

鄧紹勇，李康琴，賈全全，陳宜均，朱培林，楊春霞

（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032）

【研究意義】我國天然分布梔子屬（Gardenia）植物有6 種[1]，其中僅梔子（G.jasminoides）分布廣泛且普遍栽培，它是重要的觀賞、藥用、色素和油用資源植物，有著悠久的栽培歷史[2]。梔子不僅是傳統(tǒng)的香花植物，深受人們喜愛，梔子的成熟干燥果實(shí)又是常用的大宗中藥材原料，入藥具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血散淤的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)梔子具有保肝、抗炎、鎮(zhèn)痛及改善心腦血管病等方面的作用[3]。開展梔子栽培品種和近緣種ITS2 序列變異程度、遺傳距離和親緣關(guān)系研究，為梔子屬植物品種鑒定、親緣關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，為梔子屬植物品種鑒定、遺傳育種及多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】梔子在長期的栽培利用過程中，形成了豐富穩(wěn)定的變異類型[4-5]。在形態(tài)組織方面，黃穎雅[6]研究了梔子和水梔子在組織構(gòu)造和粉末特征等方面的變異特征，楊雄志[7]研究了重瓣梔子、水梔子和梔子原種它們的根皮層中石細(xì)胞、莖纖維及草酸鈣柱晶、方晶和簇晶等的區(qū)別，戈群妹等[8]發(fā)現(xiàn)重瓣梔子花具有兩類非蜜腺的分泌結(jié)構(gòu)，鄧紹勇等[9]對梔子品種進(jìn)行了系統(tǒng)的分類整理，并從數(shù)量分類視角對梔子栽培品種與近緣種親緣關(guān)系進(jìn)行了探討[10]；在細(xì)胞學(xué)水平方面，楊兆起等[11]發(fā)現(xiàn)梔子和水梔子長短染色體構(gòu)成不同。郝大翠等[12]發(fā)現(xiàn)大花梔子、狹葉梔子和梔子的核型不同且花粉粒育性從低到高變化，花重瓣的觀賞型梔子有染色體數(shù)目加倍的現(xiàn)象；在分子水平方面，楊銳培[13]采用RAPD 標(biāo)記分析江西樟樹形態(tài)上區(qū)別明顯的14 個梔子樣品發(fā)現(xiàn)分子聚類結(jié)果和表型聚類結(jié)果類似，葛菲等[14]采用RAPD 標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)梔子與重瓣梔子親緣關(guān)系最近，與雀舌梔子親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。伍美慧等[15]發(fā)現(xiàn)通過matK引物擴(kuò)增的序列對梔子屬種內(nèi)和種間的鑒定成功率相對更高，認(rèn)為cpDNA 條形碼較適合梔子屬物種鑒別的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ITS2位于5.8S 和28S rRNA 之間，堿基信息較多且核苷酸順序變化較大，信息位點(diǎn)豐富。ITS2條形碼技術(shù)是當(dāng)前常見的分子鑒定技術(shù)之一，其片段普遍較短且在物種水平的變異較快，技術(shù)簡便高效，不受樣品形態(tài)性狀限制等優(yōu)點(diǎn)，在藥材真?zhèn)舞b定、親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化等研究中都有廣泛的應(yīng)用[16]。如吳波等[17]發(fā)現(xiàn)ITS2DNA 條形碼可以準(zhǔn)確有效地用于吳茱萸藥材3 種不同基原植物及偽品楝葉吳茱萸的親緣關(guān)系研究和真?zhèn)舞b別，陳鏡安等[18]研究得出其可作為鑒定竹節(jié)參與其非同屬混偽品DNA 條形碼之一，王麗芝等[16]同樣以ITS2序列分析探討了川芎的起源以及川芎種質(zhì)間的親緣關(guān)系。在對梔子進(jìn)行分類鑒定研究方面，前人除了采用形態(tài)及數(shù)量分類方法外，伍美慧等[15]楊中揚(yáng)等[19]采用國際通用的植物DNA 條形碼引物（ITS2、matK、rbcL及psbA-trnH）構(gòu)建了梔子的DNA 條形碼，黃易等[20]研究認(rèn)為ITS2序列較適用于梔子及其近緣茜草科植物、混偽品物種的鑒別。因此，采用ITS2序列分析梔子栽培品種與近緣種的變異情況是很有必要的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以梔子18 個栽培品種和3 個近緣種共38 個樣品為研究對象，克服了前人對梔子資源DNA 條形碼鑒定研究中樣品過少、研究材料形態(tài)分類界定模糊等不足，通過PCR 擴(kuò)增及測序獲得ITS2 序列數(shù)據(jù)，系統(tǒng)探討了梔子栽培品種和近緣種的序列變異程度、遺傳距離和親緣關(guān)系，為梔子屬植物品種鑒定、親緣關(guān)系分析及品種起源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于云南、四川、廣西、湖南、江西、浙江和福建等省，除大黃梔子（G.sootepensis）外，均栽植保存于江西省林業(yè)科學(xué)院中藥資源圃內(nèi)，共有梔子18個栽培品種[9-10]和3個近緣種共38個樣品（表1）。試驗(yàn)材料均由鄧紹勇副研究員鑒定后，葉片用于DNA的提取。

表1 試驗(yàn)材料編號、名稱及來源Tab.1 The code，name and origin of Gardenia materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取 野外采集植株枝梢嫩葉，置于液氮罐內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。用Omega 植物基因組DNA 抽提試劑盒，按其說明步驟提取樣品的總DNA。DNA 濃度和質(zhì)量由分光光度計(jì)（Nanodrop ND-2000）（thermo electron corporation，USA）及10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，Lamda HindⅢMarker（Mbi Fermentas，Shenzhen，Guangdong，China）作為標(biāo)準(zhǔn)分子量。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測序 PCR 擴(kuò)增和測序的正向引物為5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，反向引物為5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-3′，PCR 反應(yīng)體系和程序參考黃易等[20]的具體方法，引物合成和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后的測序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序后的峰圖用CodonCode Aligner v6.0.1 進(jìn)行拼接校對，并將引物區(qū)剔除。采用Lasergene EditSeq 11.1 對所有樣品ITS2 序列的平均堿基組成百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用MEGA7.0（molecular evolutionary genetics analysis）進(jìn)行比對分析，統(tǒng)計(jì)保守位點(diǎn)數(shù)和變異位點(diǎn)等，基于K2P模型分析梔子栽培品種與近緣種的遺傳距離，用UPGMA 法構(gòu)建梔子栽培品種與近緣種的系統(tǒng)聚類樹，并以Bootstrap 方法（1000 次重復(fù)）檢驗(yàn)各分枝的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異程度分析

為分析梔子栽培品種間及與近緣種間的遺傳分化程度和差異大小，本研究采用EditSeq 11.1統(tǒng)計(jì)了38個樣品ITS2 片段的長度范圍和平均堿基組成百分比，分析結(jié)果見表2。狹葉梔子（G.stenophylla）和梔子的ITS2 序列長度均為347 bp，平均GC 含量為66.86%。大黃梔子序列長度為355 bp，GC 含量為67.61%。梔子栽培品種序列長度除‘燃葉’、‘金福水梔’為348 bp 外，其他品種序列長度和梔子一致，均為347 bp，GC 含量為66.28%～67.15%，其中‘白蟾’GC 含量最低（66.28%），‘金元’、‘分關(guān)1 號’、‘眾恒’、‘舞凝’、‘荷花’、‘水梔子’6 個品種GC 含量為66.57%，金福水梔GC 含量為66.62%，‘燃葉’GC 含量為66.67%，‘香雪’、‘大花梔子’、‘小白蟾’、‘花葉梔子’、‘金花梔子’、‘白盞’、‘寬棱水梔’7個品種GC 含量為66.86%，‘雀舌梔子’和‘銀邊雀舌’2個品種GC 含量最高（67.15%）。梔子栽培品種間及與近緣種間的平均GC 含量相差并不明顯。

表2 梔子栽培品種與近緣種ITS2片段的長度范圍、平均堿基組成Tab.2 Length range and average base composition of ITS2 fragment of cultivars and their related wild species in the genus Gardenia

用MEGA7.0對梔子栽培品種與近緣種38條ITS2 序列進(jìn)行對比分析，比對后共產(chǎn)生12個變異位點(diǎn)，10個堿基插入，各分析樣品的變異位點(diǎn)詳見表3。由表3可知，梔子和狹葉梔子種內(nèi)各有1個變異位點(diǎn)，‘金福水梔’品種內(nèi)有3 個變異位點(diǎn)；10 個堿基插入有8 個是大黃梔子所獨(dú)有的，且存在5 個特異的變異位點(diǎn)（分別是187，268，274，286，287 bp 處）。分析發(fā)現(xiàn)，一部分表型特征有共性的品種之間有共同的變異位點(diǎn)，如植株矮小、葉片小而窄長的品種‘雀舌梔子’和‘銀邊雀舌’在50 bp 處，果實(shí)相對較大的品種‘分關(guān)1 號’、‘金福水梔’和‘金元’在84 bp 處等。一些品種還具有特異的變異位點(diǎn)，如‘白蟾’在133 bp處、‘小白蟾’在229 bp處等。

表3 梔子栽培品種與近緣種ITS2 片段的變異位點(diǎn)Tab.3 Variable sites of ITS2 fragment of cultivars and their related wild species in the genus Gardenia

2.2 序列遺傳距離分析

采用MEGA7.0軟件，根據(jù)K2P 模型計(jì)算梔子栽培品種與近緣種樣品序列間的遺傳距離（表4），梔子18 個栽培品種和3個近緣種共38個樣品間K2P平均遺傳距離為0.005 5，大黃梔子和‘白蟾’間遺傳距離最大，為0.020 6；梔子、狹葉梔子和大黃梔子8個樣品間的平均遺傳距離為0.005 2，最大遺傳距離為0.017 6，其中梔子和大黃梔子間平均遺傳距離為0.015 6，狹葉梔子和大黃梔子間平均遺傳距離為0.016 1，梔子和狹葉梔子間平均遺傳距離為0.001 4；大黃梔子和梔子18 個栽培品種間遺傳距離介于0.014 6～0.020 6，平均遺傳距離為0.017 9，狹葉梔子、梔子和18 個栽培品種間遺傳距離介于0～0.008 7，平均遺傳距離為0.005 1；梔子18個栽培品種間遺傳距離介于0～0.008 7，平均遺傳距離為0.005 4，其中‘雀舌梔子’、‘銀邊雀舌’、‘分關(guān)1號’、‘眾恒’、‘舞凝’、‘金福水梔’、‘金元’等和‘白蟾’間遺傳距離較大。

表4 基于ITS2 序列的梔子栽培品種與近緣種的K2P 遺傳距離Tab.4 K2P genetic distance between of G.jasminoides cultivars and their related wild species based on ITS2 sequences

2.3 梔子栽培品種與近緣種系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建

用UPGMA 法基于ITS2 序列構(gòu)建梔子栽培品種與近緣種的系統(tǒng)聚類樹。如圖1所示，梔子屬喬木樹種大黃梔子單獨(dú)成一支，與梔子屬其它種以及梔子栽培品種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而狹葉梔子和野生梔子所有個體總體表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；分枝較密集、枝條近于平展的梔子品種‘眾恒’、‘舞凝’聚集在一起；花重瓣、花徑較大的‘荷花’、‘白蟾’聚集在一起，而花重瓣、花小、葉片狹小的‘雀舌梔子’、‘銀邊雀舌’聚集在一起，也有花重瓣、花徑相對較小的品種‘小白蟾’、‘燃葉’和花單瓣的‘水梔子’聚集在一起；‘分關(guān)1號’和果實(shí)個體較大的‘金元’、‘金福水梔’聚集在一起，大果品種‘寬棱水梔’、‘金福水梔’、‘大花梔子’也聚集在一起，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；狹葉梔子和梔子既有與果實(shí)較小的品種‘香雪’、‘白盞’聚集一起的個體，又有與果實(shí)較大的品種‘寬棱水梔’、‘金福水梔’、‘大花梔子’聚集在一起的個體；葉形相似的狹葉梔子和‘雀舌梔子’、‘銀邊雀舌’并沒聚集在一起，‘香雪’、‘白盞’、‘金花梔子’等非傳統(tǒng)梔子品種，出現(xiàn)時間相對較短，和野生梔子、狹葉梔子表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建梔子栽培品種與近緣種的UPGMA樹Fig.1 Construction of UPGMA tree of G.jasminoides cultivars and their related wild species based on ITS2 sequences

3 結(jié)論與討論

梔子成熟果實(shí)是傳統(tǒng)的中藥和色素原料，因野生資源無法滿足日益增長的市場需要，目前主要靠人工種植。果用梔子在長期人工種植過程中，形成了一些較為穩(wěn)定且有一定種植規(guī)模的品種類型，如廣西等地的長果型水梔子，浙江等地的果大棱寬型水梔子，果實(shí)相對野生梔子較大且產(chǎn)量高的福建省良種‘分關(guān)1號’[10]，這些品種在銷售市場上的價格有較大差距，因此，能準(zhǔn)確購買到自己選擇的目標(biāo)品種是種植梔子最為關(guān)鍵的一步，而梔子苗期通過葉片等營養(yǎng)器官性狀無法準(zhǔn)確可靠地鑒定梔子品種。由于DNA 條形碼技術(shù)不受檢材形態(tài)性狀限制，能在植物幼苗階段通過葉片樣品進(jìn)行有效的鑒定，伍美慧等[15]研究了引物序列matK、rbcL和psbA對梔子屬植物的鑒定效果，認(rèn)為matK是適合梔子屬植物鑒別的較好DNA 條形碼。而楊中揚(yáng)[19]研究認(rèn)為在以rbcL引物作為區(qū)分梔子品種的前提下，matK、ITS2、psbA-trnH可以依次將梔子的不同種質(zhì)逐漸細(xì)分下去。相對于其它種類的序列片段，且ITS2區(qū)段具有擴(kuò)增容易、通用性強(qiáng)和成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前普遍認(rèn)可的植物DNA 條形碼通用序列。黃易等[20]研究認(rèn)為ITS2序列較適用于梔子混偽品的物種鑒別。因此，在前人探索研究的基礎(chǔ)上，本研究選取了更多性狀穩(wěn)定的梔子品種和3個近緣種，其中大黃梔子是所有供試樣品中唯一的喬木樹種，且各部被毛。研究結(jié)果表明，3種梔子屬植物中，大黃梔子ITS2序列長度最長，為355 bp，而狹葉梔子、梔子和大部分梔子品種的序列長度均為347 bp，序列長度明顯長于黃易等[20]對梔子及其茜草科植物、混偽品種間序列長度為201～235 bp 的結(jié)果。梔子栽培品種間以及和近緣種間的平均GC 含量相差也不明顯，表現(xiàn)出較高的保守性，且均低于黃易等[20]梔子平均GC含量為74.1%的結(jié)果。同時發(fā)現(xiàn)一部分表型特征有共性的品種之間發(fā)現(xiàn)有共同的變異位點(diǎn)，如植株矮小、葉片小而窄長的品種‘雀舌梔子’、‘銀邊雀舌’在50 bp處，果實(shí)相對較大的品種‘分關(guān)1號’、‘金福水梔’、‘金元’在84 bp處等；一部分品種具有特異的變異位點(diǎn)，如‘白蟾’在133 bp處，‘小白蟾’在229 bp 處等，說明ITS2 序列用于鑒定梔子屬品種及近緣種達(dá)到了一定的預(yù)期效果，這些研究結(jié)果對梔子品種鑒定有較大的應(yīng)用價值。

在遺傳距離和親緣關(guān)系結(jié)論方面，楊中揚(yáng)[19]研究得出梔子種內(nèi)K2P距離介于0.000～0.011，種內(nèi)平均K2P 距離為0.002 5，黃易等[20]的研究結(jié)果是梔子種內(nèi)K2P 距離介于0.000～0.005，種內(nèi)平均K2P 距離為0.002，其中重慶梔子、四川巴中梔子、水梔子與其他梔子遺傳距離較近，K2P距離為0.005。本文研究得出梔子18個栽培品種和3個近緣種共38個樣品間K2P平均遺傳距離為0.005 5，其中梔子屬種間平均遺傳距離為0.005 2，梔子18個栽培品種間遺傳距離介于0.000 0～0.008 7，平均遺傳距離為0.005 4，與前人研究結(jié)論基本一致。另外，梔子屬種間遺傳距離普遍小于近緣種和品種間的遺傳距離，大于梔子栽培品種之間的遺傳距離，大黃梔子和‘白蟾’間遺傳距離最大。系統(tǒng)聚類顯示大黃梔子單獨(dú)成一支，與梔子屬其它種和梔子栽培品種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，狹葉梔子并沒有和葉型相近的‘雀舌梔子’、‘銀邊雀舌’聚集在一起，而和野生梔子表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；‘分關(guān)1號’和果實(shí)個體較大的‘金元’、‘金福水梔’聚集在一起，大果品種‘寬棱水梔’、‘金福水梔’、‘大花梔子’也聚集在一起，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；‘香雪’、‘白盞’、‘金花梔子’等非傳統(tǒng)梔子品種，出現(xiàn)時間相對較短，和野生梔子、狹葉梔子表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。部分聚類結(jié)果和以表型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的數(shù)量分類結(jié)果類似，但并沒有像數(shù)量分類結(jié)果那樣以花重瓣、大果、小果等性狀形成明顯的系統(tǒng)分枝[10]，研究結(jié)果對梔子品種起源、資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新等方面有重要的指導(dǎo)價值。