祛瘀護(hù)膜劑調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號通路對反流性食管炎模型大鼠食管黏膜修復(fù)的影響

黃 雪，楊 欣，梁國強(qiáng)，徐心怡，朱惠萍，孫宏文

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；3. 蘇州科技城醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；4. 蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009)

反流性食管炎屬于胃食管反流病的范疇，以胸骨后或劍突下灼熱感、反流為主要癥狀，部分患者可兼見咽痛、咳嗽、哮喘等食管外癥狀,常見并發(fā)癥為上消化道出血、食管狹窄、Barrett食管。近年來該病在全球的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，具有病情纏綿、易反復(fù)、不易治愈的特點，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前普遍認(rèn)為反流性食管炎發(fā)病機(jī)制是胃、十二指腸抗反流防御機(jī)制失衡，導(dǎo)致食管黏膜屏障功能障礙，無法抵抗來自胃十二指腸反流物的刺激，最終產(chǎn)生食管黏膜炎癥性損傷而致。目前治療本病多應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑(PPI制劑)、H2受體阻滯劑、胃黏膜保護(hù)劑等藥物，部分患者經(jīng)PPI治療后短期內(nèi)可有效緩解，但停藥后易復(fù)發(fā)，產(chǎn)生PPI依賴性；胃黏膜保護(hù)劑多為鋁制劑，主要作用是中和胃酸，無直接的黏膜修復(fù)作用，且容易帶來電解質(zhì)紊亂、便秘、腹瀉等不良反應(yīng)[3]。因此，目前西藥治療反流性食管炎存在停藥后容易復(fù)發(fā)、并發(fā)癥多等缺點，很難從根本上解決問題。國醫(yī)大師徐景藩教授臨床采用三七白芨糊劑治療反流性食管炎取得了不錯的成效[4]，但其具體作用機(jī)制還不清楚。本實驗基于轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路探討了祛瘀護(hù)膜劑改善食管上皮炎癥性損傷、修復(fù)食管黏膜的相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 60只SPF級雄性成年大鼠，體重(200±20)g，由蘇州希諾賽生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2018-0006，飼養(yǎng)于蘇州市中醫(yī)醫(yī)院研究所動物實驗室，12 h光照/黑暗循環(huán)，室溫控制在20～24 ℃，相對濕度45%～70%，分籠、自由飲用水飼養(yǎng)。

1.2藥物與試劑 祛瘀護(hù)膜劑由三七粉、白芨粉、藕粉組成， 三七粉產(chǎn)地：云南，生產(chǎn)批號：190918，生產(chǎn)許可證號：蘇20160233；白芨粉產(chǎn)地：貴州，生產(chǎn)批號：190907，生產(chǎn)許可證號：蘇20160233；周氏藕粉，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)代號：GB19640，食品生產(chǎn)許可證號：SC12645033100148；安達(dá)(鋁鎂加混懸液)，國藥準(zhǔn)字H10980322，產(chǎn)品批號：B190928。 TGF-β1ELISA試劑盒，上海邦奕生物，貨號：BYE20746，批號：202011。

1.3儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀：瑞士帝肯Tecan，型號：Infinite F50；洗板機(jī)：深圳雷杜，型號：RT-3500；離心機(jī)：賽默飛，型號：Sorvall ST 40；電泳儀：BIO-RAD 公司，型號：mini protean 3 cell；電轉(zhuǎn)儀：HOEFER，型號：TE77XP；酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃，型號：MK3；移液器：吉爾森P型；水浴鍋：Leica HI1210；成像系統(tǒng)：Tanon Tanon-5200。

1.4實驗方法 隨機(jī)取10只大鼠作為正常組，其余50只參照文獻(xiàn)[5]方法使用“4.2 mm幽門夾+2/3胃底結(jié)扎術(shù)”建立反流性食管炎大鼠模型，術(shù)后予以自由飲用5%葡萄糖溶液，并禁食24 h后恢復(fù)常規(guī)飲食。術(shù)后每日向腹腔內(nèi)注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg以預(yù)防感染，共給藥3 d。造模7 d后將大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、祛瘀護(hù)膜劑低劑量組、祛瘀護(hù)膜劑中劑量組、祛瘀護(hù)膜劑高劑量組，每組10只。按照成人與大鼠體表面積換算，祛瘀護(hù)膜劑低、中、高劑量組分別給予0.054 g/100 g、0.162 g/100 g、0.486 g/100 g祛瘀護(hù)膜劑灌胃，西藥組予鋁鎂加混懸液13.5 mg/100 g灌胃，正常組及模型組均予蒸餾水+淀粉灌胃，各組灌胃體積均為1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠一般情況 監(jiān)測實驗過程中大鼠活動、飲食、排便、體重及死亡情況。

1.5.2食管形態(tài)學(xué)變化 灌胃14 d后禁食不禁水,于次日用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈采血后處死，取4～8 cm食管組織，并沿食管縱軸切開，肉眼觀察食管黏膜組織形態(tài)變化，然后將食管組織用蒸餾水沖洗干凈，將1份迅速投入10%福爾馬林溶液固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制備病理切片，HE染色后在光鏡下觀察。

1.5.3血清中TGF-β1水平 腹主動脈取血3 mL，2 500 r/min離心10 min后取血清分裝，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明測定血清TGF-β1水平。

1.5.4食管黏膜組織中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：從-80 ℃冰箱中取出保存的食管組織，冰上將食管組織剪成細(xì)小的碎片，利用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，制備下層分離膠和上層濃縮膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入適量稀釋后一抗p38MAPK(1∶1 000)和TGF-β1(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)，與膜37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光檢測，將其放入成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描，以GAPDH為內(nèi)參，使用軟件Image J分析各條帶的灰度值，并計算各條帶蛋白與GAPDH的灰度比值，重復(fù)進(jìn)行3次。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神情況、活動情況、進(jìn)食量及排便情況均正常。模型組大鼠進(jìn)食量減少，性情抑郁，少動，排便量減少，灌胃第6天由于灌胃操作不慎死亡1只；祛瘀護(hù)膜劑高劑量組大鼠灌胃第10天由于灌胃操作不慎死亡1只，其余給藥大鼠灌胃第14天進(jìn)食情況、行為狀態(tài)均明顯好于模型組大鼠，體重高于模型組。

2.2各組大鼠食管形態(tài)學(xué)變化 HE染色觀察：正常組大鼠食管黏膜未見明顯炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠食管黏膜可見鱗狀上皮萎縮，局部呈乳頭狀增生，上皮細(xì)胞層內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜糜爛；西藥組可見黏膜下層局部血管擴(kuò)張充血，黏膜層內(nèi)部分炎癥浸潤；祛瘀護(hù)膜劑低劑量組可見炎癥細(xì)胞輕度破壞黏膜上皮，部分肌層厚度增加；祛瘀護(hù)膜劑中劑量組可見炎癥細(xì)胞部分破壞黏膜上皮，黏膜下局部水腫；祛瘀護(hù)膜劑高劑量組黏膜下炎癥細(xì)胞消散，黏膜上皮恢復(fù)。見圖1。

圖1 空白組和反流性食管炎各組大鼠食管組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠血清TGF-β1水平 模型組大鼠血清TGF-β1水平明顯高于正常組(P<0.05)，祛瘀護(hù)膜劑各組和西藥組血清TGF-β1水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組均明顯低于西藥組和祛瘀護(hù)膜劑低劑量組(P均<0.05)，祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組和反流性食管炎各組大鼠血清TGF-β1水平

2.4各組大鼠食管組織中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠食管組織中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)。祛瘀護(hù)膜劑各組和西藥組食管組織中p38MAPK蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組均明顯低于西藥組和祛瘀護(hù)膜劑低劑量組(P均<0.05)，西藥組明顯低于祛瘀護(hù)膜劑低劑量組(P<0.05)，祛瘀護(hù)膜劑高劑量組明顯低于祛瘀護(hù)膜劑中劑量組(P<0.05)。祛瘀護(hù)膜劑各組和西藥組食管組織中TGF-β1蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且祛瘀護(hù)膜劑各組均明顯高于西藥組(P均<0.05)；祛瘀護(hù)膜劑低、中、高劑量組依次增高，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 正常組和反流性食管炎各組大鼠食管組織中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

反流性食管炎是消化系統(tǒng)的常見疾病，食管黏膜的炎癥不僅會導(dǎo)致食管動力障礙，還參與了食管纖維化的形成，可加重患者的病情，導(dǎo)致反復(fù)不愈，癥狀的不適感、逐年升高的患病率以及復(fù)發(fā)率給患者的生活和工作帶來了極大的影響，嚴(yán)重影響患者的身心健康。

中醫(yī)沒有反流性食管炎的病名，根據(jù)其癥狀和病位可歸屬于“反胃”“吐酸”“嘈雜”“胸痹”“食管癉”等范疇。本病病機(jī)總屬胃失和降、氣機(jī)失調(diào)，病位在食管，與脾胃肝膽相關(guān)。由于病情纏綿難愈，病程長，當(dāng)代吳門醫(yī)家認(rèn)為本病存在著血瘀的病理特點，符合“久病入絡(luò)”的病機(jī)特點。吳門名醫(yī)徐景藩教授在臨證治療反流性食管炎時擅用三七粉、白芨粉與適量藕粉調(diào)成糊劑，令患者睡前臥位服用，以此“祛瘀護(hù)膜”法從整體上顧護(hù)食管黏膜[4]。其中三七散瘀止血、消腫定痛，白芨收斂止血、消腫生肌。現(xiàn)代藥理研究證實三七中主要成分三七總皂苷可改善氧化應(yīng)激失衡，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集等作用[6]。白芨中主要成分白芨多糖可促進(jìn)潰瘍愈合，可通過調(diào)控MAPK/NF-κB信號通路、JNK及p38MAPK通路等途徑來抑制潰瘍表面炎癥因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)胃黏膜[7]。藕粉作為賦形劑，也有清熱涼血、補(bǔ)血止血之功。

TGF-β1/p38MAPK信號通路與細(xì)胞炎癥及纖維化過程關(guān)系密切[8]。p38MAPK 是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)家族成員，是促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子合成分泌的重要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞的生長、增殖與炎癥過程[9-10]。目前研究證實，p38MAPK在胃食管反流病組織中高表達(dá)[11]。TGF-β1是細(xì)胞損傷后促進(jìn)黏膜修復(fù)的啟動和終止因子，可使成纖維細(xì)胞大量聚集，合成細(xì)胞外基質(zhì)，抑制細(xì)胞基質(zhì)的蛋白酶降解，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織形成[12-13]。TGF-β1與p38MAPK之間可以相互調(diào)節(jié)，當(dāng)TGF-β1作為上游的啟動信號時，其可以促進(jìn)p38MAPK磷酸化以及p38MAPK信號傳導(dǎo)，抑制蛋白磷酸化[14]；當(dāng)TGF-β1作為p38MAPK的下游信號產(chǎn)物時，p38MAPK信號通路的激活一方面會導(dǎo)致細(xì)胞炎癥性損傷[10]，另一方面TGF-β1隨之被激活趨化成纖維細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)肉芽組織形成，加速黏膜修復(fù)[15]，同時TGF-β1的過度激活會增加膠原蛋白，致使細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積，最終導(dǎo)致細(xì)胞纖維化[16-17]。因此認(rèn)為黏膜修復(fù)與纖維化在創(chuàng)傷修復(fù)中是同步存在的。

本實驗采用“4.2 mm幽門夾+2/3胃底結(jié)扎術(shù)”法建立反流性食管炎大鼠模型，與食管灌注法造模[18]相比更貼近于人體反流性食管炎形成的病理過程，實驗結(jié)果對臨床更有指導(dǎo)意義。結(jié)果顯示，模型組大鼠食管黏膜糜爛，上皮細(xì)胞層內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，血清TGF-β1水平及食管組織中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)量較正常組明顯增高，可見造模后大鼠食管黏膜組織中的p38MAPK信號通路激活，造成黏膜炎性損傷；祛瘀護(hù)膜劑各組食管黏膜損傷明顯減輕，血清TGF-β1水平及食管組織中p38MAPK蛋白表達(dá)量均明顯降低，且祛瘀護(hù)膜劑中、高劑量組均明顯低于西藥組和祛瘀護(hù)膜劑低劑量組，表明祛瘀護(hù)膜劑可以抑制p38MAPK信號通路的過度激活，減輕炎癥性損傷，促進(jìn)黏膜修復(fù)。祛瘀護(hù)膜劑各組食管組織中TGF-β1蛋白表達(dá)量并未回落，而是隨祛瘀護(hù)膜劑劑量的增高呈上升的態(tài)勢，結(jié)合張福鵬等[19]研究結(jié)論(放射性食管炎模型大鼠食管組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白表達(dá)量先上升后下降)，猜測這可能是因為食管組織中TGF-β1峰值的到來較血清中TGF-β1有所延遲，當(dāng)食管黏膜上皮炎癥性損傷完成修復(fù)后，血清中TGF-β1快速回落，而食管組織中的TGF-β1蛋白表達(dá)量可能還處在上升階段或峰值狀態(tài)。

綜上所述，祛瘀護(hù)膜劑可能通過抑制TGF-β1/p38MAPK信號通路的過度激活、調(diào)控TGF-β1的表達(dá)而促進(jìn)大鼠反流性食管炎的黏膜愈合，但大鼠食管組織中TGF-β1蛋白表達(dá)量何時會到達(dá)峰值、何時會完成修復(fù)后回落，還有待進(jìn)一步研究探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。