一株纖維素降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

鐘 斌，陶文玲，倪思毅，安雪姣，夏 祥，張慶華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】中國是一個(gè)傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，近年來，隨著農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模日發(fā)壯大，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也越來越集中，隨之帶來的大量農(nóng)業(yè)廢棄物無法得到有效的利用[1-2]。就作物秸稈而言，雖然目前已有秸稈還田的實(shí)例，但是依然有大量的秸稈被焚燒，嚴(yán)重威脅著大氣和土壤的生態(tài)健康。根據(jù)《第二次全國污染源普查公報(bào)》顯示[3]，僅2017 年，我國的秸稈產(chǎn)生量為8.05 億噸，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的污染已成為威脅農(nóng)村生態(tài)，乃至地球生態(tài)的一大隱患，解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)土壤、大氣、水體的污染問題迫在眉睫。厭氧消化是解決農(nóng)業(yè)廢棄物、市政生活垃圾等有機(jī)廢棄物的一大重要途徑[4]。但是，隨著我國沼氣工程的發(fā)展，每年產(chǎn)生的沼渣、沼液高達(dá)1.3 億噸，如何在連續(xù)運(yùn)行的沼氣工程中將沼渣進(jìn)行無害化處理，是制約沼氣工程可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】沼渣是厭氧消化的殘余物，其中含有豐富的有機(jī)質(zhì)，包括未能降解的木質(zhì)纖維素和豐富的氮、磷、鉀等礦質(zhì)元素，但由于其過高的含水率以及厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的毒害物質(zhì)，并不適合直接施用[7-8]。好氧堆肥是在有氧的條件下，通過微生物將廢棄物中的有機(jī)質(zhì)降解，使得堆體溫度升高，并殺滅其中的病原微生物，最后得到富含腐殖質(zhì)物質(zhì)[9-10]。然而，木質(zhì)纖維素是大量存在于沼渣中的一種極難被降解的物質(zhì)，在自然堆肥中，由于土著微生物種類和數(shù)量的不足，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素的降解不充分，使得自然堆肥存在許多問題，如堆肥時(shí)間長、腐熟不徹底、營養(yǎng)成分散失過多等。纖維素降解菌是一類能分泌木質(zhì)纖維素降解酶系的微生物，通常包括霉菌、芽孢桿菌等。大量的研究報(bào)道在堆肥內(nèi)添加纖維素降解菌能促進(jìn)堆肥快速腐熟，從而縮短堆肥所需的時(shí)間[11-12]。劉艷婷等[13]將黃孢原毛平革菌、黑曲霉和地衣芽孢桿菌聯(lián)合接種至豬糞堆肥中，發(fā)現(xiàn)添加外源菌劑后能顯著促進(jìn)堆肥的腐熟進(jìn)度、重金屬鈍化以及在氮素的保留方面有著較為顯著的效果。Choińska-Pulit等[14]的研究證實(shí)了接種物對(duì)堆肥中礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和堆肥的腐熟程度具有積極的作用。【本研究切入點(diǎn)】雖然對(duì)纖維素降解菌的分離篩選已有很多，但是應(yīng)用在堆肥上的纖維素降解菌仍然局限在已有的幾種霉菌和芽孢桿菌上[15-16]。并且由于堆肥原材料的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)的堆肥過程，其中的理化環(huán)境非常復(fù)雜。目前，關(guān)于沼渣堆肥中纖維素降解菌的分離和應(yīng)用鮮有報(bào)道，因此，有必要分離出能應(yīng)用于沼渣堆肥中的纖維素降解菌來提高沼渣中纖維質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以沼渣、稻草和豬糞為原料構(gòu)建了一個(gè)原始的沼渣堆肥，通過分離篩選自然堆肥中升溫期、高溫期以及腐熟期的纖維素降解菌，得到一株能夠適用于沼渣堆肥的高效纖維素降解菌，以期為沼氣工程中沼渣的堆肥化利用提供優(yōu)質(zhì)菌種資源，為沼氣工程的可持續(xù)發(fā)展奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采集自由沼渣、豬糞和稻草按1.5∶1∶1 比例構(gòu)建的自然堆肥，堆肥在一個(gè)自制的堆肥反應(yīng)器中進(jìn)行，外壁貼有泡沫保溫材料防止溫度散失，在自然堆肥的升溫期、高溫期和腐熟期采用五點(diǎn)采樣法分別采集5個(gè)點(diǎn)中深度為10～15 cm的樣品，混勻備用。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，121 ℃滅菌20 min；PCS富集培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 5，CaCO3，濾紙，秸稈，121 ℃滅菌20 min；纖維素-剛果紅培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 5，（NH4）2SO42，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，NaNO31，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，剛果紅0.2，瓊脂20（固體），121 ℃滅菌20 min；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨5，酵母膏1，CaCO35，秸稈10，121 ℃滅菌20 min。

1.3 堆肥中纖維素降解菌的篩選

1.3.1 初篩 稱取5 g樣品加入PCS富集培養(yǎng)基中，在180 r/min，35 ℃條件下震蕩培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)觀察到濾紙崩解時(shí)取5 mL培養(yǎng)液加入新鮮的PCS富集培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)5～7 d至濾紙崩解，反復(fù)3次，取10 mL 培養(yǎng)3 次后的培養(yǎng)液加入90 mL 無菌水中，并逐級(jí)稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL 稀釋液涂布至纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），根據(jù)D/d比值來初步判斷各微生物對(duì)纖維素的降解能力。

1.3.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株在LB 培養(yǎng)基上活化，挑取活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)1%的比例接入滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃，180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)12 h后接入體積分?jǐn)?shù)1%無菌的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在同樣的條件下培養(yǎng)7 d 后，取10 mL 發(fā)酵液，8 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清測定CMC 酶活和濾紙酶活，酶活的測定方案參考文獻(xiàn)方法[17]。取1 mL 適度稀釋后的粗酶液和1 mL 檸檬酸緩沖液（pH 6.0，0.1 mol/L）加入含有1 cm×6 cm 的濾紙條或含有10 g/L 的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）中，以檸檬酸緩沖液代替粗酶液作為對(duì)照，在55 ℃條件下反應(yīng)60 min 后，立即冷卻至室溫，加入2 mL DNS 試劑并沸水浴5 min，然后在540 nm 波長下測定吸光值，定義1 mL 粗酶液在1 min 內(nèi)催化底物生成1 μg葡萄糖為1 個(gè)酶活單位（U）。

1.3.3 秸稈降解率研究 將初篩得到的菌株經(jīng)LB 培養(yǎng)基活化后接種體積分?jǐn)?shù)2%至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)7 d，用濾紙過濾發(fā)酵液，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗至濾液變?yōu)闊o色，將洗凈的秸稈在105 ℃條件下烘干至恒重，計(jì)算秸稈失重率，每個(gè)處理各做3個(gè)重復(fù)。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 將復(fù)篩得到的菌株在LB 培養(yǎng)基上活化后，觀察菌落的隆起形狀、透明度、顏色、質(zhì)地、邊緣等，挑取少許單菌落經(jīng)革蘭氏染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取供試菌株DNA，利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：細(xì)菌基因組DNA 0.5 μL，攜有Mg2+的10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，然后加雙蒸水至25 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，總共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃下終止反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行比對(duì)，使用軟件MEGA 6中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法依次培養(yǎng)時(shí)間（1，2，3，4，5，6，7 d）、初始pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），培養(yǎng)溫度（30，35，40，45，50 ℃）和接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)菌株F3 產(chǎn)CMC 酶和濾紙酶的影響。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min 離心10 min 后取上清測定其中的CMC 酶活和濾紙酶活，并測定其中的稻草失重率，其中培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化不考察失重率。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化

在上述單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以CMC 酶活和濾紙酶活為優(yōu)化目標(biāo)進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化（表1），并使用理論最優(yōu)的培養(yǎng)條件進(jìn)行了3 次重復(fù)試驗(yàn)以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Tab.1 Box-Behnken experiment design factors and levels

1.7 分析方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用軟件SPSS 22 完成，顯著性分析的置信度為95%，數(shù)據(jù)處理、作圖使用軟件Origin 9。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼渣自然堆肥中纖維素降解菌的分離及篩選

將從自然堆肥中收集的樣品經(jīng)過PCS富集培養(yǎng)基富集后，取培養(yǎng)液稀釋涂布在纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上，共分離出7株具有降解纖維素能力的菌株，通過測量這些菌株在培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈大小及菌落大小，計(jì)算出各菌株的D/d值，發(fā)現(xiàn)7株纖維素降解菌中有2株菌的D/d值大于5。其中標(biāo)記為F3的菌株D/d、CMC酶活、濾紙酶活以及降解稻草的能力顯著高于其他菌株（P＞0.05），因此，后續(xù)使用該菌株對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 初篩得到的纖維素降解菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of cellulose degrading bacteria

2.2 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 如圖2 所示，菌株F3 在LB 培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，邊緣規(guī)則，不透明，菌落表面濕潤。革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀。

圖2 菌株F3菌落形態(tài)及革蘭氏染色（10×100）Fig.2 Colony morphology and gram stain of strain F3

表2 各菌株的D/d值、關(guān)鍵酶酶活及稻草失重率Tab.2 D/d，key enzyme activity and rice straw weight loss rate of each strain

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 16S測序結(jié)果表明，該菌株的16S rRNA 全長1 430 bp。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出（圖3），該菌株與Alcaligenes faecalisstrain 屬的細(xì)菌親緣關(guān)系最接近，在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，其序列同源性都在97%以上[18]，綜合該菌株的菌落形態(tài)、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，菌株F3被鑒定為Alcalig?enes faecalisstrain。

圖3 基于纖維素降解菌F3 16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on cellulose degrading bacteria F3 16S rRNA

2.3 菌株F3產(chǎn)酶能力及對(duì)稻草降解能力條件的初步優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株F3產(chǎn)酶的影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，微生物分泌的酶系會(huì)在發(fā)酵液中積累，在一定的時(shí)間內(nèi)，酶活力通常隨著時(shí)間的延長而上升，但是過長的培養(yǎng)時(shí)間會(huì)使已產(chǎn)生的酶活力下降[19]。通常，微生物對(duì)纖維素類物質(zhì)的降解能力通常用CMC 酶活和濾紙酶活（FPase）表示，菌株F3 在不同培養(yǎng)時(shí)間的產(chǎn)酶能力如圖4 所示，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為3 d 時(shí)，培養(yǎng)液中的濾紙酶活和CMC 酶活均顯著（P<0.05）高于其他時(shí)間點(diǎn)，分別為（1.34±0.07）U/mL 和（1.96±0.13）U/mL，這表明將F3 在產(chǎn)酶培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3 d后接種至沼渣堆肥中能夠更為迅速的分解其中的纖維類物質(zhì)進(jìn)而使堆肥的高溫期提前到來。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株F3產(chǎn)酶能力的影響Fig.4 Effect of different culture time on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.2 不同初始pH 對(duì)菌株F3 產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響 pH 通過影響微生物細(xì)胞膜表面電荷的性質(zhì)以及膜的通透性來影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取[20]，不同初始pH 對(duì)菌株F3 產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響如圖5 所示，當(dāng)初始pH 為7.0 時(shí)，菌株F3 培養(yǎng)3 d 后的CMC 酶活和濾紙酶活最高，分別為（2.16±0.06）U/mL 和（1.04±0.01）U/mL，并且此時(shí)對(duì)稻草的降解能力最強(qiáng)，稻草失重率達(dá)22.18%。另外，菌株F3 更偏向于在中性的環(huán)境中分泌降解纖維物質(zhì)的酶，但是，當(dāng)pH 上升至8.5 時(shí)，該菌株仍然具有較好的活性，在好氧堆肥中，由于氨的排放，堆體中常為弱堿性狀態(tài)，因此該菌在沼渣的好氧堆肥中具有較好的應(yīng)用前景。

圖5 不同初始pH條件對(duì)F3產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響Fig.5 Effect of different initial pH on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株F3 產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響 溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一，也是影響酶活力最重要的因素之一[21]。菌株F3 在不同溫度下培養(yǎng)的關(guān)鍵酶酶活和稻草的失重率如圖6 所示，隨著溫度的升高，F(xiàn)Pase、CMCase 和失重率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，三者的值達(dá)到最高，分別為（1.08±0.02）U/mL、（1.54±0.07）U/mL、23.35%。隨后過高的溫度抑制了微生物體內(nèi)某些活性成分能力，使得微生物產(chǎn)酶能力下降。另外，從圖中可知，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，該菌株仍然具有CMC 和濾紙酶活，并且稻草失重率為10.23%。上述結(jié)果表明該菌株具有較為廣泛的生長溫度，能夠適應(yīng)不同的環(huán)境溫度。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F3產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響Fig.6 Effect of different culture temperature on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.4 不同接種量對(duì)菌株F3 產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響 不同的接種量對(duì)發(fā)酵過程中酶活的影響是顯著的（圖7，P<0.05），低接種量可能會(huì)導(dǎo)致延滯期延長，過高的接種量也不會(huì)帶來更高的酶活，反而可能由于過多的菌量導(dǎo)致系統(tǒng)中溶氧不足，進(jìn)而降低產(chǎn)酶能力，此外過高的接種量也有可能引入更多的代謝廢物，也有可能對(duì)酶活力產(chǎn)生一定的抑制作用[22]。如圖7 所示，2%的接種量對(duì)F3 菌株的產(chǎn)酶是最好的，其FPase、CMCase 和稻草失重率分別為（2.23±0.05）U/mL、（2.55±0.08）U/mL 和24.25%。

圖7 不同接種量對(duì)F3產(chǎn)酶及稻草降解能力的影響Fig.7 Effect of different inoculum size on the enzyme production capacity of strain F3

表3 各因素水平的處理組合及響應(yīng)值Tab.3 Treatment combination and response value of each factor level

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶研究

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選用溫度（A）、pH（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）和接種量（D）作為變量，以濾紙酶活和CMC酶活作為優(yōu)化目標(biāo)，使用軟件Design Expert 8.0.5b對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行多元回歸擬合，得到CMC（U）=-110.07+1.18A+23.90B+2.63C+3.60D+0.02AB+0.01AC-0.07BC-0.22BD-0.08CD-0.02A2-1.68B2-0.40C2-0.44D2，模型F值為10.07，該擬合的模型達(dá)到極顯著水平（P<0.001），R2=0.9038，F(xiàn)PA（U）=-90.17+0.89A+20.41B+2.01C+2.10D+0.02AB+0.01AC-0.08BD-0.02CD-0.02A2-1.47B2-0.41C2-0.42D2，模型F值為12.67，該擬合的模型達(dá)到極顯著水平（P<0.001），R2=0.922 0。兩個(gè)響應(yīng)面模型的方差分析如表4 和表5 所示，CMC 模型中pH 和接種量的P值小于0.05，表示pH 和接種量顯著影響了CMC 酶的活性，在FPA 模型中，僅有接種量的P值小于0.05，表示接種量對(duì)濾紙酶活的影響是顯著的。

表4 CMC酶活響應(yīng)面模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance in response surface model of CMCase activity

表5 濾紙酶活響應(yīng)面模型的方差分析Tab.5 Analysis of variance in response surface model of FPase Activity

從圖8 中可以看出，溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和接種量均能對(duì)CMC 酶活和濾紙酶活產(chǎn)生交互作用，任一條件過高或過低都會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制，經(jīng)模型計(jì)算，當(dāng)溫度（A）、pH（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）和接種量（D）理論上分別取34.7 ℃、7.08、2.95 d 和2.17%時(shí)，能得到最高的CMC 酶活2.73 U/mL；另外，當(dāng)溫度（A）、pH（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）和接種量（D）理論上分別取34.56 ℃、7.07、2.94 d 和2.15%時(shí)，能得到最高的濾紙酶活2.34 U/mL。由于理論上得到最高的CMC 酶活和濾紙酶活的條件非常接近但是不一致，因此，分別取溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和接種量為35 ℃、7.0、3 d 和2%時(shí)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到CMC 酶活和濾紙酶活分別為2.63 U/mL 和2.23 U/mL，與模型預(yù)測的峰值差距小于5%。上述結(jié)果表明，這兩個(gè)模型可較好地對(duì)纖維素降解菌F3 的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖8 CMC酶活（A）和FPA酶活的響應(yīng)面圖（B）Fig.8 Response surface diagram of CMC enzyme activity（A）and FPA enzyme activity（B）

3 討論

好氧堆肥因其在發(fā)酵過程中能形成高溫的環(huán)境，有利于沼渣中木質(zhì)纖維素的降解，但是由于堆肥中的土著微生物數(shù)量少，導(dǎo)致自然堆肥效率不高。目前，國內(nèi)外普遍認(rèn)為，在堆肥中加入外源微生物菌劑，是促進(jìn)堆肥快速、高效、完全腐熟的方式之一。然而，由于各種材料的堆肥底物不一，導(dǎo)致針對(duì)某種底物的堆肥微生物較少，因此雖已有眾多學(xué)者對(duì)堆肥菌劑進(jìn)行研究，但各種材料的堆肥微生物菌劑數(shù)量仍較為匱乏。目前，大多數(shù)對(duì)堆肥菌劑的研制都著眼于霉菌，鮮有對(duì)細(xì)菌菌劑的開發(fā)。

景如賢等[23]從土壤中分離出一株芽孢桿菌，經(jīng)單因素優(yōu)化后，當(dāng)培養(yǎng)條件溫度為37 ℃，初始pH 為7，接種量為3%及搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min 時(shí)，該菌株的CMC 酶活為1.465 2 U/mL。諸葛容夏[24]從紙機(jī)的腐漿中分離出一株動(dòng)性微菌屬Planomicrobiumsp.WH2-56，在37 ℃條件下以微晶纖維素和秸稈作為底物時(shí)，該菌株具有最大的FPA 酶活和CMC 酶活，分別達(dá)到0.35 U/mL 和0.62 U/mL。作為堆肥接種劑，通常要在堆肥的起始階段，即在室溫下就能降解堆肥底物，從而起到促進(jìn)堆肥升溫、加速堆肥腐熟的作用。產(chǎn)堿桿菌作為一種廢棄物處理常用的微生物，其安全性已得到驗(yàn)證，是一種安全的微生物肥料生產(chǎn)菌[25]。陳晨[26]分離出一株能降解秸稈的產(chǎn)堿桿菌，其CMC 酶活最高，基本穩(wěn)定在0.022 U。杜冰等[27]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了菌株Alcaligenes faecalisDL-08 的纖維素酶活力，結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基對(duì)該菌株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，能提高該菌株5.6%的纖維素酶活力。本研究通過收集沼渣自然堆肥過程中不同時(shí)間的樣品，采用梯度稀釋法分離出一株高效的纖維素降解細(xì)菌，鑒定結(jié)果表明該菌為產(chǎn)堿桿菌，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化后，在溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和接種量分別為35 ℃、7.0、3 d 和2%時(shí)，能夠得到最高的CMC 酶活2.63 U/mL 和濾紙酶活2.23 U/mL，具有開發(fā)成沼渣高效堆肥專用菌劑的潛力。